PGRMC1磷酸化影响细胞形状、运动、糖酵解、线粒体形态和功能以及肿瘤生长

摘要

背景

孕酮受体膜成分1（PGRMC1）在许多癌细胞中表达，并与有害的患者预后相关。它含有磷酸化酪氨酸，在进化上先于后胃造口原肠形成和组织分化机制。

结果

我们证明，在MIA PaCa-2（MP）细胞中操纵PGRMC1磷酸化状态可产生广泛的多效性效应。相对于过度表达血凝素标记野生型（WT）PGRMC1-HA的亲代细胞，表达PGRMC1-HA-S57A/S181A双突变体（DM）的细胞表现出参与能量代谢和线粒体功能的蛋白质水平降低，葡萄糖代谢改变，表明Warburg效应受到调节。这与PI3K/AKT活性增加、细胞形状改变、肌动蛋白细胞骨架、运动性和线粒体特性有关。一个S57A/Y180F/S181A三重突变体（TM）表明Y180参与PI3K/AKT激活。Y180F突变强烈抑制NOD-SCIDγ小鼠皮下异种肿瘤的生长。在其他地方，我们证明这些细胞的代谢、突变发生率和表观遗传状态发生了变化。

结论

总之，这些结果表明，PGRMC1磷酸化状态的突变操作具有广泛的多效性效应，与癌症和其他细胞生物学相关。

汇总报表

PGRMC1磷酸化位点突变导致多效性塑性相关变化，包括线粒体形态和功能改变、PI3K/AKT活性、迁移和葡萄糖消耗。有效的小鼠异种移植瘤形成需要Y180。

背景

孕酮（P4）受体膜成分1（PGRMC1）是一种细胞色素b₅-具有多种功能的相关血红素结合蛋白，包括与细胞色素P450酶的相互作用。简言之，（读者参考之前的综述）非综合性PGRMC1功能包括膜转运、P4反应性和类固醇生成、生育、脂质转运、神经轴突迁移、突触功能和抗凋亡。其亚细胞定位可以是细胞质、核仁、线粒体、内质网、细胞质小泡或细胞外[1,2,三]. 它参与G1检查点和有丝分裂期间的细胞周期过程[4,5,6,7,8,9]PGRMC1表达升高与多种类型癌症预后不良有关[2,10,11,12,13,14,15].

PGRMC1中Src同源2（SH2）和Src同系物3（SH3）蛋白的预测结合位点基序可能通过相邻酪蛋白激酶2（CK2）共有位点的磷酸化负调控[2,16,17]. 然而，虽然CK2敲除导致PGRMC2相应C末端CK2位点磷酸化降低，但在S181处的PGRMC1磷酸化不受C2C12小鼠成肌细胞CK2敲除了的影响[18]. 这些和Y180都可以在体内磷酸化，并构成潜在的调节信号模块[19].

我们假设PGRMC1是一种信号枢纽蛋白，对细胞生物学具有广泛影响[2,19,20,21]. Y180/S181磷酸化的高度保守基序在动物进化早期与原肠胚形成的胚胎组织者（例如Spemann-Mangold组织者）同时出现，并且早于后肠口的进化[20,22]. 由于首次获得S181的生物体的所有后代都表现出双侧身体对称性，这种突变早于控制细胞生长和分裂的规则，导致双侧身体平面和更多类型的组织。癌症中产生和维持细胞和组织类型分化状态的机制经常受到干扰[23]. 因此，PGRMC1酪氨酸磷酸化可能强烈影响哺乳动物细胞的功能和分化状态。

本研究是由我们发现雌激素受体阳性和阴性乳腺癌之间PGRMC1磷酸化状态的差异引起的[24]. PGRMC1在导管癌原位乳腺病变的缺氧区被诱导的时间和地点正好是细胞需要转换到糖酵解代谢的时间和地点，即Warburg效应，这使我们预测了PGRMC1的Warburg介导作用。此外，PGRMC1 S57A/S181A双CK2位点突变体（DM，图1a） 使过氧化氢处理得以存活[24]. 萨比尔[25]最近有报道称，PGRMC1在HEK293细胞中诱导了类似Warburg效应的P4依赖性代谢变化，这与PGRMC1稳定性、翻译后修饰和亚细胞位置的变化有关。妊娠期糖尿病胎盘P4依赖性糖代谢从有氧向无氧转变的相关调节支持了PGRMC1对葡萄糖代谢的调节[26]与胰岛素受体和葡萄糖转运蛋白相关[27]以及可能参与（基于AG-205敏感性）P4介导的神经元糖酵解增加[28].

图1

胰腺癌细胞形态受PGRMC1磷酸化状态的影响。一为该图构建的PGRMC1-HA蛋白。TMH：跨膜螺旋。HA：C端3x血凝素标签。b条通过western blot检测外源性PGRMC1表达水平（上面板）。通过量化β-肌动蛋白（下面板）来控制平均负荷。结果显示（A）中每个质粒有三个完全独立的稳定转染细胞系。开放箭头：外源性PGRMC1-HA（例如）。阴影箭头：内源性PGRMC1（结束）。填充箭头：β肌动蛋白。分子量阶梯为Bio-Read 1610377双Xtra标准。c（c）方框图量化了（B）的复制凝胶，信号标准化为来自相同相应通道的β-肌动蛋白。n个 = MP和4车道n个 = WT、DM和TM为6（每种情况下各生产线1-3的复制品）。除MP中的外源带外（ANOVA，post-hoc Dunnet’s T3），无显著差异（ns）。d日Western blot定量检测HA标记的外源性PGRMC1，B后用抗HA抗体检测PGRMC1。分子量阶梯为Abcam ab116028预染蛋白阶梯。e（电子）PGRMC1突变蛋白表达改变MIA-PaCa-2细胞形态。用FITC标记的抗HA抗体（anti-HA）对表达PGRMC1-HA的稳定细胞（来自B的相应系1）或MP细胞进行染色，并通过共聚焦显微镜成像。DNA用DAPI染色。细胞也在微分干涉对比（DIC）显微镜模式下成像。相应的左侧面板显示了所有3个通道的合并图像。（f）双突变体和三突变体（E）的圆形表型在125 μM ROCKI添加，但不是通过添加DMSO车辆控制

我们之前观察到MIA-PaCa-2胰腺癌（MP）细胞[29,30,31,32]当DM蛋白表达时，表现出明显的形态和代谢变化[33]. MP细胞在培养中以混合粘附群体的形式存在，具有细长的“成纤维细胞样”形态，少数群体具有圆形形态和气泡状突起，一些多细胞团，以及一些圆形悬浮细胞。他们经历了上皮-间充质转化[34]，并可进一步经历间充质-变形体转变（MAT），这需要Rho激酶（ROCK）依赖的形态变化，从“细长”的间充质细胞转变为圆形变形体细胞[35].

在这里，我们通过突变检测改变的PGRMC1磷酸化状态对MP细胞的影响，以了解体外PGRMC1依赖性信号，揭示Y180的重要作用。我们的目标是初步表征两个DM假定负调控磷酸化位点S57和S181的突变对细胞生物学的影响，以及突变Y180，Y180形成假定SH2靶基序的中心，以测试DM效应需要Y180的假设。重要的是，本研究扩展到体内系统，特别是皮下小鼠异种移植瘤发生模型，以解决Y180在复杂环境中肿瘤发展的需求。在配套出版物中[36]，我们描述了与本研究中描述的PGRMC1磷酸化突变体相关的代谢、基因组突变率和表观遗传学基因组CpG甲基化水平的差异。

结果

PGRMC1磷酸化状态改变细胞形态

我们用血凝素（HA）表位标记的PGRMC1-HA质粒稳定地转染MP细胞，包括野生型（WT）序列[37]、S57A/S181A DM[24]或一种新的S57A/Y180F/S181A三重突变体（TM），其去除了Y180的磷酸受体[16,19,20]（图。1a） ●●●●。每组三个独立的稳定细胞系均表达32 kDa 3xHA标记的外源性和24 kDa内源性PGRMC1物种，而只有24种 MP细胞中存在kDa物种（图。1b-d）。这两个物种的摩尔比大约相等，抗HA抗体只检测到32个 kDa物种（图。1d） ●●●●。我们认为，生物三倍体之间的任何一致性差异都应归因于PGRMC1-HA突变，而不是克隆伪影。随后的实验使用每个PGRMC1-HA条件下的三倍细胞系1-3进行。然而，请注意，MP细胞没有经过潮霉素选择稳定整合质粒，因此WT/MP比较中的细胞存在两个变量的差异（选择和PGRMC1-HA）。我们将分析重点放在WT、DM和TM细胞之间的比较上。

与MP细胞一样，新接种的WT细胞表现出主要为细长的细胞形态，并有一些圆形细胞。DM和TM细胞主要呈圆形形态（图。1e） 这让人想起了MP细胞的MAT报告[35]. 72岁之后 培养h后，DM和TM培养物中圆形细胞的比例降低，但仍高于WT或MP（未显示）。用DM和TM质粒（但不是WT）瞬时转染导致整个细胞群的细胞圆整度增加24 转染后h（数据未显示），表明外源性PGRMC1-HA的磷酸化状态影响细胞形态。

