溃疡性结肠炎基因组罕见拷贝数变异筛查确定潜在易感性位点

摘要

背景

溃疡性结肠炎是一种复杂的多基因疾病，是炎症性肠病的主要亚表型之一。对UC遗传病因的全面剖析需要评估包括拷贝数变异（CNV）在内的罕见遗传变异对疾病风险的贡献。在本研究中，我们进行了多步骤全基因组病例对照分析，以检查是否存在与疾病相关的罕见拷贝数变异。

方法

采用SNP阵列数据，对121名德国UC患者和1770名健康对照者进行了罕见缺失和重复的初步筛查。定量PCR和高密度定制阵列CGH用于验证已鉴定的CNV和精细定位。两个主要的随访小组包括451例病例和1274例对照的独立队列，其中CNV通过定量PCR检测，以及基于阵列数据的2396例与4886例CNV基因型对照的英国队列。针对目标和生物信息学复制。

结果

在最初的筛查小组中发现了20种罕见的拷贝数变异（14个缺失和10个重复），在UC患者中过度表达。在四个独立的病例对照系列中对这些CNV区域以及其他公众进行随访生物信息学对照组（共4439名UC患者和15961名健康对照）发现三个拷贝数变异在UC患者中富集；上游15.8 kb的删除ABCC4公司和CLDN10型在13q32.1（0.43%病例，0.11%对照），7p22.1处有119kb重复，重叠RNF216号机组,ZNF815型,OCM公司和CCZ1型（0.13%的病例，0.01%的对照）和134 kb的大规模重复KCNK9公司8q24.3基因（病例中0.22%携带，对照组0.03%携带）。与UC相关的趋势出现在P（P）-针对不同亚群的数据进行了校正。缺失区域的断点映射表明非等位同源重组是其形成的机制。

结论

我们的研究为有效筛查SNP阵列数据集的罕见CNV提供了一种实用方法，并暗示了罕见结构变异在UC发病机制中的潜在作用。

背景

溃疡性结肠炎（UC）是人类炎症性肠病（IBD，OMIM 266600）的一种主要亚型（OMIM 191390），以肠粘膜慢性炎症为特征，在受累组织中表现出连续模式。该病在北半球更为常见，在北美和欧洲，发病率为每10万人中21至246人[1]. 基于人群的观察显示，UC患者一级亲属的疾病风险高出8至10倍，这表明遗传风险因素是UC发病的原因[2]. 然而，这种疾病主要是由环境风险因素在遗传易感人群中引发的[三].

过去十年来，人们主要通过寡核苷酸微阵列（SNP阵列）上最常见的单核苷酸多态性（SNP）的全基因组关联研究（GWAS）来研究UC的遗传贡献。随后对这些SNP-GWAS数据进行的荟萃分析大大增加了UC易感性位点的数量(n个 > 然而，已识别的风险等位基因大多具有低到中等的影响（比值比<1.5），并且解释了不到15%的UC风险总方差[4,5]. 据推测，包括CNV在内的基因组结构变异是复杂疾病表型大量缺失遗传力的潜在原因之一[6]. CNV包括基因组序列的插入、复制和删除，大小从小于100个碱基对（bp）到大于1 Mbp不等，并且与SNP相比，CNV导致单个基因组之间的DNA序列变异更高（>100倍）[7,8]. 常见CNV，人群频率为> 1%，通常存在于每二倍体基因组0到30个拷贝的多拷贝数状态[9]. 在一些常见疾病中，也系统地探讨了这些常见变异的疾病相关性，但发现的CNV相关性远小于SNP相关性[10,11]. 在IBD的情况下，复杂区域中的拷贝数差异包括ß防御素2基因簇[12]以及上游20kb的删除IRGM公司[13]据报道与克罗恩病（CD）有关，这是IBD的另一种亚型，有许多（>110）与UC共有的易感性位点[5].

罕见CNV（频率<1%），主要涉及较大的基因组片段(>100 kb），并且发生在拷贝数较少的状态（主要是单拷贝增加/丢失），与出生或早发的神经发育和智力残疾疾病有着严重的和（或）综合征临床表现密切相关[10]. 这些有害的CNV和其他异常结构重排（通常称为基因组疾病）一样，大多出现德诺沃它们具有很强的渗透性，虽然经常发生，但由于对它们的强烈负面选择，在种群中仅通过一代或几代进行个别传播。另一方面，有证据表明，致病性罕见的CNV具有更中等的效应大小，单独或共同导致常见疾病表型的易感性，发病率/死亡率较低，如自闭症、精神分裂症和癫痫[14–16]. 尽管如此，罕见CNV对其他复杂常见疾病（如UC）风险的潜在贡献仍有待研究。为了研究CNV形式的罕见遗传改变是否影响UC的易感性，我们使用了一个现有的UC数据集，该数据集用于我们之前的SNP-GWAS研究[17]. 应用平台，全基因组人类SNP阵列6.0，由大约200万个（SNP和拷贝数）探针集组成，能够检测大于15kb的CNVs[18]. 我们使用检测多个重叠稀有变异体富集的方法研究了全基因组CNV。发现小组发现UC病例中罕见的过度缺失和重复。通过独立平台进行后续验证，并进一步确定目标和生物信息学复制用于验证CNV显示与UC相关的趋势。

