周细胞衍生的细胞外小泡中的微小RNA-148a-3p通过促进海绵状神经血管再生改善糖尿病小鼠的勃起功能

摘要

背景

探讨小鼠海绵体周细胞（MCPs）衍生细胞外囊泡（EVs）中microRNA（miR）-148a-3p在糖尿病性勃起功能障碍（ED）治疗中的调节作用。

方法

小鼠海绵体组织用于MCP的原代培养和EV的分离。进行Small-RNA序列分析以评估MCPs-EV中miR的类型和含量。使用四组小鼠：对照非糖尿病小鼠和链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠，接受两次海绵体内注射磷酸盐缓冲盐水（第3天和第0天），转染试剂对照的MCPs-EV，或转染miR-148a-3p抑制剂的MCPs-EV。通过试管形成试验、迁移试验、TUNEL试验、海绵内压、免疫荧光染色和Western blotting评估MCPs-EV中miR-148a-3p的功能。

结果

我们从MCP中提取EV，并且小RNA测序分析显示miR-148a-3p在MCPs-EV中富集。外源性MCPs-EV可有效促进小鼠海绵状内皮细胞（MCEC）管的形成、迁移和增殖，并减少高糖条件下MCEC的凋亡。这些作用在miR-148a-3p缺失的MCPs-EV中显著减弱，这些MCPs-ev是在抑制miR-148a-3p在MCPs中的表达后提取的。反复海绵体内注射MCPs-EV可通过诱导糖尿病小鼠的海绵体神经血管再生改善勃起功能。利用在线生物信息学数据库和荧光素酶报告分析，我们预测丙酮酸脱氢酶激酶-4（PDK4）是miR-148a-3p的潜在靶基因。

结论

我们的发现提供了新的可靠证据，证明MCPs-EV中的miR-148a-3p通过抑制糖尿病小鼠PDK4的表达，显著增强了海绵体神经血管再生。

背景

勃起功能障碍（ED）是一种血管性疾病，预计到2025年，全世界将有3.22亿男性罹患此病，其中30-75%的男性患有ED，尤其是与糖尿病相关的ED[1]. 口服磷酸二酯酶5（PDE5）抑制剂依赖内源性一氧化氮（NO）生物利用度，是糖尿病诱导ED的一线治疗药物[2]. 然而，糖尿病患者勃起组织中的长期微血管病变可导致缺氧和结构改变，从而导致内皮周细胞功能障碍和周围神经病变[三]并可能导致口服PDE5抑制剂的不良反应[4]. 几个新靶点的临床开发，包括COMP-Ang1[5]，血管内皮生长因子[6]和脑源性神经营养因子[7]由于疗效不足、副作用和临床前研究中的蛋白质工程困难，已经受到阻碍。因此，在糖尿病所致ED的血管病变和神经病变的复杂病理过程中，需要一种副作用最小的有效治疗策略。

细胞外小泡（EV）几乎由所有类型的细胞释放[8]包括蛋白质、脂质、信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA）和核酸，它们在供体细胞和受体细胞之间的生理和病理交流中发挥多种作用[9]. 在糖尿病和海绵体神经损伤（CNI）诱导的ED小鼠模型中，从小鼠胚胎干细胞和小鼠体海绵体周细胞中分离出的EV-类纳米囊泡（NV）可显著诱导神经血管再生[10,11]. 然而，MCP调控的详细途径和靶基因-衍生电动汽车（MCPs-EV）仍未明确。此外，miRNAs在转录后水平抑制或降解mRNA，从而调节各种细胞过程，如血管生成、增殖、凋亡和神经再生[12,13]. 我们假设MCP-EVs通过递送miRNA促进神经血管再生，从而改善糖尿病小鼠的勃起功能。

