TGF的数学模型-β信号：反馈耦合与信号切换一致

摘要

背景

转化生长因子β（转化生长因子-β)信号调节胚胎发育和成人组织内稳态。结合其他致癌变化，TGF的长期扰动-β信号传导与肿瘤转移有关。尽管TGF-β信号传导可能很复杂，许多信号传导成分都有很好的定义，因此可以开发转化生长因子的数学模型-β使用缩减和缩放方法发送信号。TGF的参数化-β信令模型与实验数据一致。

结果

我们开发了TGF的数学模型-β信号通路，即TGF的RF模型-β信令，使用“快速平衡假设”减少TGF网络-β基于单个反应的时间尺度的信号反应。通过在TGF固有时滞负反馈的基础上增加时滞正反馈-β发出信号。我们能够模拟观察到的长期（>3小时）TGF浓度依赖性的S形、开关样行为-β刺激。计算机模拟揭示了正负反馈回路耦合在TGF调节中的重要作用-β信号系统。引入负反馈回路的时滞提高了模型的准确性、稳定性和鲁棒性。该模型再现了不同TGF下细胞内信号通路的短期和长期转换反应-β浓度。我们根据MEF（小鼠胚胎成纤维细胞）WT、SV40-永生化MEF和Gp130的实验数据对模型进行了测试^F类/F类MEF公司。RF模型的预测与实验数据一致。

结论

需要信号反馈回路来建模TGF-β信号转导及其对正常细胞和癌细胞的影响。我们重点研究了时滞反馈回路的影响及其与配体刺激的耦合。使用标准方法和快速平衡假设简化模型并将其简化为关键组件。我们检测到短期和长期信号转换的差异。RF模型的结果与实验数据比较良好，并预测了TGF的动力学-β具有不同突变的癌细胞中的信号。

背景

TGF公司-β是转化生长因子超家族的成员，该家族还包括其他生长因子，如骨形态发生蛋白、苗勒氏抑制物质、激活素、抑制素和结节[1–三]. 每个家族成员都控制着广泛的细胞过程，如分化、增殖、迁移、寿命和凋亡[1,4]. TGF公司-β以非活性形式分泌，并被隔离在细胞外基质中，但一旦被丝氨酸和金属蛋白酶激活[5]TGF公司-β释放并结合到细胞表面形成TGF-β受体复合物。活性配体：受体复合物随后启动细胞内信号传导，导致SMAD激活（磷酸化）和核质穿梭，最终导致细胞核中的基因反应[6,7].

最近的研究表明TGF-β浓度、刺激时间、细胞类型甚至细胞内活性信号成分的百分比都会影响基因反应，从而使TGF具有多功能性-β信号[2,8]. 这在结肠癌中尤为重要，因为SMAD信号是控制正常上皮细胞向癌细胞转变的关键途径[三,8–11]. 尽管对TGF进行了大量研究-β信号通路，关于TGF的影响还有许多问题没有解决-β癌细胞进展不同阶段的信号转导[12]. 特别是，癌细胞对TGF有两种相反的反应-βTGF抑制早期癌细胞的增殖-β[13]然而，在恶性肿瘤的晚期，这种细胞因子会刺激癌细胞的增殖[14].

尽管许多TGF-β信号成分是几十年前发现的[15]TGF数小时内发生的信号成分的定量、动态和位置-β刺激[16–22]更难理解。因此，TGF的数学模型-β信号已开发[2,16–21,23,24]. 在转化生长因子的综合模型中-βZi等人[22]目的解释TGF的高协同性和不连续细胞反应-β在配体耗尽引起的开关样行为方面。然而，这些模型不包括已知的调节转化生长因子的反馈机制-β系统，特别是通过转化生长因子的关键抑制剂SMAD7进行反馈-β信号转导[25]. 此外，SMAD7是调节TGF之间串扰的重要组件-β信号转导和其他细胞因子信号途径，如IL-6或IL-11[10].

Zi模型[22]也缺乏TGF中最近发现的正反馈回路-β通过microRNA miR-433抑制Azin1发挥作用的信号[26]. 叠氮1促进多胺合成[26,27]，抑制TGF-β信号[26,28–30]. Azin1抑制抗酶，从而阻止鸟氨酸脱羧酶（ODC）的降解[26,27]. ODC对多胺的生物合成至关重要[26,27]（参见图。1). 有趣的是，过表达Azin1抑制TGF的表达-β及其1型受体[26]. miR-433:Azin1:抗酶：ODC反应似乎诱导了TGF的正反馈-β信号[26].

图1

完整的TGF-β信号生物模型。受体的潜在磷酸化位点用连接在R1和R2组分上的空圆圈来指定。指向6个蓝色圆点的箭头表示退化过程。星号表示膜和细胞质中特定蛋白质的生产过程。源自SMAD7/Smurf的红色实心箭头对膜的受体组件施加负反馈和/或正反馈。用小写字母书写的椭圆形组件代表micro-RNA。在这个图中，S公司代表SMAD蛋白质。注意，从ODC到多胺的箭头显示的是刺激反应，而不是转化

即使在没有配体耗尽的情况下，这些反馈回路也可能产生协同性和开关样行为[31–35]. 由于反应的时间尺度延长，反馈回路的建模需要引入时滞。这通常存在于涉及基因调节、蛋白质合成和亚细胞间信号成分穿梭的细胞信号系统中[31–33].