PGRMC1依赖性形态学改变需要rho激酶

ROCK通路是变形虫表型和迁移所必需的，其抑制作用逆转MP细胞中的MAT[35,38]. ROCK抑制剂（ROCKI）逆转了DM和TM的圆形表型，使其变长（图。1f） 支持形态学转变涉及肌动蛋白组织改变的假说。目前尚不清楚该过程是否真的是MAT。

PGRMC1磷酸化影响细胞运动和侵袭

为了进一步研究PGRMC1-HA磷酸化突变体引起的细胞可塑性，我们通过划痕试验检测了细胞运动性[39]. MP细胞迁移率最低，而DM细胞迁移率明显高于其他细胞系（图2a-b，文件S1). DM细胞主要以圆形细胞迁移，使用延伸的丝状伪足和小伪足，然而，少数扁平细胞表现出更明显的伪足。视频图像显示，这些细胞形状可以快速相互转换（文件S1C） ●●●●。相反，DM细胞通过Geltrex假基底膜的侵袭能力最低（图。2c-d）。

图2

PGRMC1磷酸化状态影响运动和侵袭。一在划痕试验中，DM细胞表现出更强的运动能力。36天后划痕试验的代表性结果 细胞迁移h。对每幅图像的划痕空白区域的方框区域中的细胞进行计数。b条划痕分析细胞迁移结果。细胞迁移到（A）中描述的多个复制的划痕空白框区域的框线图。n个 = 12（MP）或4次复制WT和TM的子系1-3(n个 = 三 × 4 = 12). 该表显示了采用事后邓内特T3的单因素方差分析结果第页-值。细胞迁移的视频文件在文件中提供S1.c（c）在Geltrex侵袭试验中，DM细胞的侵袭性降低。transwell嵌件下表面晶体-叶绿体染色细胞的代表性图像。d日入侵检测的箱线图由SPSS软件生成的（C）重复数据得出。n个 = 30（MP）或10次复制WT和TM的子系1-3（n = 三 × 10 = 30). 表中显示了Kruskal-Wallis第页-两两比较的值

PGRMC1磷酸化引起广泛变化

通过结合信息依赖性采集（IDA）和数据独立性SWATH-MS（所有理论质谱的顺序窗口采集）采集，蛋白质组学在至少一个含有至少2个肽的样品中可靠地鉴定了总共1330个蛋白质。结果以文件形式提供S2系列大约50%的变异是由PC分析中的两个主要成分（PC）解释的，这两个成分大致对应于“核糖体和翻译”（PC1，将MP和DM与WT&T分离）和“mRNA剪接和加工”（PC2，将MP和WT与DM&T分离）（图。S1A、 文件第3章). 在已鉴定的蛋白质中，243种在与第页 < 0.05（t检验），其中235个经受了PC多样本校正。这243个蛋白质的热图聚类（图三，文件S6系列)揭示了一系列蛋白质，这些蛋白质强烈区分了不同的PGRMC1-HA诱导条件。生物复制紧密地聚集在同一细胞类型的分支中，分支之间的距离很大。我们的结论是，这些差异主要是特定的PGRMC1-HA突变依赖效应。

图3

SWATH-MS蛋白质组学结果的通路分析。路径在adjP>处显著丰富 “红色”和“蓝色”差异蛋白（红色 = 较高丰度，蓝色 = 低丰度，白色 = 等丰度）。左上角：243个显著差异蛋白质的蛋白质组热图。右上角给出了WebGestalt路径的颜色代码。底部：网络格式塔路径映射。此图像来自文件S6系列包含所有蛋白质和网络格式塔通路身份

四种样本类型之间蛋白质丰度的六种比较结果[1）MP v.WT，2）MP v.DM，3）MP v.SM，4）WT v.DM，5）WT v.TM和6）DM v.TM]提供了每一对比较中显著差异丰富的蛋白质列表（文件S2系列). 进行WebGestalt富集分析，以确定显著丰富或不丰富的途径或特征（分别为文件B列中每次比较的“红色”和“蓝色”蛋白质列表S4系列)Benjamini–Hochberg调整后的六项比较中的每一项第页-值（adjP） < 至少一次两两比较的0.001水平。WebGestalt映射特征（文件第5章)根据文件中的热图绘制S6系列（有关主要WebGestalt数据，请参阅文件第5章和文件S6系列). 结果与图中的243蛋白热图进行了示意性映射。三使用WebGestalt在adjP的任何样本间比较中检测到的所有路径< 0.001水平，包括在adjP的所有12个比较中在这些途径中检测到的所有蛋白质< 文件中相应红色和蓝色蛋白质列表的0.1级S4系列.

WT PGRMC1-HA蛋白诱导参与能量代谢的许多蛋白质丰度增加，包括参与蛋白质降解的蛋白酶体成分，以及氨基酸、碳水化合物和脂肪酸分解代谢的途径（图。三). 这些蛋白质被标注为细胞质和线粒体。WT细胞中过氧化物酶体和溶酶体蛋白也上调。与MP和DM细胞相比，WT和TM细胞中普遍缺乏一系列可能参与核糖体识别mRNA、tRNA氨酰化、核糖体蛋白翻译和伴侣介导的蛋白折叠的蛋白质（图。三，文件S6系列). 脂肪酸和葡萄糖代谢酶的许多变化类似于胰岛素/胰高血糖素系统的代谢调节作用。

在WT和DM细胞的比较中，上述许多蛋白质被反向调节（图。三). 能量代谢的蛋白质组和一些与翻译相关的蛋白质在DM中含量较低，而T复合物伴侣复合物以及一些核输出蛋白和输入蛋白在DM细胞中升高（图。S1D-E）。一些差异富集途径是WT与DM比较的特有途径。与血红素代谢相关的不同酶同时上调和下调，而与糖胺聚糖代谢相关的酶在WT中相对于DM上调（图。三，文件S6系列).

线粒体蛋白质在WT细胞中所占的蛋白质比例比DM细胞更丰富。有趣的是，WT细胞中许多细胞质蛋白比DM细胞中更丰富（图。三，文件S6系列). 我们还注意到WT和TM细胞中ATP合成酶组分的丰度较高（图。S1C） ，涉及伴侣蛋白和微管功能的蛋白质的变化（图。S1D） 以及一组参与主要组织相容性复合体抗原处理和呈现以及蛋白水解的蛋白质（图。S1F） ●●●●。后者在DM细胞中减少，可能与其侵袭性降低有关（图。2c-d），需要进一步确认。

考虑每种细胞类型的极端（最高和最低丰度）差异蛋白质，可以对生物学提供有用的见解（图。S2系列). WT和TM细胞在最丰富的蛋白质子集中表现出重叠，包括PSIP1转录辅激活子、TOM40线粒体导入通道以及催化磷脂酰肌醇生物合成的CDIPT（图中的圆圈）。S2系列). 富含WT的蛋白质之一是磷酸果糖激酶（UniProt P08237），它对糖酵解的限速反应和第一步进行催化。最丰富的DM蛋白包括角蛋白19，泛素相关蛋白2样，参与干细胞维护[40]以及甲基-CpG-结合蛋白2，在WT和TM细胞中更为丰富，表明PGRMC1介导的基因组甲基化变化（见随附论文[36])。最不丰富的蛋白质在细胞类型之间有令人惊讶的混合重叠（图中的三角形）。S2系列). TM和WT细胞具有低水平的Ephrin A型受体2，这是一种酪氨酸激酶受体，在DM（和MP）细胞中含量较高，但在这些细胞中不是最丰富的蛋白质。WT显示出低水平的信号识别粒子54 kDa蛋白，提示内质网蛋白和AL1A1视网膜脱氢酶的翻译发生改变。这一点值得注意，因为DM和TM都表现出参与维甲酸形成的AL1A3 NAD依赖性醛脱氢酶水平较低，表明通过突变S57/S181来改变维甲酸代谢。DM和TM的ApoC3和ApoA1水平也很低（图。S2系列)可能反映了这些细胞合成低脂蛋白的共同作用。总之，我们的蛋白质组学分析揭示了参与不同细胞过程的酶的丰度存在显著差异，其中许多酶与癌症生物学直接相关。WT和TM差异蛋白质组学图谱的相似性表明，DM突变激活了在很大程度上依赖Y180的信号传递过程。（DM和TM蛋白之间的唯一区别是Y180的磷酸受体氧）。总的来说，本研究表明PGRMC1磷酸化状态在MP细胞中发挥更高阶的作用。为了评估路径分析的有效性，对选定的富集路径进行了功能检查，如下所述。

ERR1活动不受PGRMC1的直接影响

通过通路富集分析预测，一些与能量代谢相关的线粒体蛋白受到雌激素受体相关1（ERR1）转录因子的调节（图。第3章A） 在DM细胞与两种WT（adjP = 0.004）和TM（adjP = 0.04）（文件S4系列). 由于ERR1是一种类固醇受体，我们通过shRNA降低WT细胞中ERR1的水平来研究PGRMC1和ERR1生物学之间的潜在联系。第3章B-D）。SWATH-MS蛋白质组学显示，ERR1确实调节了WT和DM细胞之间差异丰富的基因，如图所示。第3章A和图。三然而，PGRMC1磷酸化状态仅影响ERR1驱动蛋白的一个子集的丰度。