本研究的主要目的是确定MCPs-EV中miRNAs的类型和含量以及糖尿病条件下的神经血管再生功能；次要目标是确定MCPs-EV中miRNAs的靶基因。

方法

道德声明和研究设计

本动物模型研究包括75只成年雄性C57BL/6 J小鼠（8周龄；Orient Bio公司）：15份用于MCP原代培养、MCPs-EV分离和小RNA序列分析；20份用于体外研究；40个用于体内研究。所有动物实验均由英哈大学伦理委员会批准（批准号：Inha 200309-691）。如前所述，每天监测动物的健康和行为[14,15]. 在所有研究中，通过肌肉注射氯胺酮（100 mg/kg；韩国首尔Yuhan公司）和木聚嗪（5 mg/kg；拜耳韩国、首尔、韩国）。用100%一氧化碳对动物实施安乐死₂气体置换；在采集组织之前确认心跳和呼吸停止。所有动物研究均为随机、盲法研究。实验过程中没有小鼠死亡。

MCP和MCEC的原代培养和治疗

如前所述，从小鼠阴茎组织制备初级MCP和MCEC[16,17]. 简单地说，用100%CO对8周龄雄性C57BL/6 J小鼠实施安乐死₂气体置换。然后，收集阴茎组织并保存在装有HBSS（Gibco）的无菌小瓶中。用PBS冲洗3次后，去除尿道和背侧神经血管束，仅使用海绵体组织。对于MCP培养，海绵体组织被切割成大约1-2 mm的切片，并通过重力将其固定在胶原I涂层的35 mm细胞培养皿中，在37°C的温度下，在5%的CO中培养20分钟，加入300μL补体DMEM（GIBCO）₂大气。然后，添加900μL补体培养基，并在37°C下与5%CO孵育₂补体培养基含有20%FBS、1%青霉素/链霉素和10 nM人色素上皮衍生因子（PEDF；Sigma-Aldrich）。每2天更换一次培养基，大约10天后，将萌芽细胞亚培养成I型胶原蛋白（Advanced BioMatrix，San Diego，CA，USA）涂层培养皿。对于MCEC培养，海绵体组织被切割成约1-2 mm的切片，放入60 mm的培养皿中，并用Matrigel覆盖（Becton Dickinson，Mountain View，CA，USA）。组织用含有20%胎牛血清（FBS，Gibco）、0.5 mg/mL肝素（Sigma-Aldrich）、5 ng/mL重组人血管内皮生长因子（VEGF，R&D Systems Inc.，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）和1%青霉素/链霉素（Gibco。细胞在60 mm细胞培养皿的底部汇合后（大约培养2周），将萌芽细胞亚培养到其他涂有0.2%明胶的细胞培养皿中（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）。将第2代至第3代的细胞用于实验。缺血细胞（MCEC和MCP）模拟糖尿病诱导的血管病变24小时，然后将其暴露于正常葡萄糖（NG；5 mM葡萄糖，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）或高糖（HG；30 mM葡萄糖）条件下3天[18].

MCPs-EV分离、定量和鉴定

根据制造商的说明，使用商用EV分离试剂盒（ExoQuick-TC，System Biosciences，LLC.，Palo Alto，CA，USA），在补充20%外泌体缺失型FBS（Gibco）和1%青霉素/链霉素（Gibco）的培养基中，从DMEM培养的MCP（Gibco:Carlsbad，CA，US）中分离出MCPs-EV。使用EXOCET外显子定量试剂盒（System Biosciences，LLC.）对MCPs-EV进行定量，并在治疗前将其浓度调整为1μg/μL。

通过透射电子显微镜（TEM；electron microscopy Sciences，Fort Washington，PA，USA）确定MCPs-EV的形态，并根据Western blotting中一个阴性和三个阳性EV标记的表达验证其特征[11]（阴性标记物：GM130[1:1000；BD Biosciences，San Jose，CA，USA]；三个阳性EV标记物[1:1000]：CD9[Abcam，Cambridge，MA，USA）、CD63[NOVUS Biologicals，Littleton，CO，USA]和CD81[NOVUS Biologicals]）。

用于跟踪分析的MCPs-EV荧光染料标记

根据制造商的说明，用1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚二碳菁，4-氯苯磺酸盐（DiD）红色荧光染料（ThermoFisher Scientific，Inc.，Carlsbad，CA，USA）标记MCPs-EV。DiD标记的MCPs-EV处理6小时后，用4%甲醛孵育15分钟，固定MCEC。DiD染料追踪是在共焦荧光显微镜下测定的（K1-Fluo，Nanoscope Systems，Inc.，Daejeon，Korea）。