作为提高我们对TGF理解的序幕-β信号系统我们开发了一个新的数学模型，其中包括通过SMAD信号的负反馈控制、通过Azin1的正反馈以及特定反应的适当延迟[25,36]. 我们通过合并TGF中涉及的所有反应开始建模过程-βSMAD信号，包括反馈回路和延时。然后，我们使用快速平衡假设生成一个更简单的系统，该系统更易于进行稳健的数学分析和数值模拟（“TGF数学模型”一节-β附加文件中的信号1”) [37]. 还原方法应用于TGF-β信号系统分为两步，形成半简化模式和射频模型。RF模型允许我们描述系统在稳态和瞬态动力学期间对TGF的响应-β信号。应注意TGF的激活-β受体也刺激MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）[38–41]和第38页[40–42]系统，这将影响晚期癌细胞的反应。将所提出模型的预测与公布的实验数据进行了比较[22]以及我们实验室的新实验数据。

TGF的开发-β信令模型

TGF公司-β受体复合物是由1型和2型受体组成的四聚体-β结合，通过自身磷酸化被激活[1,43,44]（图。1). 活化的转化生长因子-β然后受体复合物被内化[45,46]磷酸化并激活SMAD2/3[44]. 活化的SMAD2/3随后形成同源三聚体，与SMAD4同源三聚物结合。异三聚体（六聚体）被导入细胞核[47]. 磷酸化的SMAD2/3:SMAD4复合物作为转录因子发挥作用，上调许多靶基因，包括Jun、Fos、SNAIL1和SMAD7；最后一个靶基因SMAD7是已知的TGF抑制剂-β1型受体和TGF-β受体信号[25,47,48]. 图中总结了该信号系统的详细反应。1.

TGF等信号系统-β可以使用描述各种细胞成分（例如TGF）浓度变化的常微分方程来模拟途径-β受体，SMAD4）随时间变化[49]. TGF公司-β受体激活始于两种成分（TGF）的二聚化-β受体类型1和2，分别称为R1和R2）。二聚体对信号传递过程至关重要[50,51]. R2二聚体与R1二聚体结合，形成受体复合物RC。RC复合物结合TGF-βTGF周围介质中存在二聚体-β：RC复合物（LC）包含信号传递所必需的所有成分，但R1尚未被激活（磷酸化），即LC不是外源性TGF的膜传感器-β信号。信号传递需要R2对R1进行配体刺激磷酸化，以产生磷酸化的配体受体复合物（图中的PC）。1). PC是一种由配体结合（TGF）引起的中间成分-β)R1单体。由于LC是PC并通过PC降解，因此无需对LC进行降解反应。

SMAD2/3磷酸化后，SMAD齐聚形成（PSMAD2/3）_三：（SMAD4）_三复杂[52]. （PSMAD2/3）_三：（SMAD4）_三转位到细胞核，刺激SMAD7基因和miR-433 microRNA的表达[26,53]. SMAD7 mRNA被翻译，最终SMAD7/SMURF复合物加速R1相关膜成分的降解[54,55]. 尽管报道膜上1型和2型受体的受体二聚体以不同的顺序出现[56–59]，受体二聚反应的短时间尺度意味着二聚顺序不会改变TGF的稳态受体输出-β：转化生长因子-βR信号系统。

在考虑信号通路模型的开发时，重要的是要考虑与信号的动态、激活、传输、维护或阻尼相关的所有过程。一些信号传递过程被迅速触发，并在几分钟内达到新的稳态。其他过程需要数小时甚至数天才能达到新的稳定状态。在我们的建模过程中，我们定义了尽可能多的过程（以生成详细的模型），然后研究了不同过程（反应）对5分钟（“短期”）到3小时（“长期”）之间特定成分调节的贡献。当特定反应迅速达到平衡时，我们引入了几个“快速”反应，其中只有“快速”的反应产物的最终浓度作为物质的函数出现在“缓慢”方程中（快速平衡假设）。注意：快速平衡假设是准稳态近似（QSSA）的一种特殊形式，通常用于时间尺度分离（参见[60]查看）。为了补偿“快速”反应的消除，在RF模型中使用了时滞。时间延迟将在下一节中进行更详细的解释。我们用减少的方程数（减少的模型）测试了模型的有效性，以模拟短时间（<3小时）和长时间（>6小时）下SMAD2和磷-SMAD2的预期浓度。SMAD3在调节SMAD7中起着关键作用[61,62]和miR-433[26]并刺激消极和积极的反馈回路。然而，由于细胞内SMAD2和SMAD3的动力学相似，因此合理地使用磷酸-SMAD2的测量值作为TGF的输出-β信号系统。

TGF的半简化模型-β信号

为了减少TGF中涉及的细胞内反应的数量-β信号传递，我们重点关注受体组分，然后是关键受体组分与膜上SMAD的直接相互作用。我们考虑了TGF的还原过程-β信号系统分为两个步骤：第一步是开发半简化模型，第二步是将其进一步简化为RF模型。TGF的半简化模型-β信号如图所示。2.

图2

半还原TGF-β信号转导反应。来自磷酸化SMAD三聚体的红色虚线间接调节受体水平。磷酸-SMAD2/3三聚到SMAD7转录和翻译的所有反应都被还原为红色虚线（见图。1以供澄清）。红色虚线的虚线端表明，包含的反应可能会抑制和刺激其靶向反应（表现出负反馈和正反馈效应）。在该图中，S专门用于SMAD2/3

我们将SMAD信号相互作用（例如激活的SMAD复合体的核质穿梭以及反馈相关蛋白的转录和翻译，如SMAD7和miR-433）减少为一个由PSMAD三聚体水平调节的单一配体依赖性反馈环，（S）_三对于SMAD转录激活，中间步骤S_n个，以模拟磷酸化SMAD的核积累。这些步骤简化了初始建模方程，并包括负反馈回路和正反馈回路。TGF的两个反馈回路-β信号传递都是连续耦合反应序列的结果（见图。1). 每个细胞内过程都发生在特定的位置、特定的时间间隔和特定的动力学速率。为了模拟与反馈回路相关的所有细胞质和核反应，需要在TGF模型中加入显著的时滞-β发出信号。