方法

研究队列

我们招募了五个病例对照样本集，一个作为罕见CNV的筛查（发现）小组，另四个作为随访组。这里我们在用于CNV基因分型和样本来源的平台上描述它们；

阵列样本集

初始筛查队列由1121名德国UC患者和1770名健康对照组成，之前使用Affymetrix®全基因组人类SNP阵列6.0（Affy6.0）进行SNP-GWAS实验，之前已对其进行过描述[17]. 有关DNA制备和样品处理的详细信息也在附加文件中进行了描述1此外，还招募了两个独立队列的Affy6.0数据集，其中一个来自挪威，另一个来自英国。挪威研究人群包括274名临床特征良好的UC患者和挪威健康对照组的种族和性别匹配(n个 = 282），之前也有描述[17]. 英国研究人群是UC GWAS使用的“欢迎信托病例对照联合体2”的一部分[19]在处理和过滤后，包含2396例UC病例和4886例对照的数据集，如附加文件所述1.

TaqMan样本集

包括来自德国和立陶宛的两个疾病队列，通过TaqMan CNV分析自动化的实时PCR对最初选择的CNV进行基因分型（见下文）。德国UC患者包括245名男性和315名女性。德国对照组由779名18至81岁的女性（平均年龄51岁）和637名27至75岁的男性（平均年龄50岁）组成，通过PopGen生物库获得(网址：http://www.popgen.de). 立陶宛研究人群包括443名UC患者和1157名种族、年龄和性别匹配的健康献血者作为对照组。

患者招募和道德规范

UC的诊断基于对患者原始病历的审查，包括在招生大学医院进行结肠镜检。目前公认的UC的病理生理学特征包括结肠的特异性炎症、炎症的持续性、仅限于粘膜的炎症组织学证据、无肉芽肿、肠道结构改变，包括隐窝脓肿、白细胞聚集、，隐窝结构和隐窝炎变形、粘膜水肿和中性粒细胞浸润[20]. 这些临床参数用于记录疾病活动作为结肠炎活动指数（CAI）[21]. 对于UC患者，纳入标准为CAI≥4和乙状结肠内窥镜下活动性疾病。从所有研究参与者和研究机构获得书面知情同意，所有方案均由参与中心的国家和机构伦理审查委员会批准。有关样本招募和道德审批中涉及的中心的更详细描述，请参阅附加文件1.

生物信息学控制样本集

包括之前基因分型研究中招募的6724名个体；使用Illumina 1 M Dua SNP阵列对60个无关的HapMap CEU样本进行基因分型[21]，445 CEU控制Illumina 500 k v3基因型[22]，283名白种人对照组使用Illumina Human Hap 300基因分型，231名白种人为对照组使用伊llumina-Human 610-四珠芯片基因分型[23]653名白种人对照组使用Illumina Human Hap 300进行基因分型，551名白种人为对照组使用伊llumina-Human 610-四珠芯片进行基因分型[24,25]，3181名欧洲对照者使用Affymetrix®人类SNP阵列6.0进行基因分型[26]. 其他文件1：表S2提供了我们在这些样本中评估的三个特定基因组位点（CNV）的这些不同平台的详细探针覆盖率。

SNP阵列数据集的CNV调用

原始图像文件通过Affymetrix®基因分型控制台转换为CEL文件，然后使用Affymetix Power Tools（APT）APT-copynumber-workflow v 1.67进行处理。提取对比度QC（基于Affymetrix®GTC 3.0.1用户手册）和MAPD的值，并丢弃不符合默认QC值的样本（MAPD>0.4和/或对比度QC<0.4）。对于剩余的样品，如前所述进行了状态识别（IBS）和主成分分析（PCA）[17]. apt-copynumber-workflow的输出用作我们内部开发的CNV数据挖掘工具“CNVineta”的输入文件[27]. 根据每个样本中调用的CNV数量进行初步的分批过滤。异常值被定义为CNVs大于75%分位数加上1.5倍分位数区间的样本。随后进行了严格的手工原始数据检查，以识别假阴性和阳性CNV。在整个数据挖掘过程中，忽略了每个CNV少于5个支持探针且平均探针集距离小于1千基的预测CNV。