通过小RNA序列分析鉴定miRNA

E-Biogen Inc.（韩国）进行了小分子RNA测序分析。对于控制和测试RNA，根据制造商的说明，使用NEBNext Multiplex Small RNA library Prep kit（美国新英格兰生物实验室公司）构建了一个库。小RNA测序数据保存在基因表达综合数据库中(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo；注册号GSE195533）。

用miR148a-3p抑制剂转染MCP

使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）用20nM miR148a-3p抑制剂（一种mirVana®miRNA抑制剂，Cat#，4464084，Thermo Fisher，San Jose，CA，USA）转染原代MCPs。24小时后，用DMEM替换培养基，补充20%外泌体缺失的FBS和1%青霉素/链霉素，为期3天，收集培养基进行条件化MCPs-EV分离。

MCPs-EV中RNA的提取

根据制造商先前描述的方案，使用miRNeasy血清/血浆试剂盒（德国希尔登市齐根）从150 ul MCPs-EV中分离出外体RNA[19].

实时PCR（qPCR）

根据制造商的说明，使用TRIzol（Invitrogen）从MCP中分离出总RNA。使用Taqman microRNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA）和相关miRNA-specific stem-loop引物（AppliedBiosystes）对miRNAs进行逆转录。RT反应条件为：16℃下30分钟退火引物，42℃下30 min引物延伸到miRNA并合成第一条cDNA链，85℃下5分钟停止反应。在7500 Fast Real-Time PCR系统（Applied Biosystems）上进行qPCR，条件如下：在95°C下进行一个变性步骤10分钟，然后在95°C下进行40个变性周期15秒；并在60°C下退火和延伸60秒。所提供的数据对应于2的平均值^{-直接数字电流互感器}归一化到U6后，至少进行三次独立实验。

一氧化氮（NO）水平的测量

亚硝酸盐检测试剂盒（MAK367，Sigma-Aldrich）用于根据制造商的协议测定MCEC中的一氧化氮（NO）浓度，如前所述[14]. MCEC以5×10的密度接种在6孔板中⁵细胞/孔在2mL M199培养基中。24小时后，将MCEC暴露于葡萄糖条件下，在37°C、5%的加湿CO中，加入或不加入MCPs-EV或miR-148a-3p缺失的MCPs-EV，持续72小时₂大气。然后收集培养液进行NO浓度测量。亚硝酸盐水平使用微板分光光度计（BioTek Instruments Inc.，Winooski，VT，USA）在540 nm波长下测量。每个实验包含六个重复，重复四次。

试管形成分析

如前所述进行试管形成分析[20]. 在相控显微镜（CKX41，Olympus，Tokyo，Japan）下监测试管形成18小时。使用Image J（美国国立卫生研究院[NIH]1.34，http://rsbweb.nih.gov/ij/).

细胞迁移测定

使用SPLScar™Block系统（SPL life sciences，Pocheon-si，Gyeonggi-do，Korea）在60-mm培养皿上进行迁移分析[20]. 使用相控显微镜（Olympus）获得图像，并通过使用图像J确定从四个独立的块系统中移入图中框架线的细胞比率来分析细胞迁移。

标记法

如前所述，使用ApopTag®荧光素原位凋亡检测试剂盒（Chemicon，Temecula，CA，USA）进行末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸镍标记（TUNEL）检测[21]. 样品安装在含有核染色剂4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）的溶液中（Vector Laboratories Inc.，加利福尼亚州伯灵盖姆，美国）。使用共焦荧光显微镜（K1-Fluo；Nanoscope Systems，Inc）获得数字图像。使用图像J计算凋亡细胞的数量。