在从全套反应进行编程时（图。1)半简化模型（图。2)有几个假设是必要的。成分S主要用于表示SMAD蛋白质的初始状态。由于SMAD2和3遵循相似的动力学，我们指定单个组分S来代表这两种蛋白质。\（{\hat{\text{S}}\）取代细胞质中所有磷酸化的SMAD2/3，而核PSMAD3用S表示_n个.SMAD4是参与TGF的通用指示器SMAD-β通过与PSMAD2/3相互作用发出信号。因此，可以将SMAD4的作用纳入\（{\hat{\text{S}}\）总计（PSMAD2/3）_三（SMAD4）_三浓度用（S）表示_三在图中。2通过SMAD7（S）的负反馈级联₇)由转录SMAD复合体（S_n个)并用（S）表示_三组件。然而，（S）_三在负反馈方程中表示为二聚体，以模拟SMAD7:SMURF相互作用。

正反馈回路是由核引发的一系列生化反应引起的（PSMAD2/3）_三（SMAD4）_三[52]. 这些Azin1：抗酶：ODC：多胺相关反应通过单个中间抑制剂P表示。三正反馈环和负反馈环都用miR-433和S中出现的点终止的实线表示₇.

图3

TGF公司-β受体信号系统。一半简化模型示意图-β信号转导。TGF和\（{\hat{\text{S}}\）+3（S）_三表示模型的输入和输出。b条TGF的简化模型-β信号转导。TGF公司-β和\（\hat{\text{S}}+\text{宋体}_{\text{n}}+3\text{（S）}_{\text}}\）表示模型的输入和输出。正反馈回路和负反馈回路都由（S）中出现的点式实线表示_三.τ _P（P） 和τ _N个 分别表示正反馈回路和负反馈回路中的延时

根据图所示的半简化模型。2，受体相关反应可表示为：

(1)

哪里∗表示特定蛋白质的生产过程，：：表示蛋白质体降解过程。描述与半还原TGF相关的所有反应的相应延迟微分方程-β信号转导是（图。2):

$$｛\boot｛aligned｝\frac｛\text｛d[R1]｝｝｛\text{d} t吨}&={v_{1}}-{k_{1{}}[\text{R1}]-{k_1}^{text{f-}}[\text{N}]^{2}\frac{[\text}]}{[\text{R1}]+{k}}-\\&\quad 2{k_1{1}^{+}}[\t text{R1}][\t text}]+{k{1}文本{R1}）{{2}]-{k{1}^{text{f+}}[\text{P}]\frac{[\text}R1}]}{[\text{R1}]+{k}}\\frac{\text{d}[\text}]}{dt}}&={v{2}}-{k}2}}[\text{R2}]-2{k{2}^{+}}[\text{R2}][\text}]+2{k{2}^{-}}[（\text{R2}）{2}]\\frac{\text{d}[（text{R1}）}{dt}}&={k{1}^{+}}[\text[R1}]k_{text{RC}}^{+}}[（\text{R1}）_{2}][（\text{R2}）_2}]\\&\quad+{k_{text{RC}{^{-}}[\text{RC}]\\frac{text{d}[（\text{R2{）_2{2]}{text{dt}}&={k_2}^{2}{+}{}[\text{R2}][\text{R2}]-{k{2}^{-}}[（\text{R2}）{2}]-{k{\text{RC}^{+}}[}&={k_{text{RC}}^{+}}[（\text{R1}）{2}][（\text{R2}）_{2}]-{k_}\text{RC}^{-}}[\text{RC}]\\&\quad-{k{text{LC}}^}+}[\text{RC}][{转化生长因子}-\测试版）{2}]+{k{text{LC}}^{-}}[\text{LC}]-{k{\text{RC}}[\text{RC}]\\&\quad-{k{text{RC}{^{text{f-}}[\t文本{N}]^{2}\frac{[\text}]}[\text{RC}]+{k}}\\frac{text{d}[\ttext{LC}]}{\text{dt}}&={k_{text{LC}}^{+}}[\text{RC}][（\text{转化生长因子}-\测试版）{2}]-{k{text{LC}}^{-}}[\text{LC}]-}k{\text{PC}}^}+}}[\t文本{LC}]\\&\quad+{k{\text{PC}}^{-}}[\text{PC}]\\frac{\text}d}[\text{PC}]}{\text}[\text{LC}]-{k{text{PC}}^{-}}[\text}PC}]-}k{text}PC}}[\text{PC{]\\&\quad-{k{\text{PC}{^{text{f-}}[\t文本{N}]^{2}\frac{[\text[PC}]}{[\text{PC}]+{k}}\frac{\text{d}[\text{S}]}{\text{dt}}&={v_{text{S}}}-{k_{\text}S}}[\text{S}]-{k_ ^{-}}[{\hat{\text{S}}]\\frac{\text}d}[{\\hat{text{S}]}{\text{dt}}&={k_{\text[S}}^{+}}[\text{PC}]\frac{[\text}S}]{[\text{S}]+{k_{text{S}}}-{k_}}[{\hat{\text{S}}]-{k{\hat{\text}}[{\hart{\text{S}{}]\\&\quad-{k{n}^{+}}[}]+{k{n}^{-}}[\text{宋体}_｛\text｛n｝｝]\\\frac｛\text｛d｝[\text{宋体}_{text{n}}]}{text{dt}}&={k{n}^{+}}[{hat{text{S}}]-{k{n}^{-}}[\text{宋体}_{\text{n}}]-3{k{3}^{+}}[\text{宋体}_{\text{n}}]^{3}+3{k{3}^{-}}[（\text{S}）{3}]\\frac{\text}d}[（\t ext{S{）{3}]}{text{dt}}&={k{3}^{+}}[\text{宋体}_{\text{n}}]^{3}-{k{3}^{-}}[（\text{S}）{3}]-{k}3}[（\t ext{S{）{3}]\结束{对齐}}}$$