PGRMC1磷酸化影响PI3K/AKT信号传导

引人注目的是，图中与PI3K/AKT活性相关的蛋白质。三和文件S6系列被文件披露第5章TM细胞的丰度较低（图。S1B） 相对于MP（adjP = 0.0063），重量（调整值 = 0.0001）和DM（调整 = 0.0002）个单元格。我们用反相蛋白阵列（RPPA）检测了两种AKT底物的磷酸化状态。BAD在S112被两个PKA磷酸化[41]和AKT在S136[42]. 然而，DM和TM之间BAD S112磷酸化没有显著差异（图4a） TM细胞中磷酸化S136水平低于所有其他细胞(第页 < 0.001，图。4b） ●●●●。由于BAD信号太低（未显示），因此不可能相对于BAD本身可靠地量化这些水平。AKT的最佳证明底物之一是糖原合成酶激酶3β（GSK3β），它在S9上被AKT磷酸化，导致GSK3α失活[43]. 与MP细胞相比，WT中磷酸化GSK3βS9的水平升高，通过去除DM突变中的抑制性CK2位点再次升高，并通过TM突变细胞中Y180的进一步突变降低（图。4c-e）。这些结果加强了通路富集分析所产生的模型，即在DM细胞中激活的PI3K/AKT通路需要磷酸化的PGRMC1 Y180，因此在TM细胞中减弱。

图4

蛋白质和磷酸化蛋白质水平的RPPA测量。一-d日,（f）-小时根据6次重复测量绘制指示抗体（在方法中描述）的平均RPPA标准化荧光强度（NFI）。NFI标准化为蛋白质含量。使用单向方差分析对正态分布数据进行统计计算，并对等方差（所有方差均相等）进行事后Bonferroni（BF）。对于非参数数据，计算了24个无关样本的Kruskall-Willis（KW）成对比较*第页 < 0.05; **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001. 由于信号值小于背景值的三倍，因此无法准确测定非磷酸化BAD水平。e（电子）D相对于C的平均NFI比率。标签如下

PGRMC1磷酸化影响FAK激活和HSF水平

路径映射（文件第5章)提示转录因子HSF1活性可能参与WT与DM（adjP = 0.006). HSF1与黏附斑激酶（FAK）活性有关[44]FAK活性依赖于Rho/ROCK信号传导，后者影响局部粘附动力学和肿瘤细胞迁移和侵袭[45]. RPPA测量表明，WT和TM中FAK1酪氨酸磷酸化和HSF1水平增加均显著升高（图。4f-h）。值得注意的是，该图谱与图。三而不是图中依赖岩石的圆形形态。1d、 再次验证了路径预测。值得注意的是，FAK活性与运动性增加有关[45]其磷酸化在WT和DM细胞之间没有显著差异，表现出运动改变。TM细胞中FAK磷酸化升高，其迁移率低于DM，可能是由于FAK的反馈调节。这一基础值得进一步研究，但可能反映了PGRMC1磷酸化状态对迁移过程的影响。

DM中升高的Vinculin是细胞运动所必需的

肌动蛋白细胞骨架的蛋白质在DM细胞中更为丰富（图。S4系列A） 其中一种是vinculin（图。S1B） ，一种与结肠癌细胞分化状态、运动以及PI3K/AKT、E-cadherin和β-catenin调节的WNT信号相关的肌动蛋白丝状结合蛋白[46,47]. 我们通过shRNA减弱MP、WT和DM细胞中的vinculin水平。与MP细胞相比，杂乱shRNA控制（shScr）DM细胞的划痕试验运动性升高。然而，在抗长春新碱shRNA（shVCL）细胞中，MP和DM细胞的活力都降低了（图。S4系列). 这些结果与肌动蛋白细胞骨架中蛋白质水平升高一致（图。S4系列A） 直接有助于增强DM细胞的运动能力（图。1f-g）。然而，除了vinculin之外，这一假设尚未得到验证。未来的研究应检查PGRMC1信号对肌动蛋白细胞骨架特性的影响。

PGRMC1影响葡萄糖代谢

图三预测了糖酵解活性的变化，我们通过葡萄糖摄取和乳酸生成测定进行了研究。所有PGRMC1-HA蛋白（WT、DM和TM）的表达导致这两个指标相对于MP的水平显著降低，DM细胞的水平最低（图5a-b）。目前尚不清楚MP/WT差异是由于PGRMC1-HA表达还是WT细胞的潮霉素选择所致。然而，对于其他细胞，PGRMC1磷酸化状态调节这两种特征，与最近报道的PGRMC1对Warburg代谢的调节一致[25]我们的数据表明可以通过PGRMC1磷酸化状态进行调节。

图5

PGRMC1磷酸化状态影响葡萄糖摄取、乳酸分泌和线粒体功能。一使用Cayman“糖酵解”试剂盒的细胞对葡萄糖的摄取。箱线图表示四个技术复制品，每个复制品对应于WT、DM和TM条件下独立稳定转染的子系1-3（图。1). 即n = 4 × 三 = 每个条件12个。对于MP细胞，重复12次MP细胞系。所有方法（Kruskal-Wallis第页 < 0.0001，两两样本Kolmogorov-Smirnov检验第页 < 0.0002).b条细胞系的乳酸分泌。详细信息如下（A），除了测量了每个稳定细胞系的副本（n = 三 × 2 = 每种情况6个）。细胞间类型比较测试表明，所有两两比较的平均值彼此之间存在显著差异（ANOVA、事后Dunnet的T3、，第页 < 0.003），但WT-TM比较不显著(第页 = 0.211).c（c）线粒体的最大呼吸能力受PGRMC1磷酸化状态的影响。每个PGRMC1-HA突变条件WT、DM和TM的各自独立克隆稳定系C1的线粒体耗氧量。箭头表示添加ATP合酶抑制剂寡霉素、Δψm解偶联剂FCCP和电子传递链抑制剂鱼藤酮和抗霉素A的时间。OCR：耗氧率（每μg蛋白质标准化pmol/min），n个 = 5; 平均+/-标准差。

PGRMC1磷酸化影响线粒体功能

图三也暗示线粒体可能受到PGRMC1磷酸化状态的影响。萘酰亚胺黄素氧化还原传感器2（NpFR2）是一种靶向线粒体基质的荧光团。当被氧化时，其荧光提高约100倍，提供了线粒体基质氧化还原状态的测定[48]. NpFR2显示WT和TM细胞的基质比MP和DM细胞的基质氧化性更强（图。第5章A、 B），这与图中许多核编码线粒体蛋白的高表达相对应。三.

然后，我们使用荧光标记MitoTracker检测线粒体，其对线粒体的亲和力受线粒体膜电位（Δψm）的影响[49]. 流式细胞术显示，每种细胞类型中都存在两类线粒体结合细胞：低和高线粒体结合细胞（图。第5章C-E）。MP、WT和TM细胞的这些群体大致相等，然而，DM细胞在每个群体中的相对荧光水平总体较低。第5章C-D）和较高比例的细胞具有较高的MitoTracker结合（图。第5章C、 E）。值得注意的是，WT和TM细胞中较高水平的线粒体蛋白明显与线粒体主动呼吸引起的Δψm较高不一致。

相对于MP细胞，最大呼吸频率降低（图中为2至3倍）。5c） 通过表达DM或WT PGRMC1-HA，而不是TM细胞（图。5c） ●●●●。基底的相对剖面（图。第5章F） 和最大值（图。第5章G） WT和DM细胞的呼吸频率相似，TM细胞的呼吸速度介于MP细胞的呼吸速率。在三个独立的比较WT/DM/TM上观察到了这一情况。显示了包括MP在内的单个实验。我们得出结论，由于图中检测到的PGRMC1磷酸化状态，线粒体蛋白质的丰度发生了变化。三伴有线粒体功能改变。然而，这种关系并不简单，因为较低的葡萄糖摄取与较高的线粒体耗氧量或NpFR2氧化还原状态（复合物IV和抗氧化防御系统中超氧物泄漏率的函数）有关[50])可能涉及线粒体对质子的通透性改变或其他解偶联机制，例如胆固醇含量改变[21]和/或改变电子传输链属性。这一结果清楚地揭示了蛋白质组学研究所揭示的一个需要进一步研究的重要领域。

