小鼠乳腺癌模型与人乳腺肿瘤保守基因表达特征的鉴定

摘要

背景

尽管已经开发出了许多乳腺癌小鼠模型，但我们不知道在多大程度上任何模型都能忠实地代表具有临床意义的人类表型。为了满足这一需求，我们使用DNA微阵列对13种不同小鼠模型的乳腺肿瘤基因表达谱进行了表征，并将所得数据与人类乳腺肿瘤的数据进行了比较。

结果

无监督分层聚类分析表明，六个模型（TgWAP-Myc公司、TgMMTV-Neu公司、TgMMTV-PyMT公司、TgWAP-国际3、TgWAP-标签和TgC3（1）-标签)在每个菌株中产生具有独特且均匀表达模式的肿瘤。然而，在其他四种型号中（TgWAP-T型 ₁₂₁ 、TgMMTV-重量1,布尔卡1^{有限公司/有限公司};TgMMTV电视-Cre公司;第53页^+/-和DMBA诱导的），发展出具有多种组织学和表达谱的肿瘤。在许多模型中，发现了与人类乳腺肿瘤的相似之处，包括增殖和人类乳腺肿瘤亚型特征。值得注意的是，几种模型的肿瘤表现出人类基底样乳腺肿瘤的特征，包括两种诱导性肿瘤模型布尔卡1缺陷。其他小鼠模型的肿瘤具有相同的特征，并趋向于人类管腔肿瘤的基因富集意义；然而，这些小鼠肿瘤缺乏雌激素受体（ER）和ER调节基因的表达。TgMMTV电视-Neu公司肿瘤与人类HER2+/ER-亚型没有明显的基因重叠，与人类管腔肿瘤更为相似。

结论

人类亚型的许多定义特征在小鼠模型中是保守的。虽然没有单个小鼠模型能够概括出特定人类亚型的所有表达特征，但这些共享表达特征为改进小鼠乳腺肿瘤模型与人类乳腺肿瘤的整合提供了一个通用框架。

背景

对人类乳腺癌的全球基因表达分析已经确定了至少三种主要的肿瘤亚型和一个正常的乳腺组织组[1]. 两种亚型为雌激素受体（ER）阴性，患者预后较差[2,三]; 这两种亚型中的一种是由HER2/ERBB2/NEU（HER2+/ER-）的高表达定义的，另一种表现为基底/肌上皮细胞（基底样）的特征。第三个主要亚型是ER阳性和角蛋白8/18阳性，并被指定为“腔型”亚型。该亚型又分为预后良好的“A腔”肿瘤和预后较差的“B腔”肿瘤[2,三]. 这些研究强调，人类乳腺癌是多种不同的疾病，每种主要亚型都可能有不同的基因改变，对治疗有不同的反应[4,5]. 进一步的类似调查可以很好地确定对诊断和治疗有用的其他亚型；然而，如果相关疾病特性能够在实验动物中准确建模，这类研究将加速进行。与特定遗传损伤和生物相关的特征可以在此类模型中进行因果分配，从而有可能细化人类数据。

基因工程小鼠能力的重大进步导致了模型的产生，该模型再现了人类癌症的许多特性[6]. 小鼠乳腺肿瘤模型旨在模拟人类乳腺癌中发现的基因改变，包括TP53、BRCA1和RB的失活，以及MYC和HER2/ERBB2/NEU的过度表达。这种模型是通过多种策略产生的，包括癌基因的转基因过度表达、显性干扰蛋白的表达、靶向性破坏抑癌基因以及化学致癌物的治疗[7]. 虽然使用小鼠作为替代品有很多优点，但也有潜在的警告，包括乳房生理学的差异以及未知物种特异性途径差异的可能性。此外，人类癌症的哪些特征与疾病比较最相关（例如，遗传变异、组织学特征、肿瘤生物学），这并不总是很清楚。基因组分析为比较癌症分析提供了一种工具，并为跨物种比较提供了一个强大的手段。最近将微阵列技术应用于人类肺癌、肝癌或前列腺癌及其相应的小鼠对应物的研究报告了共性[8–10]. 总的来说，这些研究都集中在一个或几个小鼠模型上。在这里，我们使用基因表达分析对一大组小鼠乳腺肿瘤模型和人类乳腺肿瘤进行分类。研究结果提供了小鼠模型之间的生物学见解，并与人类数据进行了比较，确定了具有生物学和临床意义的共同特征。