(2)

其中[P]=K（K） _我 ²/(K（K） _我 ²+[（S）_三(t吨−τ _P（P） )]²)和[N]=[（S）_三](t吨−τ _N个 )、正反馈和负反馈中间分量（见图。1组件的定义）。

RF-TGF模型-β信号

简化模型近似于TGF-β用6个微分方程发出信号。假设R1和R2的动力学相似，因此单个组分被受体块取代，R.R随后二聚形成RC。LC和PC组合在一个参数中，即PC，因为它们大致遵循相同的动力学。描述受体相互作用和初始SMAD变化的反应如下：

(3)

虽然系统内的一些协同作用起源于膜上、细胞质中和细胞核中的几个二聚体和三聚体反应，但与TGF相关的最关键的协同作用-β诱导的信号反应来自磷酸化SMAD3的三聚化、这些低聚物与SMAD4三聚体的结合以及miR-433和SMAD7转录的相应刺激。需要注意的是，磷酸SMAD的三聚反应会影响正反馈回路和负反馈回路（见图。1).

图三描述了我们用来生成用于模拟TGF的RF模型的反应框架-β信令以及如何从半简化模型中导出信令。RF模型中的关键组件如图所示。三这种简化/简化方法保留了信号通路的所有关键组件。

方程中引入了描述RF模型的延迟微分方程组。4我们将此模型命名为TGF的RF模型-β自“R”以来的信号表示模型为“第页“导出”和“F”强调积极和消极（f）射频模型中考虑了反馈环路。最初，正反馈回路和负反馈回路的延时和振幅(τ _P（P） 和τ _N个 )假设是相同的，但如补充结果所示，在有适当的实验数据时调整这些参数是可行的。

$$\开始{对齐}\frac{\mathrm{d}[\mathrm{R}]}{\mathr{d} t吨}&={v{1}}-{k{1}{[\mathrm{R}]-2{k{text{RC}}^{+}}[\mathrm{R{]^{2}+2{k{\text{RC}^{-}}[\text{RC}]\\&\quad-{k{1}^{text{f+}}[\mathr m{P}]\frac{[\mathrm{R}]}{[\mathrm{R}]+{k}}-{k{1}^{text{f}-}}[\mathrm{N}]^{2}\frac{[\mathm{R}]}{[\mathrm{R}]+{K}}\\frac{\mathrm{d}[\text{RC}]}{\mathr{d} t吨}&={k{\text{RC}}^{+}}[\mathrm{R}]^{2}-{k{text{RC}{^{-}}[\text{RC}]-{k_{text{RC}}[\t文本{RC}]\\&\四元-{k_文本{PC}}^{+{}}[（\text｛转化生长因子｝-\测试版）{2}][\text{RC}]\\&\quad+{k{\text{PC}}^{-}}[\text}PC}]-{k{text{RC}}^}\text{f}-}}[\mathrm{N}]^{2}\frac{[\text{RC}]}{[\text{RC}]+{K}}\\frac{\mathrm{d}[\text}PC}]}{d} t吨}&={k_{text{PC}}^{+}}[（\text{转化生长因子}-\β）_｛2｝][\text｛RC｝]-｛k_{f}-}}[\mathrm{N}]^{2}\frac{[\text{PC}]}{[\text{PC}]+{K}}\\frac{\mathrm{d}[\mathr{S}]}{\mathr{d} t吨}&={v_{\mathrm{S}}}-{k_{\mathrm{S}}[\mathrm{S}]-{k_{\mathr m{S{}^{+}}[\text{PC}]\frac{[\mathr m{S}]}{[\methrm{S}]+{k_{\methrm{S数学{S}}]\\frac{\mathrm{d}[{hat{\mathr数学{S{}}]}{\mathm{d} t吨}&={k_{\mathrm{S}}^{+}}[\text{PC}]\frac{[\mathrm{S}]}{[\mathrm{S}]+{k_{\mathrm{S}}}}-{k_}\mathrm2{S}}^{-}}[{hat{\mathrm{S{}}]-{k{n}}[hat{]\\&\四元+{k_{n}^{-}}[\mathrm{宋体}_{\mathrm{n}}]-k{\hat{\mathr{S}}}[{\hat{\mathm{S}{}]\\frac{\mathrem{d}[\mathrm{宋体}_{\mathrm{n}}]}{\mathr{d} t吨}&={k{n}^{+}}[{\hat{\mathrm{S}}]-{k{n}^{-}}[\mathrm{宋体}_{\mathrm{n}}]-{k{\mathr{宋体}_{\mathrm{n}}}[\mathrm{宋体}_{\mathrm{n}}]\end{aligned}$$

(4)

其中，[（S）_三]=[S_n个]^三/K（K） _三，[N]=[（S）_三](t吨−τ _N个 )和[P]=K（K） _我 ²/(K（K） _我 ²+[（S）_三(t吨−τ _P（P） )]²).τ _P（P） 和τ _N个 分别表示包含在正反馈回路和负反馈回路中的时滞。总PSMAD浓度\（[\hat{\mathrm{S}}]\）定义为：

$$[{\hat{\mathrm{S}}]+\frac{Vn}{Vc}\left（[\mathrm{宋体}_{\mathrm{n}}]+[（\mathrm{S}）{3}]\右）$$

其中Vn和Vc分别定义为细胞核和细胞质室的体积。[（S）_三]=[S_n个]^三/K（K） _三和[S_n个]，由最终方程式计算得出4.