TaqMan®拷贝数分析

按照Mayo及其同事的描述，通过TaqMan CNV分析进行实时PCR检测拷贝数[28]. 使用Life Technology（加利福尼亚州福斯特市，美国）的CopyCaller v1.0软件确定样品的拷贝号状态，将确认和已知缺失或重复的样品用作校准样品（附加文件1：图S3-S5）。对于初始筛选期间确定的CNV的技术复制，由于所选CNV的频率较低，因此未包括校准品样品，我们假设大多数样品的拷贝数状态为2。我们丢弃了置信值<95%和/或z评分≥2.65的样本。四个技术复制品中至少有三个必须包括在内，用于计算置信值和z分数。

阵列CGH（aCGH）

使用Nimblegen提供的定制CGH4×72K阵列对13个个体的一个缺失和两个重复进行精细定位。基于NCBI构建hg18的探针设计的床文件可以作为附加文件下载1。阵列覆盖了以下区域：chr13:94757799-94817490、chr7:5667022-6057428和chr8:140281592-140630270。

表达式分析

如前所述，对62例UC患者的乙状结肠进行内镜活检，其中两人携带相关缺失，以进行基因表达分析[21]. TaqMan®预先设计的表达分析为Hs01075312_m1CLDN10型和Hs00988717_m1用于ABCC4公司.

断点映射

根据定制aCGH为缺失提供的基因组分辨率，在预测缺失的每一端设计了五个侧翼引物。随后的PCR仅在出现缺失的情况下产生扩增子（如果没有缺失，片段长度超过15 kb，则不进行长程PCR）。对所有可能的引物组合进行了测试，并使用约610个核苷酸的扩增片段进行Sanger测序。（正向引物：5′-TCCTTCCACACATACCATC；反向引物：3′-GAATACTGATACCACAACACACACACA）。然后将得到的序列用于BLAT查询人类基因组序列hg18参考。对于重复，断点来自aCGH映射实验。

结果

本研究的总体工作流程如图所示1最初，共有2891个SNP数组6.0 CEL文件（1121名德国UC患者/1770名匹配对照）接受CNV调用，在剔除原始数据质量、每个样本调用率、种族血统和相关性方面的异常值后，剩下2466个样本（902例/1564名对照）。主要目的是确定UC患者中罕见的变异，这些变异在对照组中不存在或代表性不足。因此，在至少三种情况下，在没有对照的情况下，在主要样本中将感兴趣区域定义为含有CNVs的基因组片段。这个选择标准是基于对原始数据图的检查，其中单重和双重预测事件中有太多假阳性。此外，当至少五例病例包含相应事件时，还包括对照组中一名携带者的缺失或重复。排除了两个以上对照组中发生的CNV。在此设置下，通过使用我们的数据挖掘工具CNVineta进行筛选，发现样本产生了151个CNV区域。然后手动检查这些区域，并在以下情况下丢弃CNV区域：；预测事件与已知常见CNV重叠；具有复杂的断点模式；由少于10个探针集覆盖或跨越较大的基因组缺口（例如，如果预测的CNV包含的缺口大于阵列探针覆盖的部分）。手动检查后，仍有24名候选人（14名删除，10名重复）Z轴-分数，对数R（右）比率和B等位基因频率轨迹（附加文件1：图S1）。然后在两个独立队列中评估这24种CNV的状态；WTCCC2样本（英国形式），具有从Affy6.0强度数据中调用的CNV基因型，以及通过TaqMan CNV测定通过定量PCR对所选CNV进行基因分型的德国队列（453名UC患者，1377名对照）。在英国队列（2394例，4886例对照）中，在所评估的24个CNV中，两个重复事件（单拷贝增益）是唯一表现出与发现小组相同分布趋势的变体，即与对照组相比，在病例中更具代表性；三个病例在7p22.1处携带119 kb的大重复区域，无对照组（发现面板中为3/902例，0/1564对照组），8q24.3处携带134 kb重复区域，病例中0.21%的重复出现率，对照组为0.04%，双侧Fisher精确P（P） = 0.058 (P（P） = 发现0.018）。（表1，其他文件1：表S1）。然而，这两种重复在德国复制小组中并不相关，因为从这两种变体的1830个样本（病例+对照）的基因分型来看，只有一个个体（UC病例）携带重复（Dup8q24.3）。此外，在德国复制小组跟踪的24个CNV中，13q32.1（chr13:94781525-94797285）有15.8 kb的缺失（单拷贝丢失），再现了与名义P（P）-0.005的值(P（P） = 发现时为0.027）。（表1，其他文件1：图S2）。Del13q32.1与WTCCC2样本中的UC无关。对于该缺失和上述两个重复，我们进行了验证步骤，通过TaqMan分析（附加文件1：图S3）。此外，我们更精确地绘制了这3个CNV的物理范围，并且超出了Affy6.0的分辨率。图2显示了这3个CNV事件的区域图，其断点通过定制的高密度a-CGH解决。这3种CNV的状态在一个基于affy6.0的挪威小样本和一个立陶宛样本（445例，1140例对照）中通过相应的TaqMan CNV分析进行了基因分型（附加文件1：图S4–S6）。综合研究范围内的Fisher精确检验P（P）-13q32.1缺失值为1.2×10⁻³(或 = 2.64），7p22.1的复制有一个P（P）-值2.7×10⁻³(或 = 8.41）和8q24.3的复制P（P）-值8.7×10⁻⁴(或 = 4.62). 表1列出所有面板频率以及组合频率P（P）-根据“罕见变量的大型分析”方法（M.A.R.V）计算的值[29]合并本研究不同小组的数据。