结果

小鼠肿瘤分析

为了表征小鼠乳腺癌模型中存在的生物表型的多样性，我们对13种不同小鼠模型的肿瘤进行了基于微阵列的基因表达分析（表1)使用安捷伦微阵列和通用参考设计[1]. 我们进行了122个微阵列，包括108个独特的乳腺肿瘤和10个正常乳腺样本（附加数据文件1）。通过对数据进行无监督的分层聚类分析（附加数据文件2），小鼠肿瘤特征显示存在内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、淋巴细胞和两种不同上皮细胞类型（基底细胞/肌上皮细胞和管腔细胞）的基因集特征。在这个无监督的集群中对小鼠肿瘤进行分组表明，一些模型产生了具有一致、模型特异性表达模式的肿瘤，而其他模型则表现出更大的多样性，不一定要组合在一起。具体来说，TgWAP-Myc公司、TgMMTV-Neu公司、TgMMTV-PyMT公司、TgWAP-国际3(槽口4)、TgWAP-标签和TgC3（1）-标签肿瘤具有较高的模型内相关性。相反，来自TgWAP的肿瘤-T型 ₁₂₁ 、TgMMTV-重量1,布尔卡1^{有限公司/有限公司};TgMMTV-核心；第53页^+/-DMBA诱导的模型显示出不同的表达模式。这个第53页^-/-移植模型往往是同质的，4/5个肿瘤合并在一起，而布尔卡1^+/-;第53页^+/-电离辐射（IR）和第53页^+/-IR模型显示肿瘤之间存在一定的异质性；然而，6月7日布尔卡1^+/-;第53页^+/-IR和5/7第53页^+/-IR均出现在一个树状图分支内。

表1小鼠乳腺肿瘤模型综述

与之前的人类肿瘤研究一样[1,三]，我们进行了“内在”分析，以选择始终代表小鼠样本组/类别的基因。在人类研究中，使用来自同一患者的生物复制来确定每个基因的表达变异，该算法识别的“内在基因”在生物复制中的变异相对较低，在个体之间的变异较高。相反，在这项小鼠研究中，我们使用附加数据文件2中的树状图，将该算法应用于由经验确定的相关阈值>0.65定义的小鼠样本组。这种“内在”分析产生了866个基因，然后我们将其用于层次聚类分析（图1以及完整集群图的附加数据文件3）。该分析确定了10个潜在组，每个组包含5个或更多样本，包括正常乳腺组（I组）和9个肿瘤组（指定II-X组）。

图1

小鼠模型内在基因集聚类分析。（a）完整的866基因簇图概述。（b）将实验样本相关树状图着色以指示十组。（c）TgMMTV中高表达的肠上皮基因表达模式-PyMT公司、TgMMTV-Neu公司和TgWAP-myc公司肿瘤。（d）编码基底层成分的基因。（e）第二个基底上皮基因簇，包括角蛋白5（f）在成纤维细胞中表达并与上皮细胞向间充质细胞转化有关的基因，包括蜗牛同源物1（g）正常组织中表达的第二个间充质簇。有关所有基因名称的完整聚类图，请参阅附加数据文件2。

总的来说，这十个组包含在四个主要类别中（图1亿（从左至右）：正常乳腺标本（第一组）和具有间叶特征的肿瘤（第二组）；基底/肌上皮肿瘤（III-V组）；具有管腔特征的肿瘤（第VI-VIII组）；和具有混合特征的肿瘤（第IX组和第X组）。第一组包含所有正常乳腺样本，无论菌株如何，均显示出高度相似性，其特征是基底层/肌上皮的高表达（图第1页)和间充质特征，包括波形蛋白（图1克). 第二组样品来自几个模型（2/10布尔卡1^{有限公司/有限公司};TgMMTV-核心；第53页^+/-，3/11 DMBA诱导，1/5第53页^-/-移植，1/7第53页^+/-红外，1/10 TgMMTV-Neu公司和1/7 TgWAP-T型 ₁₂₁ )并显示间充质特征的高表达（图1克)除了第二个高表达的间充质样簇外，它们还与正常样本共享蜗牛同源物1（一个与上皮-间充质转化有关的基因[11])后者在正常样本中没有表达（图第1页). 两个TgWAP-Myc公司树状图最左侧的肿瘤显示了明显的棘状组织学，也表达了这些间充质样基因特征。第II组肿瘤间充质表型的进一步证据来自角蛋白8/18（K8/18）和平滑肌肌动蛋白（SMA）免疫荧光（IF）分析，这表明大多数脊柱样肿瘤是K8/18阴性和SMA阳性（图2升).