参数\（{k{1}^{\text{f-}}}\）,\（{k_{text{RC}}^{text{f-}}}\）和\（｛k_｛\text｛PC｝｝^｛\text｛f-｝｝｝\）分别表示R、RC和个人计算机R1相关膜复合物。尽管我们对R、RC和个人计算机同时，以相同的强度和结合常数个人计算机是产生切换行为的原因（参见“TGF负面反馈现场-β发信号“第节）。正反馈仅适用于多胺起作用的R[26,29]. RF-TGF的协作性-β信号系统来源于自我调节的正反馈和负反馈的耦合，而不是来自配体二聚或耗竭等细胞外效应。

等式中的分量P。4表示Azin1：抗酶：ODC：正反馈作用于受体的多胺相关反应（图。1). 正反馈是间接的，受到两个耦合的抑制过程的影响[26].

实现最具生物相容性和鲁棒性的TGF模型-β需要确定反馈反应的作用位点。敏感性分析确定PC为负面反馈行动点（参见“TGF负面反馈现场-β信号“第节）。SMAD7与受体结合并参与E3泛素（Ub）连接酶介导的受体泛素化的诱导[63,64]. 采用Henri-Michaelis-Menten动力学对负反馈抑制函数进行建模。据报道，多胺消耗增加TGF-β1型受体mRNA和增加细胞对TGF的敏感性-β-介导生长抑制[26,28,29]. 因此，我们使用两个抑制反应来模拟正反馈回路的连续反应：第一，通过miR-433抑制中间抑制剂P，第二，通过P抑制R。

（S）引发的反应需要延时_三因此，正反馈回路和负反馈回路均采用了时滞。时滞补偿了SMAD核质穿梭和简化模型中巩固的其他反应（例如，负反馈环的SMAD7转录和翻译，正反馈环的miR-433/Azin1/Antizymey/ODC反应链）。

结果中描述的模拟是使用RF模型中描述的方程进行的。浓度是无量纲且按比例缩放的，以便v（v） ₁=1.更多模拟和实验结果显示在“附加文件”的“补充图”部分1”.

结果和讨论

TGF的数值模拟-β信号

通过对简化方程和比例的分析，可以以较低的复杂性研究模型的特性。我们的模型使用六个耦合微分方程来表示膜上、SMAD信号级联内和反馈回路中发生的所有反应。在所有的计算机模拟中，我们假设τ _P（P） =τ _N个 =45分钟。

为了确保解（或稳态）的存在唯一性，系统必须满足全局/局部Lipschitz条件[65]. 方程定义的所有方程。4可以以状态方程的形式考虑，\（\点{x}=f（x，t）\）、和在x和t中是全局连续的。还有它们的偏导数\（\left（\frac｛\partial f_{i｝｝｛\partial x_{j｝｝\right）\）对于所有x都是连续的∈R（右） ^n个，n=6。由于偏导数\（\左（\分数{\部分f{i}}{\部分x{j}}\右）\）是局部有界的，可以推断所有f _我 （x，t）是所有x的局部Lipschitz。因此，方程。4确保在感兴趣的领域中存在唯一的解决方案。

注意，感兴趣的域D，其中x∈D、 是R的子集⁶对模型参数和变量的初始值应用了几个生物约束。例如，模型的任何成分都不能是负的，也不能是无限的，因为它们是浓度、动力学速率或结合常数。许多细胞质和核变量在刺激开始时为零。因此，D不涵盖整个R⁶空间。

为了验证我们的假设，即正反馈对短期（0-3小时）和长期（6-8小时）细胞反应的系统行为变化负责，我们对相同的TGF进行了模拟-β浓度和刺激时间长达8小时。用于填充RF-TGF的参数值-β模型方程显示在“附加文件1：表S3”。图4显示了不同TGF下PSMAD浓度时间过程的预测变化-β浓度。尽管模型对不同（非零）配体浓度的瞬态响应发生了显著变化，但稳态保持不变。零TGF-β正如我们预期的那样，输入不会启动任何信号。为了在文献中重现总PSMAD时间进程的结果（例如[22,66])，我们用TGF参数化了RF模型-β=5个任意单位，其中PSMAD的稳态水平为40%小于其短期峰值，并在配体刺激后1小时达到峰值。

图4

不同TGF的总PSMAD时间进程-β浓度。TGF公司-β信号发送，因此PSMAD时间进程与TGF成比例-β浓度。作为转化生长因子-β输入信号增加，PSMAD总浓度的峰值向左移动，强度更强，持续时间更长。在TGF约为零的情况下-β输入（TGF-β=0.001），则不会发出信号。尽管TGF的总PSMAD浓度（<3小时）发生了短期变化-β，其稳态水平保持不变（0.3）。我们已经根据其与实验数据的一致性对RF模型进行了参数化，即TGF-β=5，其中刺激后50-60分钟PSMAD总浓度的峰值对应于短期（瞬态）响应，0.3的恒定水平代表系统的长期（稳态）响应。注意，所有浓度都用任意单位表示

TGF的RF模型-β信号可以在特定条件下显示振荡（附加文件2：图S5）。振荡是由于正反馈回路和负反馈回路之间的耦合而发生的。更具体地说，增加受体产生率(v（v） ₁)和SMAD生产率(v（v） _S公司)同时增加了当配体丰富时发出信号所必需的潜在成分。因此，系统可以振荡而不衰减PSMAD电平。虽然该模型可以产生振荡响应，但TGF中没有振荡报告-β信号通路实验。因此，我们调整了射频模型参数和动力学速率，使PSMAD在刺激后出现单峰，并平稳衰减到稳态水平。

Zi等人的模型[22]产生了一个S形TGF-β细胞对长期刺激反应的浓度依赖性。PSMAD的总浓度被用作最终细胞反应的解释。根据他们的结果[22]，细胞对长期TGF反应的拟合曲线的希尔系数-β刺激强度约为4.5。Zi等人模型对TGF的短期（瞬态）响应-β遵循希尔方程，近似系数为0.8[22]. Zi等人提出，系统行为发生如此巨大变化的原因是由于配体与受体的相互作用以及配体的相应降解导致了显著的时间依赖性配体耗竭[22].