动物治疗和勃起功能测量

通过连续5天注射链脲佐菌素（STZ；50 mg/kg，Sigma-Aldrich），在8周龄C57BL/6 J小鼠中诱导糖尿病[22]. 8周后，将小鼠随机分为四组：对照组非糖尿病小鼠和STZ诱导的糖尿病小鼠连续两次注射PBS（20μL；连续两次海绵体内注射MCPs-EV对照试剂（20μL PBS中5μg，第−3天和第0天），或连续两次在海绵体内注射miR-148a-3p缺失的MCPs-EV(n个 = 每组5人）。注射时，用肌肉注射氯胺酮（100 mg/kg）和甲苯噻嗪（5 mg/kg）对小鼠进行麻醉，并将其仰卧在温控手术台上，注射前用血管夹压迫阴茎底部。注射后，夹钳放置30分钟，以防止血液从阴茎回流。

两周后，如前所述进行勃起功能测量[22]. 在测量海绵内压（ICP）之前，使用无创尾剪断系统（Visitech Systems，Apex，NC，USA）连续测量系统血压。计算最大ICP和总ICP与平均收缩压（MSBP）的比值，以使系统血压的变化正常化。

组织学检查

对于荧光显微镜，将小鼠阴茎组织在4°C的4%多聚甲醛中固定24小时，并在4°C，一级抗体包括：CD31（内皮细胞标记，1:50；Millipore，Temecula，CA，USA）、NG2抗体（周细胞标记，1:50；Millipore）、β（III）-微管蛋白抗体（神经元细胞标记，1:200；Abcam）、nNOS（神经元细胞标记，1:100；Santa Cruz Biotechnology Inc.，Dallas，TX USA）或磷酸组蛋白H3（PH3；有丝分裂标记，Upstate Biotechnology Inc.，Temecula，CA，USA）。用PBS多次清洗后，将样品与驴抗兔DyLight®550（1:200；Abcam）、山羊抗亚美尼亚仓鼠荧光素异硫氰酸盐（FITC；1:200；美国宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch Laboratories，West grove，PA，USA）、驴抗兔FITC（1:200）、，和驴抗鸡四甲基罗丹明（TRITC）二级抗体（1:200；Jackson ImmunoResearch Laboratories）在室温下持续2小时。使用基于DAPI的溶液（Vector Laboratories Inc.），安装样本进行核染色。使用共焦显微镜（Nanoscope Systems，Inc）对样品进行可视化并获得图像。使用图像J进行定量分析。

生物信息学目标预测

miRNA靶基因的计算预测是使用以下公布的算法获得的：DIANA-microT-CDS(http://www.microrna.gr/microT-CDS)，目标扫描(http://www.targetscan.org)和miRDB(网址：http://www.mirdb.org).

萤光素酶miRNA靶向报告分析

使用Lipofectamine 2000转染试剂将PDK4 3'UTR靶质粒（50 ng，GeneCopoeia，Rockville，MD，USA）或带有miR148a-3p模拟物（50 nM，Ambion）或对照模拟物（50nM，Ambion）的阴性对照载体（50 ng）共同转染到MCEC中。48小时后，用双荧光素酶报告试剂盒2.0（GeneCopoeia）和光度计（BioTek Instruments Inc.，Winooski，VT，USA）对细胞进行裂解，并测量荧光素酶活性。相对荧光素酶活性通过标准化雷尼利亚萤火虫荧光素酶信号与萤火虫荧光素酶信号相对应。

蛋白质印迹分析

等量的蛋白质（每道30μg）经过4–20%SDS-PAGE，然后转移到PVDF膜。在室温下用5%非脂肪干乳封闭1.5小时后，将膜与以下主要抗体在4°C下孵育过夜：丙酮酸脱氢酶激酶-4(客运专线4; 1:1000; NOVUS Biologicals）和β-肌动蛋白（1:4000；Santa Cruz Biotechnology）。将膜在室温下用PBST洗涤三次，每次10分钟。随后，在室温下将膜与山羊抗兔IgG H&L（HRP；1:1000；Abcam）、驴抗羊IgG H&L（HRP；1:100；Abcam）或山羊抗鼠IgG H-L（HRP；1:1000，Abcam；二级抗体孵育2小时，并使用ECL检测系统（Amersham Pharmacia Biotech，Inc.）显示信号。使用图像J通过密度分析对结果进行量化。