PGRMC1磷酸化影响线粒体形态和功能

通过测量线粒体含量（每个细胞的面积）、大小（周长）、形态或形状因子（FF）来进一步探索线粒体。FF是一个来源于单个线粒体面积和周长的参数，其中较高的值对应于比碎片线粒体更大程度的丝状[51,52]. 线粒体的代表性图像如图所示6a.每个细胞的线粒体数量差异很大，不同细胞类型之间没有发现显著差异（未显示）。在整个数据集中，细长细胞的线粒体面积更大，线粒体更大，平均FF（avFF）更大（Kolmogorov-Smirnov第页 < 0.0001; 未显示）。当根据PGRMC1状态（细胞类型）进行分析时，MP和WT细胞主要是伸长的，DM和TM主要是圆形的，正如预期的那样（图。6a-b）。我们检测到细长细胞的平均线粒体面积、周长或avFF在细胞类型之间没有显著差异，但圆形细胞类型在面积、周长和avFF的细胞类型之间有显著差异（图。6b） ●●●●。所有带有avFF的单元< 2.2细胞呈圆形，而所有avFF细胞> 2.6呈细长形状（图。6c） ●●●●。观察到的avFF相关的从圆形到细长细胞形状的转变对于除WT外的所有细胞都是离散的，发生在avFF = 2.4（MP）、2.2–2.6（WT）、2.7（DM）和2.6（TM）。值得注意的是，单个细长TM细胞也显示出TM的最高平均FF值（图。6c） ●●●●。全息断层延时视频[53]每种细胞类型显示活线粒体（文件第7部分). PGRMC1磷酸化状态可能通过影响细胞形状的相同机制影响线粒体含量、大小和FF（丝状程度），这与细胞骨架对线粒体形态和功能的拟议影响一致[54]. 我们的结论是，我们的蛋白质组通路分析揭示了线粒体中与生物学相关的功能差异，这再次表明了一个需要进一步研究的新领域。

图6

PGRMC1磷酸化同时影响线粒体和细胞形态。一图像显示，每种细胞类型的伸长或圆形细胞的形状因子（avFF）值接近平均值。显示了每个类别中得分的单元格数。所有细胞图像均按相同比例复制。b条伸长和圆形细胞(一)按细胞类型检查。左上角的面板显示了所有3个重复中每种细胞类型的三个独立生物复制细胞系的平均细长细胞百分比（n（∑_1–3))对应于（A）中给定的n个值。其余面板显示了面积、周长和FF各形状和类型类别中细胞的分布。Kruskal-Wallis分析显示第页 < 任何细长细胞类型比较（ns）之间均为0.05水平，而圆形细胞的所有细胞类型均表现出显著差异（Kruskal-Wallis，P（P） < 0.001). 随附的Kruskal-Wallis事后配对比较第页-圆形单元格的值在相应的表中给出。c（c）绘制的每个单元格的平均FF，包括单元格形状。细胞在圆形和细长形态之间转换的值（avFF 2.2–2.6）用虚线表示

皮下小鼠异种移植瘤生长需要PGRMC1 Y180

培养箱成像中未观察到不同类型细胞之间的细胞增殖差异（图7a） ，或重复MTT分析（未显示）。我们在携带WT、DM和TM亚系1–3的复制小鼠中建立了皮下异种移植瘤（例如4x系1、3x系2和3x系3、，n个 = 13每PGRMC1-HA条件），以及n个 = 5只小鼠，其细胞表达单个Y180F突变体[24]，或MP单元。TM和Y180F细胞产生的肿瘤明显小于WT或DM细胞产生的瘤（图。7b-c），表明PGRMC1 Y180是最佳肿瘤生长所必需的，并证明细胞对改变的PGRMC1磷酸化的反应强烈影响癌症生物学。所有WT、DM、TM和Y180F肿瘤组织均表达PGRMC1-HA蛋白（未显示），因此从注射细胞中产生。苏木精和伊红染色显示，细胞类型之间的组织学无明显差异（未显示）。

图7

PGRMC1 Y180促进小鼠皮下异种移植瘤的生长。一培养中细胞加倍时间没有差异。对每种情况下稳定细胞系1–3的复制进行测量，得出n个 = 6.细胞条件之间没有显著差异。b条每一类细胞产生的典型肿瘤。c（c）注射2 × 10⁶每个细胞系的细胞。对于WT、DM和TM，结果显示第2行和第3行各有4只小鼠，第1行有5只小鼠。MP和Y180F分别代表单个细胞系的5个重复。该框显示了成对的事后邓内的T3第页-单向方差分析后的值

讨论

我们报告了与PGRMC1-HA蛋白磷酸化状态相关的新生物学。1a、 它深刻地影响了细胞形态和迁移行为。从WT到DM的形态变化类似于MP细胞中的MAT，对ROCKI敏感（图。1d） ●●●●。DM和TM改变的形态依赖于激活的ROCK，这导致皮质肌动球蛋白变硬[55]. 在人脑胶质瘤细胞中，CD99的过度表达与MAT有关，导致形态圆整，Rho活性增加，迁移增强[56]. 这些特性表面上类似于我们DM细胞的表型（图。1然而，正如细胞迁移视频（文件S1). 在分子水平上，关于促进MAT和改变细胞运动的事件知之甚少[57,58,59,60]. 我们在这里提供了一个可能与MAT相关的过程的全局蛋白质组学表达研究，并表明PGRMC1磷酸化状态显著影响细胞形态和行为。

蛋白质组学途径富集分析表明，PGRMC1也影响线粒体，导致我们检测到功能和形态的改变（图。6). 先前的研究表明，PGRMC1与一系列线粒体蛋白共同进化[21]. MP和WT细胞中占主导地位的细长细胞形态与较高的丝状线粒体指数而非碎片线粒体指数有关。DM和TM细胞中以圆形形态和碎片线粒体较多的细胞为主（图。6). 线粒体功能的这种变化是由线粒体分裂和融合的相对速率改变所驱动的，分别导致线粒体断裂或延长的超管[61]. 线粒体碎片与病理状况有关，包括心血管和神经肌肉疾病、癌症、肥胖和衰老过程，主要与细胞分化改变有关[61]. 在WT和TM细胞中更丰富的蛋白质之一是Opa1（O60313）（文件S6系列)，一种已知专门调节线粒体分裂/融合的蛋白质，并且据报道与PGRMC1直接相互作用[62]. 这表明了未来的研究领域。

线粒体形态的最大驱动力似乎是细胞形状，反之亦然（图。6). 细胞骨架被认为影响线粒体功能和形态[54]和蛋白质组途径图谱表明细胞骨架发生了变化。WT细胞具有升高的微管蛋白1α（Q71U36）水平，以及降低的微管蛋白α-1C（Q9BQE3）、微管蛋白β-2A链（Q13885）、微管蛋白β-4B链（P68371）水平（图。S1E） 相对于DM细胞。与MP细胞相比，圆形DM细胞表现出更丰富的II型细胞骨架角蛋白8（P05787）、I型细胞骨架角蛋白18（P05783）和I型细胞框架角蛋白19（P08727）（这是上皮标记物[63])WT和TM细胞显示中间角蛋白水平（参见文件S6系列与图关联。三). 这些角蛋白丰度分布与DM细胞中富含肌动蛋白的细胞骨架途径中蛋白质水平的升高平行（图。S1B） ●●●●。我们最近证实，在MP细胞中，许多与肌动蛋白细胞骨架相关的蛋白与PGRMC1共同免疫沉淀[64]PGRMC1膜相关孕酮受体（MAPR）家族细胞色素b₅结构域包含预测卷曲线圈形成的区域，类似于几个肌球蛋白的区域[22]与PGRMC1对肌动蛋白相关功能的影响以及与肌球蛋白相互作用的蛋白质相互作用一致。

DM细胞也显示T复合物蛋白-1环复合物（TRiC，也称为CCT）中的蛋白质水平升高（图。S1E） ，有助于包括肌动蛋白和微管在内的蛋白质折叠，并影响失控的生长控制、凋亡和基因组不稳定性[65,66]. TRiC还有助于乳房的强制性生长/生存功能[67]和肝脏[68]癌症。TCP1（P17987，图。S1E） 乳腺癌中的表达受致癌PI3K信号的驱动[67]我们观察到DM细胞中PGRMC1依赖性PI3K/AKT活性和TRiC丰度升高（图。S1E） ●●●●。

总之，观察到的许多线粒体差异可能归因于细胞骨架特性的改变。然而，图。5和图。第5章与细胞形状不一致，表明PGRMC1也改变了由线粒体形态驱动的复杂致病过程。在这方面，我们注意到最近的观察结果，即PGRMC2介导血红素穿梭到脂肪细胞的细胞核，导致编码线粒体蛋白的基因转录改变[69]. PGRMC1可能在这些细胞中发挥相关作用，值得进一步研究。

结果如图所示。三（如文件所示第5章和文件S6系列)发现与DM细胞相比，WT细胞中F1催化域的ATP合成酶亚基β和F0质子孔域均上调（图。S1C） ●●●●。DM细胞的高Δψm可能与F0/F1 ATP酶质子通道的低水平有关（图。S1C） 导致相对低效的质子梯度清除。线粒体胆固醇降低内膜对质子的通透性，提高电子传递链产量的效率[21]. 新陈代谢的改变可能是由于PI3K/AKT通路的活性所致，这表明需要进一步的工作来解释观察到的反应的机制。

PGRMC1缺失影响SREBP-1/脂肪酸稳态系统[70]和PGRMC1影响胰岛素受体和葡萄糖转运蛋白的细胞表面定位[27]. 化学蛋白质组学表明，PGRMC2而非PGRMC1促进3 T3-L1前脂肪细胞与取代血红素的新型小分子发生功能增强相互作用[71]. 研究这种治疗是否模拟磷酸化的效果将是一件有趣的事情。（PGRMC2与PGRMC1 Y180和S181以及血红素螯合Y113具有同源性[20].)