我们检查了我们模型中PSMAD的短期（0-3小时）和长期（6-8小时）反应作为TGF的函数-β浓度（图。5). 短期Hill系数为0.85，长期Hill系数为3.87，即与Zi等人确定的值相似（参见Zi的图5.A和5.B[22]). 参数值拟合到图中的单个项（希尔系数）。5和其他文件2：图S3。注意，这些点是射频模型模拟的结果，曲线显示了拟合的希尔方程。这些结果支持我们的假设，即TGF中时滞正反馈和负反馈的耦合-β信号转导系统可以解释对配体浓度的超敏反应。

图5

简化TGF的瞬态和稳态响应-β信号模型。PSMAD水平对不同浓度TGF的短期反应-β称为瞬态响应。图中每个点的模拟时间为50分钟（图中的过冲时间。4). PSMAD水平对不同浓度TGF的长期反应-β称为稳态响应。图中每个点的模拟时间为500分钟（图中的稳态时间。4). 在生成这两条曲线时，模型的唯一参数是TGF-β浓度。注意，两个轴上的浓度单位是任意的

TGF负面反馈现场-β发信号

在最初的计算中，我们允许负反馈作用于膜上的所有R1相关络合物，然而，敏感性分析表明，正是通过PC的负反馈调节系统。PC是唯一的TGF-β-TGF简化模型中的相关复合体-β发出信号。总TGF-β配体浓度（细胞外TGF-β，在我们的模拟中保持不变，并且在个人计算机复合物）因降解而减少个人计算机通过基础降解和负面反馈，个人计算机.TGF系统的饱和-β使转化生长因子变平-β高浓度配体的浓度响应曲线（图。5). 为了检验我们的假设，我们进行了一组模拟，去掉了对R和RC的反馈（图S3）。为了实现这一点，\（k{1}^{\text{f}-}\)和\（k_｛\text｛RC｝｝^｛\text{f}-}\)被设置为零。这些模拟的结果证实了我们最初的假设，即负反馈几乎完全通过PC进行。

反馈回路的动力学和效果取决于其他参数，即N和K。但是，其他参数不能设置为零，因为这些浓度，例如N，取决于系统中的其他浓度，例如（S）_三，在初始时间点后为非零。因此，N在时间0之后不为零。K是反应的结合常数，与另一种浓度一起作为分母，例如等式中的R。4。将K设置得足够大并不能保证负反馈回路将被关闭。将系数设置为零是从分量R和RC中消除负反馈回路影响的唯一方法。负反馈回路只作用于R、RC和PC。如果我们去掉它对R和RC的影响，PC是唯一受负反馈回路影响和调节的组件。请注意，关闭一种组分的负反馈回路不会改变该回路对其他组分的有效性：N在方程式中被视为一种酶（Michaelis-Menten动力学），并且在反应过程中不会被消耗，因此其浓度及其有效性不会改变。

肿瘤细胞对TGF的反应-β

我们建议PSMAD浓度对TGF的响应时间过程-β由于SMAD的可能突变，即TGF的突变，癌细胞中的刺激被改变-β受体和/或不同受体水平[67–70]. 因此，我们通过降低TGF来模拟早期肿瘤的生化条件-β受体水平和SMAD浓度[71]. 更准确地说，为了调节受体水平，我们减少了正反馈回路对受体的影响(\（k{1}^{\text{f}+}\）在附加文件中1：表S3从1减少到0.1）和SMAD(v（v） _秒 在附加文件中1：表S3从1减少到0.5）。在受体和SMAD浓度较低的细胞中，总PSMAD时间进程的模拟响应如图所示。6图的比较。6带有图。4结果表明，PSMAD浓度峰值较高（0.67而非0.5），但在稳态时降低至较低水平（0.13 v.s.0.3）。显然，在受体水平较低（<0.5正常）时，例如在早期癌症中，TGF的反应-β显著减少。这一结果证实了我们简化的TGF受体模型的适用性-β模拟正常细胞和早期结肠癌细胞反应的信号。

图6

特定TGF的总PSMAD时间进程-β浓度。特定TGF的总PSMAD时间进程-β浓度。将低膜受体浓度条件（或所谓早期肿瘤）的模拟结果与高膜受体浓度情况（或所谓晚期肿瘤）的仿真结果进行比较。通过改变膜上受体的产生速率来模拟这些条件。请注意，PSMAD浓度水平的单位是任意的

相反，晚期肿瘤对TGF的反应更灵敏-β信号[72]. 这可能是由于TGF的影响-β肿瘤的微环境及其间接刺激[73–77]. 然而，TGF-β受体是完整的，SMAD是突变的，通过MAPK和P38通路的活性受体和信号可以刺激迁移和侵袭[41,73,78]. 为了模拟晚期肿瘤环境，通过增加相对动力学速率来增加受体和SMAD水平。v（v） ₁在附加文件中1：表S3从1增加到1.2v（v） _S公司从1增加到1.5。晚期肿瘤对TGF的反应预测-β刺激如图所示。6尽管总PSMAD浓度在较高水平的TGF处达到峰值-β在晚期肿瘤中，PSMAD的稳态水平与峰值（即TGF的正常水平）没有显著差异-β受体）。