统计分析

所有结果均表示为至少四个独立实验的平均值±SEM。未成婚者吨-试验用于比较两组，四组比较采用单因素方差分析和Tukey事后检验。使用GraphPad Prism版本8（Graph Pad Software，Inc.）进行分析。P（P）小于0.05的值被认为具有统计学意义。统计样本量是根据我们之前的研究确定的[15,23]. 体内功能评估要求每组至少5只动物，其他实验要求每组至少4个样本，以便进行更有效的统计分析。

结果

MCEC中MCPs-EV特征和跟踪分析

根据TEM图像，MCPs-EV表现出独特的杯状形态（直径约30nm；图1a） ●●●●。Western blotting显示，阳性EVs表面标记，如CD9、CD63和CD81，存在于MCPs-EVs中，但在MCP裂解物中表达水平较低。相反，在纯化的MCPs-EV中未检测到阴性EV表面标记物，如GM130（图。1b） ●●●●。为了确定分泌的MCPs-EV是否被内皮细胞摄取，在MCEC中处理DiD红色染料标记的MCPs-EV，并在6小时后在MCEC内检测到（图。1c） ●●●●。这些数据表明MPCs-EV被MCEC占用。

图1

MCEC中MCP-衍生细胞外囊泡（MCPs-EV）的特征和追踪分析。一箭头所示，检测孤立MCPs-EV的典型透射电子显微照片（TEM）相位图像。比例尺=100 nm。b条MCP裂解物和MCPs-EV中三个阳性EV标记（CD9、CD63和CD81）和一个阴性EV标记物（GM130）的代表性Western blot。c（c）DiD标记的MCP-EV（红色）用MCEC处理6小时。比例尺=50μm。MCP，小鼠体海绵体周细胞；小鼠海绵状内皮细胞；二D，1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚二碳菁，4-氯苯磺酸盐

MCPs-EV的MicroRNA谱分析

为了评估MCPs-EV中miRNAs的组成，我们对MCPs-ev进行了小RNA测序分析。我们在MCPs-EV中仅检测到90个miRNA，表中列出了前10个表达的miRNA1我们关注的是miR-148a-3p，这是MCPs-EV中最丰富的miRNA。

表1小鼠海绵周细胞（MCPs）衍生细胞外囊泡（EVs）的小RNA序列分析

抑制miR-148a-3p表达可降低高糖条件下MCPs-EVs的血管生成作用

为了评估miR-148a-3p的血管生成作用，我们在MCPs和分离的MCPs EVs中转染了miR-148a-3p抑制剂，发现miR-148a-3p在MCPs和MCPs EVs中的表达显著降低（图2a和b）。然后，我们评估了在正常葡萄糖（NG）和高糖（HG）条件下，经PBS、MCPs-EVs-regent control（MCPs-EWs-RC）、MCPs-EVs-miR-148a-3p抑制剂（MCPs-EVs-miR-48a-3p-i）处理的MCECs中miR-148a-3p的表达和亚硝酸盐水平。我们发现miR-148a-3p的表达（图。2c） 和亚硝酸盐水平（图。2d） 在HG条件下，MCEC显著减少，MCPs-EV处理导致miR-148a-3p表达和亚硝酸盐水平的恢复。然而，在HG条件下，用缺失miR-148a-3p的MCP-EVs治疗的组中，miR-148a-3p的表达和亚硝酸盐水平没有显著变化。接下来，管成型（图。2e） 和细胞迁移（图。2f） 暴露于高糖PBS环境的MCEC的能力显著降低。试剂控制的MCPs-EV可以在高糖条件下诱导内皮细胞形成和迁移，从而促进血管生成。然而，在高糖条件下，用缺失miR-148a-3p的MCPs-EV治疗的组中，这些作用显著减弱（图。2e–h）。此外，使用TUNEL分析和PH3染色，我们发现miR-148a-3p缺失的MCPs-EV不能减少细胞凋亡（图三)a-b或诱导增殖（图。三c和d）在高葡萄糖条件下的MCEC。总之，这些结果表明miR-148a-3p通过诱导MCEC在高糖条件下的迁移、存活和增殖，在MCPs-EV促进血管生成中发挥重要作用。