图2

小鼠基底/肌上皮和管腔细胞角蛋白样品的免疫荧光染色。（a）野生型（wt）乳腺角蛋白8/18（红色）和角蛋白5（绿色）染色显示K8/18在腔上皮细胞中表达，K5在基底/肌上皮细胞中表示。（b-f）K8/18（红色）和K5（绿色）染色显示管腔样基因表达模式的小鼠模型。（g-k）通过基因表达显示基底样或混合管腔和基底特征的肿瘤样本，染色为K8/18（红色）和K5（绿色）。（j）的子集布尔卡1^{有限公司/有限公司};TgMMTV-核心；第页53^+/-肿瘤显示K5/K8/18双阳性细胞结节。（l）一个染色为K8/18（红色）和平滑肌肌动蛋白（绿色）的样条瘤。

第二大类包含III-V组，其中III组（4/11 DMBA诱导和5/11重量1)，IV组（7/7 Brca1^+/-;第53页^+/-红外，4/10布尔卡1^{有限公司/有限公司};TgMMTV-核心；第53页^+/-, 4/6第53页^+/-IR和3/11重量1)和V组（4/5第53页^-/-移植和1/6第53页^+/-IR），显示基底/肌上皮细胞的特征（图第1天，第5天). 这些特征包含在两种表达模式中。包括一个集群角蛋白14,17和LY6D型（图1天);角蛋白17是已知的人类基底样肿瘤标志物[1,12]，同时LY6D型是糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白Ly6家族的一员，在头颈部鳞状细胞癌中高度表达[13]. 该簇还包含基底膜的成分（例如，层粘连蛋白类)和半桥粒（例如，Envolakin公司和Desmoplakin公司)连接基膜和细胞质角蛋白丝。第二个基底/肌上皮簇在第三组和第四组肿瘤中高表达，以及一组鳞状形态的DMBA肿瘤的特征是高表达标识4,TRIM29阀内件，以及角蛋白5（图第1页)后者是另一种人类基底样肿瘤标志物[1,12]. 与上述基因集相比，该基因集在较小的模型子集中表达（图1天)在大多数V组肿瘤中较低或缺失。正如基因表达数据预测的那样，大多数肿瘤在角蛋白5IF的（K5）（图2克/千克).

第三类肿瘤（第VI-VIII组）包含许多“同质”模型，所有这些模型都显示出潜在的“管腔”细胞表型：第VI组包含大多数TgMMTV-Neu公司（9/10）和TgMMTV-PyMT公司（6/7）肿瘤，而第VII组和第VIII组包含大多数TgWAP-Myc公司肿瘤（11/13）和TgWAP-国际3样品（6/7）。这些肿瘤（尤其是VI组）的一个显著特征是XBP1（图1c个)，这是一个人类腔肿瘤定义基因[14–17]. 这些肿瘤还表达紧密连接结构成分基因，包括闭塞素,紧密连接蛋白2和三和管腔细胞K8/18（附加数据文件2）。K8/18和K5的IF证实这些肿瘤都只表达K8/18（图2b-f型).

最后，第九组（1/10布尔卡1^{有限公司/有限公司};TgMMTV-核心；第53页^+/-，4/7 TgWAP-T型 ₁₂₁ 肿瘤和5/5 TgWAP-标签肿瘤）和X组（8/8 TgC3（1）-标签)肿瘤位于最右侧，呈混合特征；特别是，第九组肿瘤显示出一些管腔的表达（图1c个)，基础（图1天)和间充质基因（图第1页)而X组肿瘤表达为基底（图1e、f)和间充质基因（图1f，克).