为了研究受体水平在信号传递中的作用，我们模拟了当受体浓度单调增加时PSMAD浓度的行为。增加受体产生率以提高受体浓度。TGF公司-β实验期间，浓度保持在恒定水平。该模拟针对两种不同浓度的TGF进行-β：5和2（任意单位）。第二个TGF-β浓度大致位于长期稳态PSMAD浓度开关发生的位置（参见图中的稳态响应。5和其他文件2：图S3）。TGF时PSMAD稳态浓度没有明显变化-β浓度降低（图。7). 低受体浓度模拟癌细胞（见图。7). 图中两个面板开始时的非响应性。7表明细胞对TGF不敏感-β当受体拷贝数非常低时发出信号，即癌细胞中的情况。饱和水平决定了信号水平最高的受体浓度。当受体浓度约为0.75时，PSMAD水平达到饱和水平，并随着受体浓度的增加而保持在该水平。图中的饱和度水平。7对应于图中PSMAD的稳态。5，稳态响应。正如预期，当TGF-β浓度增加，PSMAD曲线向左移动，所有变化发生在较低的受体水平。

图7

受体浓度对PSMAD长期反应的影响（500分钟）。计算了两种不同配体浓度TGF的PSMAD稳态水平-β=2和TGF-β=5（任意单位）。该图的两条曲线之间大致没有差异。请注意，PSMAD和受体浓度水平的单位是任意的

根据RF模型公式，负反馈项与−（S）成正比_三)²，而正反馈项的变化与\（-\frac｛1｝｛（\text｛（S）｝_｛\text｛3｝｝）^｛2｝｝\）结果，负反馈在高（S）时主导正反馈_三浓度（例如在PSMAD的峰值），并降低PSMAD水平，直到其达到稳定状态（见图。7和“附加文件”中的“射频模型中的反馈环路和时间延迟”部分1”).

不同初始SMAD浓度的模拟结果如图所示。8这些模拟中的PSMAD水平对TGF很敏感-β浓度。正如预期的那样，PSMAD水平随着SMAD水平的增加而增加，直到其饱和。降低TGF-β该值抑制了所有SMAD浓度下的信号。TGF浓度较高时-β，PSMAD水平在SMAD浓度较低时达到饱和水平，即0.1（图。8、TGF-β=5）与图中的0.4相比。8当TGF-β=2.图中两条曲线饱和水平的差异。8是由于不同TGF刺激的PSMAD时间进程的不同稳态水平-β浓度。此外，随着SMAD初始浓度的增加，RF模型稍后达到稳态（由于PSMAD水平的阻尼振荡，附加文件2：图S5）。

图8

SMAD浓度对PSMAD长期反应（500-2500分钟）的影响。计算了两种不同配体浓度TGF的PSMAD稳态水平-β=2和TGF-β=5（任意单位）。TGF时总PSMAD的稳态水平升高-β=5比TGF时-β=2，因为配体浓度增加。请注意，PSMAD和SMAD浓度水平的单位是任意的

仿真结果与实验数据的比较

我们简化的转化生长因子-β利用小鼠胚胎成纤维细胞的PSMAD数据对信号射频模型进行了实验测试。将模型的预测结果与图中的两个不同实验数据集进行了比较。9实验数据和模拟曲线之间的差异可以通过与实验相关的误差和缺乏实验数据来解释。模拟结果与TGF响应的实验结果吻合良好-β正常细胞中的信号（图。9 一和b条).

图9

PSMAD2时间进程验证与实验数据集一野生型和b条第13页0^F类/F类MEF公司。不同颜色的点指定不同的实验。曲线表示PSMAD2动力学的模型预测。模型参数在图的曲线中发生了变化。9 b条因此PSMAD2浓度的稳态水平较低，峰值较高

野生型MEF的实验数据和PSMAD2总浓度水平的模型预测曲线如图所示。9 一类似地，在图。9 b条用Gp130的实验数据绘制了简化模型^F类/F类MEF公司[53]. 为了实现图中的最佳拟合。9 b条必须调整RF模型的参数。据报道，Gp130中SMAD7的浓度水平较高^F类/F类MEF因其基因修饰[53]. 如图所示。9 b条，PSMAD2的稳态水平低于图。9 一注意，图中的误差条较小。9 b条对于更长的时间点。

结论

TGF的重要性-β癌症进展中的信号传递预示着癌细胞生物学研究的新时代[73,79–81]. TGF的几种模型-β现在已经提出了信号发送[16–22]. 在每种情况下，这些模型都试图研究细胞内信号反应对不同浓度TGF的反应-β在一个最全面的数学模型中，Zi等人[22]预测配体耗竭有助于PSMAD的长期反应水平。Zi等人建议在较高浓度的TGF下-β，介质中没有损耗，因此对TGF的瞬态响应转变为开关型响应-β浓度。然而，他们也注意到，负反馈机制也可能有助于开关式反应[22].