我们的结果表明，DM细胞中的PI3K/AKT信号需要PGRMC1 Y180，这是与TM细胞的唯一区别。PGRMC1长期以来被认为是AKT活性的调节剂，具有细胞类型特异性作用[24,27,72,73,74,75,76]. 这通过去除DM蛋白中假定的抑制性CK2共识位点预测信号的激活[19,24]依赖于Y180，因为TM（通过单个氧原子与DM不同）表现出的蛋白质表达谱与WT比DM更相似（图。三). 此外，我们评估皮下肿瘤生长的体内研究证实了Y180在完整生物系统中的重要性，从而支持并扩展了我们的体外观察，以揭示Y180的核心重要性（图。7). 由于Y180在真虫动物中的高度保守性[22]，这些结果可能与其他物种和多种人类疾病有关[2]. 在配套论文中对这些细胞的甲基组学研究中，TM/DM比较中最显著下调的KEGG通路是PI3K-AKT[36]，与肿瘤生长所需的需要PGRMC1 Y180的PI3K/AKT激活一致（图。7).

有趣的是，人类多能干细胞（hPSCs）中PGRMC1的敲低导致GSK3β抑制性磷酸化增加[77]. 值得检查该系统中PGRMC1的磷酸化状态，其中PGRMC1抑制p53和WNT通路以维持hPSC的多能性。与我们的结果类似，这些作者得出结论“PGRMC1能够抑制多谱系命运规范所需的广泛网络。”我们的假设表明，PGRMC1 Y180磷酸化和PI3K/AKT活性可能与某些癌症中观察到的GSK-3βSer9磷酸化和β-catenin信号通路升高有关[47].

我们最初的假设与PGRMC1的差异磷酸化有关，在空间和时间上可能与Warburg效应的调节有关[24]. 值得注意的是，Warburg效应类似于干细胞样代谢的逆转[78]. 当这篇手稿正在准备中时，Sabbir表明HEK293细胞中PGRMC1翻译后修饰状态对P4处理有反应，伴随着PGRMC1依赖性糖酵解增加[25]. 我们的细胞显示MP和WT细胞之间的糖酵解显著减少，这可能是由于PGRMC1-HA表达或WT细胞的潮霉素稳定选择所致。然而，WT、DM和TM之间的磷酸化状态差异导致了葡萄糖消耗和乳酸分泌的显著差异（图。5). 值得注意的是，内源性PGRMC1在所有这些细胞中都表达，因此我们无法确定这些突变蛋白在多大程度上可能会引起自身效应，或干扰内源性PGRM C1。然而，我们得出结论，PGRMC1可以调节糖酵解，这与我们的假设相符，尽管其机制需要进一步研究，以验证糖尿病细胞中PI3K/AKT活性升高对Warburg效应产生负调节的可能性。

结论

自分化诱导原肠化组织的进化出现以来，磷酸受体氨基酸Y180在PGRMC1蛋白中一直保持不变[22]. 因此，我们认为，我们操纵的PGRMC1 Y180调节代谢和生长控制的调节可能代表了动物细胞生物学的一个新发现的主要基础轴，它的摄动与复杂形体计划后续进化过程中获得的区分状态的保持不一致。

虽然我们可以自信地推断PGRMC1信号网络的存在，但迄今为止，我们既没有确定直接上游PGRMC1效应器，也没有确定下游靶点。在同伴研究中[36]，我们发现本文中描述的细胞在基因组甲基化和突变率方面有显著差异。未来的研究应该紧急探索PGRMC1信号与癌症、糖尿病、阿尔茨海默病等疾病之间的关系[2].

方法

质体制备

质粒pcDNA3.1-PGRMC1-HA（野生型：WT[24]已描述。Genscript（香港）以DM质粒为模板，引入F180密码子TTC，构建了三重突变体S57A/Y180F/S181（TM）。在Monash Micromon DNA测序设施（澳大利亚维多利亚州克莱顿），使用亲本载体特异的5′T7和3′BGH测序引物，通过DNA测序再次确认PGRMC1-HA开放阅读框。PGRMC1-HA质粒转化为大肠杆菌前10个菌株，37℃培养过夜 °C，在含有Luria肉汤（LB）培养基（Invitrogen）和50 μg/mL氨苄西林。选取一个菌落，在250个菌落中培养细菌 37℃通风过夜培养ml LB介质中为°C。质粒DNA由GeneJet Maxiprep Kit（ThermoScientific）按照制造商的方案进行分离。使用Nanodrop（Thermo Scientific）测量质粒DNA浓度。

细胞培养

MHTP医学基因组设施（墨尔本莫纳什大学）根据ATCC标准开发组织文件ASN-0002通过短串联重复序列分析进行细胞系鉴定，证实MIA PaCa-2（MP）细胞身份为MIA PaCa-2（ATCC CRL-1420）。MP细胞保存在补充有10%胎牛小牛血清（Sigma-Aldrich，F9423）和1%青霉素-链霉素（Sigma-Aldrich，P4333）（完全DMEM）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM-高糖，Sigma-Aldrich，D5796）中 150i CO中的°C和5%CO2₂孵化器（Heracell，新南威尔士州莱恩科夫）。如前所述，通过3-（4,5-二甲基噻唑基-2）-2,5-二苯基四唑溴化盐（MTT）试验或培养基（IncuCyte）评估细胞倍增时间[79]. 使用海马细胞外通量分析仪XF24（海马生物科学）测量线粒体呼吸能力。

转染和稳定细胞系的产生

在我们的培养条件下，MP细胞以间充质形状的扁平贴壁细胞、少数圆形贴壁细胞和少量圆形悬浮细胞的形式存在于培养物中。镀上悬浮细胞后，再生出类似的种群分布（未显示）。转染前一天，2 × 10⁶MP细胞接种在6孔板上。细胞以70-80%的合流率转染。转染前，用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（PBS，Sigma-Aldrich，D8537）清洗细胞，并将其保存在含有10%小牛血清（Sigma-Aldrich，12133C）和1%青霉素/链霉素（Sigma-Aldrich，P4458）（完整的DMEM）的无抗生素Dulbecco's改良鹰中高糖（DMEM，Sigma-Aldrich（D5796））中在单独转染中，4 μg各自的PGRMC1-HA质粒（WT、DM或TM）和Lipofectamine 2000（Lipofetamine 2000，Life Technologies，11668–019）以1:2的比例混合并培养25 室温下的最小值。然后将混合物滴入培养板的孔中。6之后 培养h，用PBS洗涤细胞，并在37℃下培养 °C和5%CO₂在完整的DMEM中48 h、 然后收集细胞并将其在含有50 96孔板中的微克/毫升Hygromycin B（EMD Millipore，400052）。细胞在37 2°C和5%CO2 周，定期更换含有完整DMEM和Hygromycin B的培养基，每3周更换一次 为稳定的集成事件选择的天数。对于PGRMC1-HA WT、DM和TM中的每一个，通常扩增8个独立的稳定转染的细胞系，并且通过蛋白质印迹选择具有相似水平的PGRMC1-HA表达的3个系。

将细胞冷冻0.5–1.0 在− 80 Bambanger（Novachem，#306–14684）温度为2°C × 10⁶细胞/mL。冷冻细胞在37℃解冻后重新引入培养基 20°C s后加上5 ml完整培养基，在25℃下以180 x g的速度低速离心3分钟 摄氏度。6个颗粒细胞再次悬浮 mL新鲜完整培养基，接种于25 厘米²烧瓶。

由于观察到的显著效果，MP细胞被纳入我们的实验中作为文献参考点。MP与WT细胞的不同之处在于没有进行潮霉素选择，并且PGRMC1-HA没有过度表达。因此，我们不能将MP和WT细胞之间的差异归因于PGRMC1-HA表达。根据WT对照水平评估DM和TM PGRMC1突变的影响。

shRNA慢病毒产生

使用靶向ERR1/ESRRA（TRCN0000330191，GAGAGGAGTTAGTTCTACA）、vinculin（shVCL）（TRCN00000290168，CGGTTGACTGTAATAAT）或非靶向加扰shRNA（shScr）的Mission TRC2-pLKO-Puro系列慢质粒（SHCLND，Sigma-Aldrich）构建慢病毒传递shRNA。首次尝试获得MP和DM shVCL细胞，然而，尽管尝试了三次，仍无法建立WT细胞。为了产生病毒颗粒，我们使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，11668-027）将shRNA质粒和辅助质粒共同转染HEK293细胞。转染前，用50 μg/mL D-赖氨酸过夜。第二天，1 × 10⁶每孔接种HEK293细胞，37℃孵育过夜 °C，在完全介质中。转染混合物A含有4 含2.5μg质粒混合物 μg靶点或shScr shRNA慢质粒，0.75 μg Pax，0.3 μg版本和0.45 μg VSV-g辅助质粒[80]250中 μL无抗生素培养基。转染混合物B含有8 μL脂多糖胺和242 μL无抗生素培养基。5之后 25分钟孵育 °C，轻轻混合混合物A和B并培养25 25时最小 摄氏度。取下HEK293培养基，用PBS清洗细胞，2 加入mL新鲜的无抗生素培养基，然后向细胞中加入联合转染混合物，轻轻摇晃，然后孵育6 37小时 摄氏度。培养后，在37℃下用完整培养基替换培养基过夜 摄氏度。收集培养基收集病毒颗粒，然后每24天添加新培养基 72小时 h.收集每个培养基的培养基，通过22 μM过滤器，校准为1 mL馏分，并在−下冷冻 80 摄氏度。

shRNA慢病毒转导

简单地说，1 × 10⁵每24个板孔的MP、WT或DM细胞接种于1 mL完整的DMEM培养基，并生长到60%的汇合处。介质被移除，并替换为1 每孔含2倍连续稀释病毒颗粒的培养基mL，加上5 μg/mL聚brene（溴化六甲菊酯，Sigma-Aldrich 107689），以增强病毒转导。孵育24天后 h、 取出培养基，用PBS洗涤细胞两次，然后添加新鲜培养基并补充1.5 μg/mL嘌呤霉素，每48天更换一次 1小时 周。用最低稀释度的存活病毒颗粒转导的微孔中的细胞被扩增，储存在- 80 班班戈的温度为°C。