图2

MCPs-EV通过miR-148a-3p诱导MCEC血管生成。一与microRNA对照组（miRcon）相比，转染miR-148a-3p抑制剂的MCP中miR-148a-3p的mRNA水平降低。b条与microRNA对照组（miRcon）相比，转染miR-148a-3p抑制剂后，从条件化MCP中分离的MCPs-EV中miR-148a-3p的mRNA水平降低。c（c）和天miR-148a-3p mRNA水平(c（c）)和亚硝酸盐生成(天)在正常葡萄糖（NG）和高糖（HG）条件下，用PBS、MCPs-EVs-regent control（MCPs-EWs-RC，1μg/mL）、MCPs-EVs-miR-148a-3p抑制剂（MCPs-EWs-miR-48a-3p-i，1μg/mL）处理MCEC 3天。e（电子）在正常葡萄糖（NG）和高糖（HG）条件下，对经PBS、MCPs-EVs-regent对照（MCPs-EWs-RC，1μg/mL）、MCPs-EVs-miR-148a-3p抑制剂（MCPs-EWs-miR-48a-3p-i，1μg/mL）处理的MCEC进行3天的成管分析；18小时获得的代表性图像（屏幕放大40倍）。（f）在与试管形成相同的处理条件下，在MCEC中进行迁移分析；在24小时（屏幕放大40倍）时获得代表性图像。克使用图像J量化主结数量，结果显示为平均值±SEM(n个=4）。小时使用图像J量化迁移到红染框中的细胞比率，结果显示为平均值±SEM(n个 = 4). 以NG组比率表示的值设置为1**第页 < 0.01; ***第页 < 0.001. MCP，小鼠体海绵体周细胞；小鼠海绵状内皮细胞；ns，不显著

图3

在高糖（HG）条件下，MCPs-EVs通过miR-148a-3p降低MCEC的凋亡并增加其增殖。一在正常葡萄糖（NG）和HG条件下，用PBS、MCPs-EVs-试剂对照（MCPs-EWs-RC，1μg/mL）、MCPs-EVs-miR-148a-3p抑制剂（MCPs-EWs-miR-48a-3p-i，1μg/mL）处理的MCEC进行3天的TUNEL（绿色）免疫染色。比例尺=100μm。b条通过ImageJ量化凋亡细胞的数量，结果显示为平均值±SEM（n=4）。c（c）MCEC中PH3（红色）免疫染色，处理条件与TUNEL免疫染色相同。核标记为DAPI（蓝色）。天通过ImageJ量化PH3阳性细胞的数量，结果以平均值±SEM表示（n=4）***第页 < 0.001. 末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记；MCP，小鼠体海绵体周细胞；小鼠海绵状内皮细胞；PH3，磷酸氢活塞H3；ns，不显著；DAPI，4.6-二氨基-2-苯基吲哚

MCPs-EVs通过miR-148a-3p改善糖尿病小鼠的勃起功能

为了研究MCPs-EV是否通过miR-148a-3p对糖尿病小鼠的勃起功能产生有利影响，我们在2周后进行了腹腔注射，注射了受体对照或miR-148a-3p缺失的MCPs-ev，并评估了勃起功能。在电刺激期间，PBS治疗的糖尿病小鼠的最大和总海绵内压（ICP）与MSBP的比值显著低于年龄匹配的非糖尿病对照组。有趣的是，用MCP-EVs治疗的糖尿病小鼠的勃起参数显著改善，几乎达到对照组的93%。然而，缺失miR-148a-3p的MCPs-EV治疗在糖尿病小鼠中没有显示出这种效果（图4). CD31免疫荧光染色（图5a、 c）、NG2（图。5a、 d）海绵体组织和β（III）-微管蛋白（图。5b、 e）和神经元NOS（nNOS；图。5b、 f）在背神经束中显示，MCPs-EV显著改善了糖尿病小鼠的内皮细胞、周细胞和神经组成。糖尿病小鼠的空腹和餐后血糖浓度显著高于对照小鼠。然而，无论接受何种治疗，糖尿病小鼠的体重和血糖水平均无显著差异（表2). 在三个STZ诱导的实验组之间，未观察到MSBP的可检测差异。这些结果表明，miR-148a-3p通过挽救糖尿病小鼠的海绵体神经血管再生，在MCPs-EVs诱导的勃起功能改善中发挥重要作用。