IF分析表明，与人类一样[12,18]，小鼠基底样模型倾向于表达K5，而小鼠管腔模型仅表达K8/18。然而，一些小鼠基底样模型产生了肿瘤，其中包含基底（K5+）和管腔（K8/18+）细胞系的细胞巢。例如，在某些TgMMTV中-重量1[19]，DMBA诱导（图2克，i)、和布尔卡1-在同一肿瘤内观察到单个阳性K5和K8/18细胞的不同区域。有趣的是，在一些布尔卡1^{有限公司/有限公司};TgMMTV-核心；第53页^+/-样本、双阳性K5和K8/18细胞结节被鉴定出来，暗示潜在的过渡状态或前体/干细胞群（图第2节)，在某些TgMMTV中-重量1（图2小时) [19]和布尔卡1-缺乏肿瘤，存在大面积上皮样细胞，几乎没有检测到K5或K8/18染色（数据未显示）。

使用“共识聚类”（CC）评估这些组的再现性[20]. 使用内在基因列表的CC与图中所示的结果显示出强烈的一致性1并支持使用层次聚类分析确定的大多数组的存在（附加数据文件4）。然而，基于生物学知识，我们对某些CC定义的组的进一步划分似乎是合理的。例如，分层聚类法将正常乳腺样本（第一组）和组织学上不同的棘状瘤（第二组）分离出来，并通过CC将其合并为一组。第六组（TgMMTV）-Neu公司和PyMT公司)和VII（TgWAP-Myc公司)同样通过层次聚类将它们分开，但CC将它们放在一个类别中。CC也使用所有表达和不同表达的基因（摘自附加数据文件2）进行，这些基因与基于内在列表的分类不太一致，并且经常将肿瘤从单个模型中分离到不同的组中（图3立方厘米，最底部面板）；例如，TgMMTV-Neu公司肿瘤被分为两个或三个不同的组，而当使用内在列表进行分析时，这些是不同的和单一的组。这可能是由于“所有基因”列表中存在或不存在来自其他细胞类型（即淋巴细胞、成纤维细胞等）的基因表达模式，这导致肿瘤根据非来自肿瘤细胞的质量进行分类[1].

图3

对232例人类乳腺肿瘤样本和122例小鼠乳腺肿瘤样本的组合基因表达数据进行无监督聚类分析。（a）树状图下方的彩色编码矩阵识别每个样本；前两行分别显示临床ER和HER2状态，红色=阳性，绿色=阴性，灰色=未检测；第三行包括根据附加数据文件6确定的内在亚型着色的所有人体样本；红色=基色，蓝色=管腔，粉色=HER2+/ER-，黄色=claudin-low，绿色=正常乳房。其余几行对应于右侧所示的小鼠模型。（b）包含基底上皮基因的基因簇。（c）管腔上皮基因簇，包括XBP1型和GATA3协议.（d）第二个管腔簇包含角蛋白8和18。（e）增殖基因簇。（f）干扰素调节基因。（g）成纤维细胞/间充质富集基因簇。（h）这个克拉2放大子簇。有关完整的集群图，请参阅附加数据文件5。

鼠-人联合非监督分析

小鼠基因簇让人想起以前在人类乳腺肿瘤样本中发现的基因簇。为了更直接地评估这些潜在的共同特征，我们对这里展示的小鼠数据和我们之前报告的人类乳腺肿瘤数据的扩展版本进行了综合分析。人类数据来源于代表184个原发性乳腺肿瘤的232个微阵列，9个正常乳腺样本也在安捷伦微阵列上进行了分析，并使用了一种通用的参考策略（结合人类数据集[21–23]加上58名新患者/阵列）。为了合并人类和小鼠数据集，我们首先使用小鼠基因组信息数据库来识别注释良好的小鼠和人类同源基因。然后，我们进行了距离加权判别校正，这是一种有监督的分析方法，用于识别两个数据集之间存在的系统差异，并进行全局校正以补偿这些全局偏差[24]. 最后，我们创建了一个由老鼠和人类组合数据组成的无监督层次聚类（图三以及完整集群图的附加数据文件5）。