划痕迁移分析

MP细胞或稳定转染的单克隆MP细胞系表达PGRMC1-HA WT、DM或TM蛋白（1 × 10⁴细胞）接种在24孔板中。在90%以上的汇合处，单层细胞受到血清饥饿2 h.用无菌p200尖端在单层中间形成划痕，并用PBS冲洗两次，以去除漂浮细胞。然后添加了完整的媒体。将细胞单层孵育36 h，以允许细胞迁移到划痕区域中。照片拍摄于0和36 h，使用反相显微镜（Nikon Eclipse Ti-U）。图中方框区域中的单元格。2a是从打印的图像中手动评分的。细胞治疗包括125 nM Y-27632二盐酸盐（Abcam，ab120129，Rho激酶抑制剂：ROCKI）或溶媒对照（DMSO）。对于视频文件，细胞在37 °C和5%CO₂用于36 h，位于舞台顶部电加热室（Okolab H301-NIKON-NZ100/200/500-N），包括透明加热盖（H301-EC-HG-lid），带有24孔Nunc/Greener板底座适配器（24 MW-NUNC）和隔室立管，工作距离为28 mm.控制单元（Okolab H301-TC1-HMTC）通过数字CO调节腔室₂控制器（Okolab DGT-CO2 BX）和空气泵（Okolab，OKO-AP）被插入电动XY台（尼康TI-S-ER）上的Nano-Z100-N压电级（疯狂城市实验室）。每10次拍照 36分钟 h，使用NIS Elements V4.10软件（Nikon）控制的Nikon Ti Eclipse共焦显微镜上的透射光探测器（TD），使用10×（0.45 NA）Plan Apo物镜。

蛋白质组学样品制备

在5600 TripleTof™质谱仪（ABSciex）上，在技术复制数据依赖和独立数据采集SWATH-MS模式下测量每种PGRMC1-HA表达细胞类型的三个独立稳定转染细胞系以及MP亲本细胞系的三倍。全球蛋白质组学分析在澳大利亚蛋白质组分析设施（APAF）进行。细胞在Wagga Wagga中生长，75年达到80%的融合率 厘米²烧瓶。使用三种分离的MP细胞培养物（第8、9和11代）和三种PGRMC1-HA WT、DM和TM细胞系（独立的生物三倍体）。收集细胞并将冷冻细胞颗粒装在干冰上运至APAF进行质谱分析。使用200 μL脱氧胆酸钠缓冲液（0.03中的1% M三乙基碳酸氢铵），并使用0.5 μg苯酶。对样品和100个样品进行直接检测分析（EMD Millipore，DDAC00010-8P） 每个样品取μg进行消化。用二硫苏糖醇（5 mM），与碘乙酰胺烷基化（10 mM），然后用4消化 16μg胰蛋白酶 37小时 摄氏度。将消化后的样品酸化并离心，以去除脱氧胆酸钠。然后将样品干燥并重新悬浮在100中 μL加载缓冲液（2%乙腈0.1%甲酸）。用于SWATH分析的单个样品以1:4稀释到装载缓冲液中，并转移到小瓶中。在技术复制品中测量每个样品。对于IDA运行，通过从每个生物复制品中取等量的部分，并在加载缓冲液中稀释1:4，为每个组（MP、WT、DM和TM）建立一个池。

蛋白质组信息依赖性获取

在5600 TripleTof™质谱仪（ABSciex）上分析色氨酸肽。肽的色谱分离在NanoLC-2Dplus高效液相色谱系统（加利福尼亚州都柏林Eksigent）和自填充分析柱（Halo C18160）上进行 Å, 2.7 微米，75 微米 × 10 厘米）。肽样品（4 μg总肽量）加载到肽捕捉器（Opti-trap Cap 0.5 毫米 × 1.3 mm，优化技术），在10 5μL/min min，然后将肽捕集器切换至与分析柱一致，并使用线性溶剂梯度从柱中洗脱肽，洗脱步骤为从98%缓冲液A（0.1%甲酸）和2%缓冲液B（99.9%乙腈，0.1%甲酸 最小值，然后在500℃下达到65%缓冲液A和35%缓冲液B nL/min超过78 最小周期。肽洗脱后，用95%缓冲液B清洗色谱柱15 min，然后用98%缓冲液A平衡15 下一次进样前的min。以IDA模式对反相纳米LC洗脱液进行正离子纳米流电喷雾分析。LC/MS的样品分析顺序为DM1、DM2、DM2，DM3、DM3、MP2、MP2，MP3、MP3、TM2、TM3、TM3，WT1，WT1、WT2、WT2，WT3、WT3、DM1，MP1、MP1、TM1，TM1。

在IDA模式下，采集了TOFMS测量扫描（m/z 350–1500，0.25 s） ，有10个最强烈的多重带电离子（2+ − 5+; 计数> 150）在调查扫描中按顺序进行MS/MS分析。然后将选定的前体添加到动态排除列表中20秒。利用滚动碰撞能量，在m/z 100–1500质量范围内累积50毫秒的MS/MS光谱。

蛋白质组数据独立采集（SWATH）

样品通过SWATH-MS分析[81]蛋白质组学分析一式两份，色谱条件与上述IDA分析相同。以数据独立采集模式（SWATH）对反相纳米LC洗脱液进行正离子纳米流电喷雾分析。对于SWATH MS，m/z窗口大小是根据先前IDA数据中的前兆m/z频率（m/z 400–1250）确定的（SWATH可变窗口采集，总共60个窗口）。在SWATH模式下，首先采集TOFMS测量扫描（m/z 350–1500，0.05 s） 然后对60个预定义的m/z范围依次进行MS/MS分析。MS/MS光谱在质量范围m/z 350–1500内累积96毫秒，滚动碰撞能量针对m/z窗口中较低的m/z进行了优化+ 10%. 为了最大限度地减少仪器条件造成的偏差，以随机顺序采集样本的SWATH数据，每个样本之间进行一次空白运行。

SWATH库生成

使用ProteinPilot（4.2版）（Sciex）搜索IDA数据的LC-MS/MS数据，并将其合并到单个搜索报告文件中。根据Swissprot 2014_04数据库中的Human条目搜索这些文件（2015年4月16日发布，包含545388条条目）。搜索参数选择如下：碘乙酰胺-半胱氨酸烷基化、胰蛋白酶消化、Triple-TOF 5600仪器、生物修饰、彻底搜索和启用错误发现率。

小水线面双体船数据处理

使用PeakView（2.1版，Sciex）提取SWATH数据，参数如下：每个肽的前6个最强烈片段是从SWATH数据库中提取的（75 ppm质量公差，10 最小保留时间窗口）。共享肽被排除在外。数据处理后，使用置信度≥99%且FDR≤1%的肽（每个蛋白最多50个肽）（基于片段提取后的色谱特征）进行定量。提取的SWATH蛋白峰面积归一化为每次运行的总峰面积，并进行t检验，以比较样品之间的相对蛋白峰面积。蛋白质t检验第页-小于0.05的值和大于1.5的折叠变化突出显示为差异表达。四种不同细胞类型的分析被视为六个独立的配对比较：1）MP与WT，2）MP与DM，3）MP与TM，4）WT与DM，5）WT对TM，以及6）DM与TM。此外，在肽水平上使用类似的方法来确定差异表达，然后平均每个蛋白质的肽水平倍数变化。肽水平分析更为保守，因为肽水平第页-只有当一种蛋白质被至少两种蛋白质识别时，才会产生值。本研究使用了肽水平数据。