图4

MCPs-EVs通过miR-148a-3p改善STZ诱导的糖尿病小鼠的勃起功能。一年龄匹配的非糖尿病对照组、海绵体内PBS后2周受刺激的糖尿病小鼠、MCPs-EVs试剂对照组（MCPs-EWs-RC，5μg/20μL）和MCPs-EFs-miR-148a-3p抑制剂（MCPs-EVs-miR-48a-3p-i，5μg/mL）的代表性ICP反应。海绵状神经在5V下受到刺激，刺激时间由实心条指示。b、 c（c）计算各组平均最大ICP和总ICP（曲线下面积）与MSBP的比值。图表中的数据为平均值±SEM(n个 = 5). ***第页 < 0.001. STZ，链脲佐菌素；ICP，海绵内压；MSBP，平均收缩压；MCP，小鼠体海绵体周细胞；ns，不显著

图5

MCPs-EVs通过miR-148a-3p改善STZ诱导的糖尿病小鼠的海绵体内皮细胞、周细胞和神经细胞含量。一来自年龄匹配的非糖尿病对照组、腔内PBS、MCPs EVs试剂对照组（MCPs EVs RC，5μg/20μL）或MCPs-EVs-miR-148a-3p抑制剂（MCPs-EVs-miR-148a-3p-i，5μg/20μL）注射后2周刺激的糖尿病小鼠的海绵状组织中的CD31（绿色）和NG2（红色）免疫染色；比例尺=100μm。b条β（III）-微管蛋白（红色）和nNOS（绿色）免疫染色与上述CD31染色组在同一海绵体组织切片中；比例尺=25μm。核标记为DAPI（蓝色）。立方英尺使用图像J对海绵状内皮细胞、周细胞和β（III）-微管蛋白或nNOS表达的神经元细胞含量进行定量分析。图形中的数据表示为平均值±SEM(n个 = 4). 以对照组比率表示的值设置为1**第页 < 0.01; ***第页 < 0.001. STZ，链脲佐菌素；MCP，小鼠体海绵体周细胞；DAPI=4,6-二氨基-2-苯基吲哚；ns，不显著

表2生理和代谢参数：用PBS、MCPs-EV（RC）、MCPs-EV（miR-148a-3p i）治疗2周后

客运专线4作为miR-148a-3p的靶基因

根据以下参数，从DIANA microT CDS、TargetScan和miRDB中预测出98个miR-148a-3p的靶基因：靶得分>80，所有三种算法的交集，并通过已发表的RNA测序结果在MCEC中检测到[20]. 通过文献回顾和基因删除以确定miR-148a-3p的靶基因，我们选择了5个预测靶基因：Ago2、S1pr1、PDK4、Prkaa1、和亚当10在这些基因中，我们重点关注客运专线4miR-148a-3p显著调节的表达（图6a、 b）。使用TargetScan，PDK4 3'UTR位置655-662处miR-148a-3p的结合序列如图所示。6c.荧光素酶报告物分析表明，PDK4 3'UTR质粒和miR148a-3p-模拟共转染组中的荧光素酶活性显著降低。然而，对照载体转染组的荧光素酶活性没有差异（图。6d） ●●●●。这些结果表明，miR-148a-3p通过直接与PDK4 mRNA的3’UTR结合来抑制PDK4的表达。

图6

客运专线4被鉴定为miR-148a-3p的靶基因。一代表性的Western blots客运专线4在正常葡萄糖（NG）和高糖（HG）条件下，用PBS、MCPs-EVs-试剂对照（MCPs-EWs-RC，1μg/mL）和MCPs-EVs-miR-148a-3p抑制剂（MCPs-EVs-miR-48a-3p-i，1μg/mL）处理的MCEC中持续3天。b条图像J分析中PDK4和β-肌动蛋白的相对强度。图表中的数据表示为平均值±SEM(n个 = 4). 以对照组比率表示的值设置为1**第页 < 0.01; ***第页 < 0.001.c（c）PDK4 3’UTR第655-662位miR-148a-3p的结合序列。天采用荧光素酶报告法评估MCEC中miR-148a-3p与PDK4的结合能力。图表中的数据表示为平均值±SEM（n=4）。以与PDK4 3'UTR质粒组共转染的NC模拟物比率表示的值设置为1***第页 < 0.001. MCPs，小鼠体海绵体周细胞；小鼠海绵状内皮细胞；NC模拟、阴性对照模拟；ns，不显著