该分析确定了许多共同特征，包括类似于上述细胞线簇的簇。具体来说，人类基底样肿瘤和小鼠布尔卡1^+/-;第53页^+/-;红外，布尔卡1^{有限公司/有限公司};TgMMTV-核心；第53页^+/-，百万吨电视-重量1，并且一些DMBA诱导的肿瘤的特征是层粘连蛋白γ2,角蛋白5,6亿,13,14,15,TRIM29阀内件,干细胞生长因子和CRYAB公司（图3亿)最后一个是一种人类基底样肿瘤标记物，可能与化疗耐药有关[25]. 如上所述布尔卡1^+/-;第53页^+/-;IR，一些布尔卡1^{有限公司/有限公司};TgMMTV-核心；第53页^+/、DMBA诱导的和TgMMTV-重量1IF染色K5阳性的肿瘤和人类基底样肿瘤倾向于使用K5/6抗体染色阳性[1,12,18,26]从而表明，这两个物种的基底样肿瘤具有共同的K5蛋白表达，这是一个显著特征。

小鼠和人类的“管腔肿瘤”共同特征与共同的基础特征不同，但确实包括高表达的SPDEF公司,XBP1型和GATA3协议（图3立方厘米)并且这两个物种的管腔肿瘤也染色为K8/18阳性（图2并查看[18]). 然而，对于这个管腔簇中的许多基因，两个物种之间的相对表达水平不同。例如，一些基因在两个物种的肿瘤中一直很高（例如，XBP1型,SPDEF公司和GATA3协议)，而其他，包括TFF公司,SLC39A6型，以及FOXA1公司在人类管腔肿瘤中高表达，在小鼠肿瘤中低表达。值得注意的是，人类腔上皮基因簇总是包含雌激素-受体(急诊室)和许多雌激素调节基因，包括TFF1型和SLC39A6型[22]; 由于大多数小鼠乳腺肿瘤，包括此处所述的肿瘤，均为ER阴性，ER和大多数ER调节基因明显缺乏参与，这可能解释了一些人类腔上皮基因在小鼠中表达不一致的差异。

物种间还发现了其他几个显著和值得注意的特征，包括“增殖”特征，其中包括有充分记录的增殖标记Ki-67（图第三版) [1,27,28]和干扰素调节模式（图第3页) [27]. 人类基底样肿瘤和pRb功能受损的小鼠模型（即IX组和X组肿瘤）的增殖特征最高。目前，干扰素对人类乳腺肿瘤生长调节的影响尚不清楚，而具有这种表达特征的小鼠模型（TgMMTV-Neu公司、TgWAP-Tag、，第53页^-/-移植和棘突肿瘤）可能为今后研究这一途径提供一个模型。成纤维细胞剖面图（图3克)在具有棘突形态的小鼠样品和TgWAP中高度表达-Myc公司在许多人类管腔和基底样肿瘤中也观察到“棘状”肿瘤；然而，平均而言，这种分布在小鼠肿瘤中的表达水平较低，这与组织学上观察到的上皮细胞与基质细胞的相对比例一致。

通过这些分析，我们还发现了一种潜在的新人类亚型（图三、顶行-下图组和其他数据文件6）。这种亚型在人类和鼠-人联合数据集中都很明显，被称为“克劳丁-罗”亚型，其特征是紧密连接和细胞间粘附相关基因的低表达，包括克劳金斯3,4,7,闭塞素，以及E-钙粘蛋白（图三维). 这些人类肿瘤(n个=13）还显示管腔基因低表达，基础基因表达不一致，淋巴细胞和内皮细胞标记物高表达。该组中除一个肿瘤外，其余肿瘤均为临床ER阴性，均被诊断为II或III级浸润性导管癌（附加数据文件7为代表性苏木精和伊红图像）；因此，这些肿瘤似乎不是小叶癌，这可能是因为它们的低表达E-钙粘蛋白该组的独特性得到了与小鼠棘突样肿瘤共有的间充质表达特征的支持（图3克)在这些人类肿瘤附近聚集，并且缺乏克洛丹基因簇（图三维). 需要进一步分析以确定这些人类肿瘤的细胞起源。