网络格式塔丰富分析

对图中差异丰富的蛋白质进行了基因本体（GO）和通路富集分析S2系列使用基于WEB的GEne SeT分析工具包（WebGestalt）平台(http://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/) [82]. 描述或依赖WebGestalt结果的图形或补充图形描述了在线可用的补充数据文件，其中包含各自的原始WebGestatt分析文件。为了确定对观察到的表型改变最重要的驱动作用，还对adjP进行了补充WebGestalt分析< 0.001%水平，但使用检测到显著上调或下调的蛋白质子集（文件中每次比较的“红色”和“蓝色”蛋白质列表S1). 来自各自蛋白质组学比较的UniProt蛋白质ID作为文本文件上传，并随附相应的WebGestalt补充数据文件。KEGG、Pathway Commons和Wiki Pathways在5%的水平上进行了分析。GO和转录因子分析也用于比较0.1和10%水平的细胞类型之间的每一对差异上调或下调蛋白。采用了以下网络格式塔设置：Organism:hsapens；基因Id类型：entrezgene；富集分析的参考集；entrezgene_protein编码；显著性水平：（变量见个体分析描述），统计方法：超几何，多重测试调整：Benjamini Hochberg（BH），一个类别的最小基因数：3。

通路富集分析可以考虑a）所有差异蛋白（包括一次分析中的上调和下调蛋白），或者b）可以在每次比较的单独分析中检查高丰度和低丰度蛋白（每次比较的“红色”或“蓝色”分析）。我们的网络格式塔路径分析策略图。三追求这些替代方案中的第二个。在第一次分析中，在任意六次分析中发现两个样本之间存在差异（上调和下调）的所有蛋白质都作为蛋白质列表输入到WebGestalt，在Benjamini和Hochberg（BH）调整的p（adjP）进行通路富集分析，并进行多样本校正KEGG、Pathway Commons和Wikipaths在六种基本细胞类型比较中的显著性水平均为0.001。

对图进行了十二次单独的网络格式塔分析。三，包括KEGG、PC、WikiPathways以及转录因子和GO细胞成分的富集分析。图的示意图。三显示了在1）MP与WT、2）MP与DM、3）MP与TM、4）WT与DM、5）WT vs TM和6）DM与TM之间的12个比较中，至少有一个比较（6倍更丰富的“红色”和6倍更少的“蓝色”）确定为显著丰富的路径。在adjP中检测到的所有比较之间的所有显著检测特征的路径映射< 0.001可用作文件第5章A.在adjP进行了另一项网络格式塔分析< 0.1和文件中确定的每个路径的意义第5章A在adjP< 然后在adjP中记录所有比较的0.001水平< 文件中的0.1级第5章B.分析结果作为文件提供参考S4系列B.该信息用于在路径图中为在adjP中识别的所有特征指定统计显著性< 任何一次比较中的0.001水平，在adjP的所有12次比较中< 0.1水平。然后，这些数据被用于绘制所有途径的所有蛋白质以及文件的所有比较第5章B生成图的原始图像。三在Microsoft Excel中，可作为文件使用S6系列包含所有蛋白质和通路身份。

将途径映射到表达热图

通路或功能群类别的蛋白质成员矩阵是一个产生的稀疏矩阵，其中0/1表示相应的蛋白质存在/不存在于相应的类别中。使用R Base Package中的hclust实现对该矩阵进行聚类(网址：www.r-project.org/)使用二元距离和完全连锁，根据共享蛋白质的比例对列（本例中为路径）进行重新排序。由此产生的分支图，包括所有网络格式塔分析确定的重叠特征，出现在图中路径的右侧。三，并在文件中具有完整的伴随蛋白和通路身份第5章.

蛋白质组学结果的主成分分析

主成分分析用于检查蛋白质测量变化的最大贡献。采用Wilcoxon秩和检验确定与主成分得分正相关或负相关的途径。

Western blots的样品制备

将T75烧瓶中约70%的汇合细胞用冷冻PBS缓冲液清洗两次，并用500 μL放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA缓冲液）（Sigma-Aldrich，R0278），按照制造商的建议添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（Thermoscific，88668）。刮除后，将裂解液离心至8000 20克 最小值（Hermle离心机Z233 M-2），4 摄氏度。按照制造商的说明，使用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒（ThermoFisher，23225）测定蛋白质浓度。将20微克细胞裂解物分别与2x莱姆利加载缓冲液（Sigma-Aldrich，S3401）以1:1的比例混合，得到最终体积20 μL，然后在95 5°C 数字干浴加热器中的最小值。将裂解液立即装入10%SDS-PAGE凝胶中。对于HA western，我们使用17孔凝胶（Life technologies，NW04127），对于PGRMC1 western blots，我们使用15孔凝胶（Bio Rad.456–1069），对于vinculin和ERR1 western blots，我们用10孔凝胶（Bio Rad 456–1096）。电泳为150 45伏 分钟。蛋白质通过转Blot Turbo转移系统（新南威尔士州格莱德斯维尔市Bio-Rad）转移到PVDF膜（Bio-Rad，1620174）上7 使用Trans-Blot®Turbo RTA Mini-LF PVDF转移套件（Bio-Read，1704274）或在25分钟内湿转移 mM特里斯，192 mM甘氨酸，20%（v/v）甲醇（pH 8.3）（1个拖车箱缓冲器）20 2.5伏 在冰上冷却的微型跨槽电池（Bio-Rad，1703930）上放置h。

蛋白质斑点

使用含有5%Woolworths速溶脱脂奶粉（Woolworth，Wagga Wagga，NSW，Australia）的TBS-T（0.1%吐温-20，1×Tris缓冲盐水）封闭膜1 h，4点孵育过夜 °C，初级（1°）抗体。用TBS-T洗涤3次后，用二级（2°）抗体孵育印迹1 室温下h。通过以下方法检测蛋白质。为了进行化学发光检测，将膜与Clarity Max Western ECL底物（Bio-Rad，#1705062）孵育5 min，使用Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统（新南威尔士州格拉德斯维尔Bio-Rad）通过增强化学发光进行检测。在ChemiDoc上进行荧光检测（在指定波长）。使用IRDy680通道在ChemiDoc上检测用于荧光或化学发光成像的凝胶的分子量标准蛋白。通过将膜与3 mL四甲基联苯胺（TMB）（Sigma-Aldrich，T0565）5 min.这些图像由分子成像仪凝胶Doc XR+系统（新南威尔士州格拉德斯维尔Bio-Rad）拍摄。使用Bio-Read Image Lab软件生成多通道ChemiDoc图像。Adobe Photoshop CC 2018（Adobe Systems Inc.）对一些双通道图像进行了处理，方法是将红色或绿色通道中的强度降低到发布图像中的较低背景。对所有图像像素进行相同的调整，以便不改变任何波段的相对强度。

以下一级（1°）和二级（2°）抗体对（在规定的稀释度下）使用指定的检测方法。PGRMC1 Western：化学发光法检测1°山羊抗PGRMC1抗体（Abcam，ab48012）（1:1000）和2°兔抗山羊二级抗体（Abcam，ab6741）（1:4000）。检测后，用TBS-T隔夜封闭细胞膜，然后用1°小鼠抗β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich，A5541）（1:2000）和2°山羊抗鼠IgG H&L（IRDye 800CW）（1:5000）孵育，荧光检测（IRDy 800CW。对于HA表位Western：1°小鼠抗-HA（Sigma-Aldrich，H3663）（1:2000）和2°山羊抗-H和L（IRDye 800CW）（稀释1:5000）通过荧光检测，以及1°兔抗β-actin（Cell Signaling，4967）（1:200）和2℃驴抗-HabG（Abcam，ab16284）（1:2001）通过化学发光检测。对于西维酮：用比色法检测1°抗维酮（E1E9V）XP（细胞信号技术，13901）（1:1000）和2°驴抗兔IgG（Abcam，ab16284）（1:2000）。ERR1 Western：比色法检测1°兔抗ERRα（E1G1J）（细胞信号，13826S）（1:1000）和2°驴抗兔IgG（Abcam，ab16284）（1:2000）。

反相蛋白质阵列分析

使用Zeptosens技术（拜耳公司，勒沃库森，德国）的RPPA阵列用于分析信号蛋白表达和活性谱，如所述[83,84,85,86]. 为了进行分析，通过与100 30μl细胞裂解缓冲液CLB1（德国拜耳） 室温下的最小值。裂解液上清液的总蛋白浓度由Bradford Assay（考马斯Plus，Thermo Scientific）测定。将细胞裂解物样品调节至CLB1中的均匀蛋白质浓度，在RPPA斑点缓冲液CSBL1（拜耳）中稀释10倍，然后打印为四个系列的稀释液（起始浓度为0.3 μg/μl加1.6倍稀释液），每个重复两次。使用NanoPlotter 2（GeSim，Grosserkmannsdorf，Germany）进行单滴沉积（0.4 nL每点体积）。打印后，用3%w/v白蛋白封闭微阵列，用二次蒸馏H彻底清洗₂O、 在氮气流中干燥并在4点的黑暗中储存 °C，直到再次使用。