图1

分析工作流。使用Affymetrix power tools（APT）处理德国（发现）样本和WTCCC2（英国复制）样本的Affmetrix 6.0数据集。样本清洗基于州身份（IBS）和主成分分析（PCA），以排除非白种人样本和亲属。其余数据集已转换为CNVineta格式。在对德国发现样本中的罕见CNV进行筛查后，在病例中发现151个CNV过度表达，其中14个缺失，10个重复在人工检查后仍然存在。这24个CNV在两个独立的复制样本中进行了进一步评估，一个是德国的，另一个是英国的（WTCCC2）。Dup7p22.1和Dup8q24.3仅在英国（Affy6.0）样本中相关，而Del13q32.1仅在德国（TaqMan）样本中复制。Sanger测序完成了缺失的精细映射，而定制阵列CGH用于两个重复。在挪威样本（Affy6.0）、立陶宛样本（TaqMan）和之前发表的研究中的各种欧洲个体的对照样本中，进一步评估了3种相关CNV的状态。的详细信息生物信息学控制（来源、基因分型平台和三个CNV区域的探针覆盖率）见附加文件1：表S2。M.A.R.V（罕见变量的大型分析）方法用于合并不同面板的数据

表1关联统计汇总

图2

Del13q32.1的区域图(一)，重复7p22.1(b条)和Dup8q24.3(c（c）). 对于每个CNV，SNP6.0阵列强度数据（下面板）、自定义aCGH（中面板）和ENCODE注释（上面板）都是可视化的。RefSeq基因显示在SNP阵列强度面板中，水平橙色线表示反向基因，紫色线表示正向基因。红色水平条表示已删除段的预测，而蓝色条表示重复。一chr13:94781525-94797285上游的15.8 kb缺失ABCC4公司和CLDN10型.b条chr7:5786323-5905210的119 kb重复包含了基因的整个长度ZNF815型和OCM公司，和部分重叠CCZ1型和RNF216。 c（c）8q24.3（chr8:140390975-140524875）处的134 kb大型重复数据位于KCNK9公司在受复制影响的基因组区域注释了顺式调节元件的发病高峰（140450 kb）

对于Del13q32.1，通过高密度a-CGH进行精细定位，然后进行Sanger测序，在缺失片段的两个断点处鉴定出序列基序5′-GATCAC-3′。由于删除两侧有16个高度相同的铝重复，很可能非等位同源重组（NAHR）是事件的潜在机制[30]. 我们进一步分析了该缺失的两个邻近基因的表达水平，即ABCC4公司和CLDN10型在两名携带缺失基因的患者和60名没有缺失基因的UC患者的炎症肠道活检中（附加文件1：图S7）。有趣的是CLDN10型与炎症粘膜中非携带者的中位表达相比，两例缺失携带者中的表达均显著降低。