讨论

越来越多的证据表明，miRNAs广泛参与生理和病理过程，包括癌症、糖尿病和神经疾病[12,24,25]. 然而，miRNAs在pericyte衍生EVs中的详细作用尚不清楚。使用small-RNA序列分析，我们发现miR-148a-3p在MCPs-EV中表达最高。高葡萄糖条件促进周细胞功能障碍[21]并降低人视网膜微血管内皮细胞中miR-148a-3p的水平[26]. 此外，由于微环境的不同，miR-148a-3p在血管生成中发挥着不同的作用[27]. 因此，我们研究了高糖诱导的周细胞功能障碍是否可以减少含有miR-148a-3p的MCPs-EV的分泌，从而减少高糖条件下的血管生成。为了进一步研究miR-148a-3p在MCP-EVs促进血管生成中的作用，我们耗尽了MCP-EVs中的miR-148a-3p，发现在高糖条件下血管生成作用显著降低。因此，miR-148a-3p可能在MCPs-EV诱导的血管生成中发挥重要作用。

接下来，我们使用糖尿病诱导的ED小鼠模型评估MCPs-EV的神经血管再生作用，如前所述[21,22]. 我们发现，MCPs-EVs通过诱导糖尿病小鼠海绵体组织中的内皮细胞、周细胞和神经细胞含量上调，显著改善了勃起功能。然而，缺失miR-148a-3p的MCPs-EV并没有改善糖尿病小鼠的勃起功能。因此，MCPs-EV可以作为细胞间传递工具，将miR-148a-3p转移到受体细胞，以改善糖尿病小鼠的勃起功能。

为了证明miR-148a-3p如何调节糖尿病患者的勃起功能，我们回顾了在内皮细胞（HUVECs）中发现的miR-148a-3p的相关文献（PMID:31723119）。已确定多个目标，如NRP-1、ROBO1和ITGa5。但是为了在MCEC中找到靶点，我们使用了三个miRNA靶点预测程序和随后的验证实验，我们发现PDK4是miR-148a-3p调控的靶点。荧光素酶分析结果表明，miR-148a-3p直接靶向PDK4的3'UTR，从而降低PDK4表达。糖尿病患者的PDK4水平升高，PDK抑制剂通过促进葡萄糖氧化增强胰岛素活性[28]. 此外，用siRNAs降低肺动脉高压诱导的周细胞中PDK4的表达可以增强内皮细胞与周细胞的相互作用[29]. 因此，我们假设MCPs-EV转移的miR-148a-3p可能减少PDK4的表达，从而促进糖尿病小鼠的神经血管再生。然而，这项研究并未证实MCPs-EVs治疗组PDK4表达降低是否直接影响糖尿病ED小鼠的勃起。尽管如此，本研究为了解MCPs-EV在改善糖尿病所致ED勃起方面的详细机制和治疗价值提供了基础。

在本研究中，我们首次发现MCPs-EV以miR-148a-3p依赖性方式改善糖尿病小鼠的勃起功能。然而，我们的研究有一些局限性。首先，我们没有验证内皮细胞（HUVEC）中miR-148a-3p（NRP-1、ROBO1和ITGa5）调节的已知靶点是否也适用于MCEC。未来，对miR-148a-3p已知靶点的研究可能有助于我们进一步了解miR-148a-3p在糖尿病ED中的具体机制。第三，我们无法评估miR-148a-3p对PDK4表达的抑制是否对糖尿病诱导的ED勃起有直接影响。需要进行研究以评估PDK4在ED和其他血管和/或神经疾病中的详细机制和功能。

结论

我们的研究表明，miR-148a-3p在MCPs-EV中高度表达，通过抑制糖尿病小鼠PDK4的表达，在促进神经血管再生和最终改善勃起功能方面发挥重要作用。