蛋白质表达和活性水平使用直接的两步序贯免疫分析和灵敏的定量荧光读数进行测量。每个蛋白质都用一个阵列进行探测。高度特异性和预先验证的一级抗体在相应稀释液中培养过夜（15 h） 在室温下。阵列在分析缓冲液中清洗一次，并培养45 min，使用Alexa647标记的抗物种二级抗体（英国佩斯利Invitrogen）。然后像以前一样清洗阵列，并使用ZeptoREADER仪器（拜耳）在红色激光通道中成像。通常，每个阵列在0.5至16倍的曝光时间下记录六幅荧光图像 s.还进行了在没有一级抗体的情况下培养的阴性对照试验（空白试验），以测量二级抗体的非特异性信号贡献。此外，对打印系列中的一个芯片进行染色，以测量每个点固定蛋白的相对数量（蛋白质染色分析）。使用了以下主要抗体（提供者和试剂编号，稀释度）：BAD（CST 9239，1:200）、BAD-P-Ser112（CST 5284，1:100）、BAD-P-Ser136（CST 4366，1:100，HSF1（Epitomics 2043–1，1:1000）。

在分析测量（每个阵列一个蛋白质）后，使用软件ZeptoVIEW 3.1（拜耳）分析阵列图像和数据。对于每个阵列/抗体，分析在最长曝光时间拍摄的图像，没有显示任何饱和效应，斑点直径设置为160 微米。每个样品的平均荧光信号强度（MFI）是根据参考的、背景校正的单点平均强度（每个样品八个点）计算的，对四个打印蛋白质浓度的平均值进行线性拟合和插值。将样本的空白校正MFI信号归一化为芯片上打印的相对蛋白质浓度，以获得归一化荧光强度信号（NFI）。NFI值用于所有后续的统计分析。

葡萄糖摄取和乳酸生成测定

按照制造商的协议，使用Cayman化学品（#600470、#700510）的商用试剂盒进行葡萄糖摄取和乳酸生成分析。用Fluostar Omega荧光微孔板读数器（BMG Labtech，Ortenberg，Germany）测量葡萄糖摄取，并用Molecular Devices Spectra Max 190微孔板读数器（Bio Strategy P/L，Campbellfield，Vic.，Australia）定量乳酸生产。

NpFR2氧化还原分析

使用萘酰亚胺黄素氧化还原传感器2（NpFR2）测定线粒体内氧化还原状态[48]. Mia PaCa-2和PGRMC1-HA表达的稳定细胞（1 × 10⁶)2人被停赛 mL完整培养基，接种在6孔板中，培养24小时 37小时 °C和5%CO₂细胞用PBS洗涤、胰蛋白酶处理、收获并重新悬浮在1中 含25毫升新鲜培养基 1.5中的μM NpFR2 mL微离心管，然后培养20 37分钟 摄氏度。然后在微型离心机中以180 x g的速度离心细胞，用1 mL PBS，然后再离心，清洗后的颗粒在1中再次悬浮 mL PBS。将500微升细胞悬液加载到Gallios流式细胞仪（Beckman Coulter）中，并用2 × 10⁴使用FL1（绿色）通道检测细胞。

免疫荧光显微镜

为了检测外源HA标记的PGRMC1在图中的表达。1e、 细胞接种在六孔板上的盖玻片上。细胞用冰镇PBS清洗，用3.7%甲醛温和固定5次 最小值为4 摄氏度。然后用冰镇100%甲醇使细胞渗透10 −时的最小值 20 °C，然后用抗HA标签抗体（Sigma，H3663）培养过夜。细胞被广泛清洗，并与FITC结合二级抗体（Sigma，F8521）在黑暗中孵育1 4时为小时 摄氏度。细胞用PBS洗涤三次，并用DAPI安装液复染。使用尼康Ti Eclipse共焦显微镜（尼康澳大利亚有限公司）拍摄图像。

线粒体形态分析

对线粒体的细胞形状（细长/圆形）、线粒体含量（线粒体面积/细胞的总和）、线粒体大小（平均周长/细胞）和线粒体形态或形状因子（FF）进行量化：数值越高，对应的丝状线粒体水平越高，数值越低，对应的线粒体碎片越多[52]. FF（以P计算²/4πA）基于形状的周长和面积来测量线粒体形态。该计算不仅考虑了长度的变化，还考虑了分支的程度，这是线粒体形态量化的理想测量形式。

要测量FF，1 × 10⁵细胞接种在Nunc 176740四孔板上，底部有22x22mm#1.5玻璃盖玻片。如上所述固定和渗透细胞，然后与Abcam小鼠抗线粒体IgG1抗体（Abcam ab3298）孵育，然后与FITC-结合的山羊抗小鼠二级抗体（Sigma-Aldrich F4018）和DAPI孵育后，进行阴茎倍体红染色，并用三维结构光照显微镜（SIM）成像在DeltaVisionOMX Blaze显微镜上[87]. 使用斐济/ImageJ软件处理图像[88]提取面积和周长值以计算形状系数。作为线粒体定量过程的一部分，JCC将细胞形态评分为“圆形”或“拉长”。

全息层析成像

在配备NanoLive活细胞培养箱（AXT Pty Ltd）的NanoLive（瑞士）3D Cell Explorer fluo（AXT私人有限公司，新南威尔士州Warriewood）上进行全息层析视频成像。1 × 10⁴将细胞接种到FluoroDish细胞培养皿35中 毫米，23 mm孔（World Precision Instruments，FD35），并保存在无酚红DMEM培养基（Sigma-Aldrich，D1145）中，补充10%胎牛小牛血清（Sigma Aldrich，F9423），2 mM谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，G7513）和1%青霉素-链霉素用于48 h.在成像之前，立即取出培养基并用400替换 μL相同培养基，然后转移至3D cell Explorer的活细胞培养箱。细胞在37℃孵育 °C，5%一氧化碳₂以及在时间流逝的持续时间内100%的湿度。每20次采集一次三维全息图像 使用Nanolive STEVE软件进行延时。对于文件第7部分捕获后，使用内置的STEVE导出向导将每个96片堆栈的中心平面导出为.avi电影文件。这些文件以每秒5帧（实际速度的100倍）的速度导出，以可视化细胞动力学。

小鼠皮下异种移植瘤

动物实验和福利符合澳大利亚国家卫生和医学研究委员会的指导方针，并得到澳大利亚国立大学动物伦理委员会（E2017/16）和查尔斯·斯图特大学动物护理和伦理委员会（A17046）的机构伦理批准。NOD/Shi-SCID/IL-2Rγnull（NSG）小鼠由澳大利亚国立大学（ANU）的澳大利亚表型研究设施、澳大利亚政府国家合作研究基础设施战略（NCRS）项目资助的澳大利亚学术中心以及澳大利亚国立大学的贡献进行繁殖和供应。实验在约翰·科廷医学研究院卫星动物设施进行。动物被关在单独通风的笼子里，可以随意获得食物和水，并配有玉米芯床上用品和每个笼子最多5只老鼠。动物按体重随机分为四个队列注射，每个队列的小鼠数量基于可用性。向小鼠注射独立生成的细胞系MP、WT1-WT3、DM1-DM3、TM1-TM-3和Y180F。细胞在培养物中扩增最多2个 注射前数周。细胞被胰蛋白酶化、造粒、用PBS洗涤并保存在冰上。使用血细胞仪和台盼蓝测定细胞计数。100个细胞中有200万个细胞被再次悬浮 μL 50:50 Matrigel:PBS皮下注射到雌性NSG小鼠（8-12）的左侧 周）。每个细胞系注射的小鼠总数基于用于评估疾病负担的实体肿瘤模型的复制变异系数（CV）n个 = 10%，CV是描述相对于平均值的变异量的价差度量。基于t检验的肿瘤平均进展模拟差异统计分析表明 = 在预先确定的5%统计显著性水平下，需要确定复制组之间大于或等于20%的变化。然而，为了尽可能减少动物的使用，根据NHMRC澳大利亚科学目的动物护理和使用规范对其进行了改进。在队列1中，四只动物分别注射MP、WT1、DM1和TM1。在第2队列中，分别有四只动物注射WT2、DM2和TM2，一只动物注射MP。在第3队列中，四只动物分别注射WT3、DM3和TM3，一只注射MP。第4队列中，五只动物注射Y180F细胞，一只分别注射MP、WT1、DM1和TM1。每个队列的注射在上午开始。每天监测小鼠，一旦发现肿瘤(~ 2.5–4 周），每周用卡尺测量肿瘤生长3次，直到队列中至少有一个肿瘤达到1 厘米^三体积。一旦队列中任何一组的任何动物达到肿瘤的最大大小，所有动物都会被安乐死，以通过颈椎脱位恢复组织，然后采集肿瘤，称重，拍照，并用福尔马林固定。

统计分析

除非另有规定，否则使用SPSS软件包（IBM）进行统计分析。WT、DM和TM细胞的结果表示每个PGRMC1条件下三个独立衍生细胞系的相等数量（例如。n个 = 6 for WT包括2x WT1、2xWT2和2xWT3）。对于箱线图数据描述，胡须代表四分位数1和4（具有最大值和最小值）。方框表示由SPSS分析数据函数生成的四分位数2和3，由中位数分隔。采用方差分析和事后Bonferroni或Tukey HSD检验（等方差）或事后Dunnett的T3检验（不等方差）对符合正态分布的数据集进行分析。使用双向方差分析和事后配对比较计算不同细胞系不同处理之间的统计差异。对于非参数数据集，进行了Kruskal-Wallis或Kolmogorov-Smirnov测试，如相关图表图例所示。