跨物种扩增的共同区域

小鼠C3（1）-标签肿瘤和人类基底样肿瘤的一个子集显示出一组基因的高表达，包括克拉2,益普索8,Ppfibp1型,苏尔布，以及Cmas公司，它们都位于对应于人类染色体12p12和小鼠染色体6的同步区（图3小时).克拉2扩增与C3肿瘤进展相关（1）-标签模型[29]和单倍体功能不全克拉2延缓肿瘤进展[30]. 高共表达克拉2-连锁基因促使我们测试DNA拷贝数的变化是否也可能是克拉2在人类肿瘤的一个子集中。事实上，通过定量PCR检测的16例人类基底样肿瘤中有9例在卡拉斯2基因座；然而，在卡拉斯2在这16个基底样肿瘤中的任何一个。此外，范·比尔斯等. [31]据报道，人类12号染色体的这一区域在47%的巴西航空公司1-相关肿瘤的比较基因组杂交分析；巴西航空公司1-已知相关肿瘤具有基底样分子特征[三,32]. 在培养的人类乳腺上皮细胞中，显示出基底/肌上皮特征[1,33]转化需要高致癌性H-ras和SV40大T抗原的表达[34]. 综上所述，这些发现表明卡拉斯2可能影响细胞表型或确定基底样肿瘤的易感靶细胞类型。

鼠人共有的内在特征

为了同时对小鼠和人类肿瘤进行分类，我们确定了人类乳腺肿瘤内在列表（Hu中描述的1300个基因等. [21])以及在此开发的小鼠内在列表（866个基因）。这两个列表的重叠共有106个基因，当用于层次聚类分析时（图4)确定了四个主要组：最左边的组包含所有人类基底样、“克劳丁-罗”和5/44 HER2+/ER肿瘤，以及小鼠C3（1）-标签、TgWAP-标签和棘突肿瘤。第二组（从左到右）包含来自人类和小鼠的正常样本、人类HER2+/ER-和10/92管腔肿瘤的一小部分（6/44），以及剩余的鼠基底样模型的很大一部分。根据临床标准，这两组中几乎所有人类肿瘤在临床上都被归类为ER阴性。

图4

使用两个物种固有列表共同的基因子集（106个总基因）对小鼠和人类肿瘤进行聚类分析。（a）根据人类肿瘤亚型进行颜色编码的实验样本相关树状图，下面的矩阵显示小鼠肿瘤起源。（b）完整的106基因簇图。（c）已知对人类基底样肿瘤重要的基因的特写。（d）已知对人类管腔肿瘤（包括ER）重要的基因的特写。（e）HER2/ERBB2/NEU的表达模式。

第三组包含33/44人HER2+/ER肿瘤和小鼠TgMMTV-Neu公司、MMTV-PyMT和TgWAP-Myc公司样品。虽然人类HER2+/ER肿瘤主要为ER阴性，但通过免疫组织化学评估的比较基因组分析及其角蛋白表达谱表明，HER2+/ER人类肿瘤起源于“管腔”，而不是表现出基底样特征[18]. 第四组和最右侧组由ER-阳性的人类管腔肿瘤和小鼠TgWAP组成-国际3(缺口4)肿瘤为一组。这些数据表明，尽管许多小鼠和人类肿瘤位于包含大多数小鼠腔模型和人类HER2+/ER-肿瘤的大树状图分支上，但我们测试的小鼠模型均未显示出强烈的人类“腔”表型，其特征是高表达急诊室,GATA3协议,XBP1型和FOXA1公司这些分析表明，MMTV等小鼠管腔模型-Neu公司显示了他们自己独特的特征，这是一种相对较弱的人类管腔表型，缺少ER信号。显示在图的底部4这里讨论的是生物学上重要的基因吗？之前显示的基因是人类基底样肿瘤标记物（图4c类)，人类管腔肿瘤标记物，包括ER（图第4天)和HER2/ERBB2/NEU（图第四版).