我们的转化生长因子-β该模型使用的反应比Zi等人更少[22]然而，我们的模型代表了控制TGF响应的关键组件的行为-β刺激时间为80分钟和8小时。众所周知，延迟的正负耦合反馈可以产生鲁棒稳定的信号[32,33,82,83]. 为了探讨反馈回路在TGF中的关键作用-β信号网络我们引入了一个模型，其中稳态依赖于正反馈和负反馈回路。我们研究的目标之一是设计一个适用于正常细胞和癌细胞的数学模型。在许多早期癌细胞中TGF的数量-β受体显著减少[68–70]，因此TGF-β信号被下调。Zi等人的时间依赖性配体耗竭模型[22]不能模拟受体水平的下降。

我们的模拟结果表明，细胞的PSMAD反应对TGF不太敏感-β低受体浓度刺激。这与TGF一致-β早期癌细胞系中的信号抑制。我们的模拟还表明，SMAD水平的降低还将导致TGF信号的整体抑制-β由于SMAD的突变，许多早期癌症可能会降低TGF水平-β信号[67]. 这些结果与早期肿瘤与转化生长因子损失相关的图片一致-β灵敏度和TGF的降低-β受体表达[84].

TGF公司-β在晚期肿瘤中可以刺激信号转导（“TGF-β悖论“[85,86]即早期癌症对TGF不太敏感-β抑制剂，而许多晚期癌症受TGF刺激-β直接通过增加受体水平或间接通过对细胞微环境的影响）。我们的反馈回路模型产生的结果与TGF的两个角色一致-β在肿瘤发生中。晚期肿瘤对TGF的反应性增加-β可以通过增加受体或SMAD的产生速率来发生。根据我们的模型预测，PSMAD响应TGF的过冲峰值-βPSMAD在早期肿瘤中较高，稳态水平通常较低，而在晚期肿瘤中稳态和峰值水平均高于正常细胞。此外，晚期肿瘤中PSMAD峰值和稳态水平之间的差异较小，因此TGF-β信号将持续更长时间。这项工作可以作为TGF未来实验研究的指导-β对肿瘤进展的影响。必须强调的是，晚期肿瘤反应必须受到其他改变TGF反应的基因改变的影响-β从抑制到刺激。在未来的研究中，重要的是添加其他可以连接TGF的途径-β向抗有丝分裂过程、迁移过程发出信号，甚至增加增殖。

该模型为预测TGF的影响提供了依据-β不同TGF水平细胞的信号传递过程-β受体或SMAD。通过考虑耦合的正负反馈回路调节TGF的模型-β可以在不消耗TGF的情况下观察到信号切换响应-β[22]. TGF公司-β利用控制理论分析，包括系统识别方法，可以更精确地研究信号转导[87,88].

方法

实验数据集和用于设置模型初始参数的动力学速率取自文献[16–22]. 对于初始条件、参数值的估计和一些实验数据的解释，我们受益于Zi等人提出的模型[22]. 所有参数的值都记录在附加文件中1：表S1、S2和S3。

计算机建模和仿真

用于这些模拟的程序，其中PYTHON 2.7和MATLAB 7.10。MATLAB的曲线拟合工具箱用于拟合图中的Hill方程。5和其他文件2：图S3，并推导希尔系数。

数学和生化分析

生化动力学、平衡分析、反馈分析、使用快速平衡假设的还原分析、时滞分析、渐近展开和灵敏度分析（参见“附加文件1“）已在模型上执行[49].

我们使用Western blot分析进行定量。Western blot只是一种半定量方法；未测量绝对值。因此，在整个手稿和图表中，蛋白质浓度的单位是任意的。注：方程式中的每个物种。4以隔间体积计算。方程式所有物种的体积修正。4隐藏在相应项的系数中，并且在方程式中没有明确显示，例如。\（{k{n}^{-}}\）和\（｛k_｛n｝^｛+｝｝\）包括V（V） _n个 /V（V） _c（c） 和V（V） _c（c） /V（V） _n个 体积校正项。

细胞培养和细胞裂解

从第13至15天的胚胎中分离出小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。MEF WT、SV40-永生化MEF（猿猴空泡化病毒40）和Gp130^F类/F类MEF公司[53]在含有15%FCS的DMEM中培养。在电镀前，对细胞进行抽提并用DMEM+15%FCS清洗。用1×10传代3个细胞⁶将MEF/孔接种在60mm平板中0-4小时，0.5×10⁶24小时和0.25×10的MEFs/井⁶MEFs/孔，用5 ng/ml TGF治疗48小时-β分别是。用冷PBS洗涤两次后，细胞在冰镇200中溶解μl RIPA裂解缓冲液，含1M Tris/HCL、0.5M EDTA、5M NaCl、10%Na-Doc（脱氧胆酸钠）、10%TX-100、10%SDS、蛋白酶抑制剂100×和H₂O.将细胞裂解物穿过27G针5次，然后在冰上培养20分钟。培养后，在13000 rpm下旋转样品30分钟，在4^o个C.将上清液转移到新试管中：20μl用于BCA蛋白测定的样品（Sigma试剂盒B9643）；20μ将l 5×样品缓冲液添加到80μl样品，样品加热至95^o个C静置10分钟，用SDS-PAGE进行分析。

蛋白质印迹

Novex NuPAGE公司Ⓡ使用4-12%-Bis-Tris（生命技术NP0335盒）凝胶分析每个时间点的样品裂解物。SMAD7抗体通过Santa Cruz Biotechnology提供，并在3%BSA-TBS-T中以1:1000的比例使用。PSMAD2抗体（兔多克隆抗磷酸-Smad2抗体（1:1000用于Western blot））是Peter ten Dijke教授（荷兰莱顿大学医学中心）的礼物。β-根据所分析的蛋白质，微管蛋白、肌动蛋白、拉明B1或转铁蛋白受体被用作负荷控制。为了检测抗体，使用iBlot 2凝胶转移装置（Life technologies）将蛋白质转移到硝化纤维素膜上，并使用奥德赛红外扫描仪（LI-COR）对膜进行扫描。

蛋白质定量

使用ImageJ 1.49p对Western blot图像进行量化。使用每个加载控制的信号对每个蛋白质的信号进行标准化。