讨论

利用我们现有的用于CNV呼叫的UC-GWAS数据集以及我们内部开发的CNV数据挖掘工具，我们对与UC相关的罕见CNV进行了全基因组扫描。在对四个独立病例对照样本进行后续基因分型后，我们发现与对照组相比，UC患者中有三个罕见的候选CNVs、一个缺失和两个重复的比例过高（具有标称意义）。Del13q32.1，作为chr13:94781525-94797285的15.8 kb单拷贝丢失，显示了发现面板中的关联趋势，这在源自德国的所谓TaqMan复制面板中重现。然而，在WTCCC2-UC组中未观察到Del13q32.1与疾病表型的相关性。发现小组的UC患者（与对照组相比）中Dup7p22.1（chr7:5786323-5905210）和Dup8q24.3（chr8:140390975-140524875）这两个重复出现率过高，并且在WTCCC2队列中重复了这一趋势，尽管在德国和立陶宛起源的两个独立复制小组中没有发现这些重复的关联。我们进一步评估了这三种CNV在生物信息学数据集包括6727名欧洲血统的无关对照个体。在这些样本中观察到的三种变体（Del13q32.1的4505种变体中有5种，Dup7p22.1的5788种变体中有1种，Dup8q24.3的6727种变体中有3种）的罕见出现与我们的发现和复制面板中的低频率一致。

值得一提的是，这里使用的CNV发现平台（Affy6.0）虽然具有较高的探针密度，但检测大于~15 kb的CNV的分辨率有限[9]. 因此，我们的研究中尚未检测到可能较小的CNV事件（<15 kb），可能与疾病相关。另一方面，与人类基因组中常见CNV（~3 kb）的中位数较小相比[8,10]，此处确定的三种罕见CNV是中到大型基因组改变，涉及多基因区域，可能导致导致疾病发病的功能性（有害）后果。

Dup7p21.1确实位于一个基因非常丰富的区域，部分包含其全长（ZNF815，OCM）或重叠（RNF216，RSPH10B）。Dup8q24.3是该基因上游134 kb的大重复KCNK9公司(任务3），编码钾通道蛋白亚家族K的一个成员。关于任务3（TWIK相关酸敏感钾）自身免疫性炎症发病机制中的经络[31,32]在病理生理条件下将它们从“单纯背景”通道转换为关键调节剂。

Del13q32.1位于基因上游33.7 kbABCC4公司（ATP装订盒，子家族C，成员4）也称为MRP4型（多药耐药相关蛋白4），上游78.5 kbCLDN10型(克劳丁10). ABCC4/MRP4属于跨膜蛋白的一个大家族，在调节cAMP依赖的信号通路中发挥重要作用[33]以及人类树突状细胞迁移，从而调节免疫反应[34]. MRP蛋白在人类肠道不同区域的表达图谱显示，与回肠相比，MRP在结肠中的表达更高[35]. 有趣的是，该蛋白家族的一个成员，即ABCC1/MRP1，以前与严重UC相关，但与CD无关[36]. 另一个相邻基因CLDN10型，编码紧密连接粘附蛋白也是UC分子发病机制的一个有趣候选。紧密连接主要有助于肠上皮的完整性。屏障破坏是炎症性肠病两种表型（CD和UC）的主要特征之一，参与上皮屏障维持的各种基因与IBD有关[37–39]. 此外克洛丹2、5和8已被证明可导致活动性CD的不连续紧密连接和屏障功能障碍[40]. 为了探讨缺失对两个邻近基因表达的可能影响，我们检查了两个携带缺失的无关患者的肠道活检样本。与CLDN10型缺失缺失型UC患者在炎症粘膜中的表达水平，缺失患者的活检标本显示出很低的表达水平。然而，这种差异表达对于ABCC4。由于缺失变异的稀少性，没有更多来自不同患者的活检来进一步验证缺失对这两个基因表达的影响。然而，在删除区域的ENCODE注释中显示的顺式调节元件（如转录因子结合位点）的存在可能是对这种差异的一种解释CLDN10型我们在这里观察到的表情。

总的来说，我们发现这项研究中罕见的候选CNV，通过对基本原始数据的目视检查验证，是真正的阳性CNV。所有三个相关的CNV都可以通过独立的方法进行技术验证，并在独立的样本集中进行跟踪。与常见变异相比，罕见变异的疾病相关性很难通过经典关联统计进行评估。这些变异的低频率阻碍了通过适度或中等样本量在全基因组水平上检测相关性。当这些变异体的外显率不高时，功率限制甚至可能增加。在本研究中，发现样本和至少一个复制面板中提到的三个拷贝数变体中的每一个都存在与UC相关的趋势，然而，需要更大的病例对照样本提供更高的统计能力来自信地评估这些变体的疾病风险。

结论

我们的多步骤病例对照分析引入了罕见的结构变异，这些变异可能会增加UC的风险。虽然需要在更大的疾病队列中进行进一步的随访研究以及功能实验分析，以最终验证这三个基因座的疾病相关性，但我们表明，现有的GWAS数据集可能仍有助于扩展常见复杂疾病的遗传病因知识。