定义人类肿瘤和小鼠模型的基因集的比较

我们使用了第二种分析方法，称为基因集富集分析（GSEA）[35]寻找人类肿瘤亚型与小鼠模型之间的共同关系。对于该分析，我们首先对微阵列（SAM）进行了两类不成对显著性分析[36]对图中定义的十个小鼠组进行分析1，并获得了定义每组的高表达基因的列表。接下来，我们使用每个人类亚型与所有其他人类肿瘤进行了类似的分析。最后，使用GSEA将小鼠列表与每个人类亚型列表进行比较，GSEA利用了基因列表重叠和基因等级（表2). 我们发现小鼠第九组(第页=0.004）和X(第页=0.001），包括pRb-缺陷/p53缺陷模型的肿瘤，与人类基底样亚型有显著重叠，并且与人类管腔肿瘤呈反相关(第页分别为0.083和0.006）。III组小鼠肿瘤（TgMMTV-重量1大多数）明显重叠的人类正常乳房样本(第页=0.008），可能是由于两组中管腔和基底/肌上皮基因簇的表达。第四组(Brca1-缺乏和重量1)显示出显著的关联(第页=0.058），具有人类基底样剖面。小鼠VI组（TgMMTV-Neu公司和TgMMTV-PyMT公司)显示出一种近乎显著的关联(第页=0.078）与人类管腔轮廓，与人类基底样亚型不相关(第页= 0.04). 最后，小鼠II组脊髓样肿瘤与人类“克劳丁-罗”肿瘤有显著重叠(第页=0.001），这进一步表明这可能是一种独特的新型人类肿瘤亚型。

表2十组小鼠与五种人类亚型的基因集富集分析

我们还使用每个小鼠模型作为路径扰动的代表，使用转基因“事件”作为定义组的手段，进行了两类非配对SAM分析。将产生重要基因列表（错误发现率（FDR）=1%）的模型与上述每个人类亚型进行比较（附加数据文件8）。基于SV40 T抗原的模型（所有C3（1）-Tag和WAP-Tag肿瘤）与人类基底样肿瘤有显著重叠(第页=0.002），并与人类管腔类别略有反相关。BRCA1缺陷模型（所有BRCA1^+/-;第53页^+/-IR和布尔卡1^{有限公司/有限公司};TgMMTV-核心；第53页^+/-肿瘤）对人类基底样肿瘤的影响较小(第页= 0.088). TgMMTV-Neu公司肿瘤与人类管腔肿瘤在名义上有显著差异（在多重比较校正之前）(第页=0.006），与人类基底样肿瘤不相关(第页= 0.027).

两种最重要的人类乳腺肿瘤生物标志物是ER和HER2；因此，我们也对这两个标记的相关数据进行了分析。在这里检测的232例人类肿瘤中，137例具有通过免疫组织化学和微阵列数据评估的ER和HER2数据。如前所述[三,18,21]，肿瘤固有亚型与ER和HER2临床状态有很高的相关性(第页<0.0001）：例如，81%的ER+肿瘤为管腔型，63%的HER2+肿瘤被归类为HER2+/ER-，80%的ER-和HER2-肿瘤为基底样亚型。使用GSEA，我们比较了图中定义的十个鼠标类1（附加数据文件9）和基于小鼠模型的基因列表（额外数据文件10）添加到基于人类ER和HER2状态进行监督分析获得的人类数据/基因列表中（请注意，仅使用HER2状态的分析（即HER2+与HER2-），ER+和HER2+与其他类别相比不被纳入人类类别，因为HER2状态仅在HER2扩增子上产生基因，ER+和HER2+分类没有产生显著的基因列表）。我们发现小鼠的第IX组(第页=0.009）和X(第页=0.003）肿瘤与ER-HER2-人类肿瘤有显著重叠，并且与人类ER+肿瘤显著反相关(第页分别为0.024和0.043）。VI组小鼠样品（TgMMTV-Neu公司和TgMMTV-PyMT公司)同样显示出与ER+人类肿瘤相同的富集趋势，与ER-HER2-类呈反相关。尽管并不完美，但这些GSEA结果与我们从图中观察到的结果一致1和三并且再次证明，人类和小鼠之间强烈共享基底样轮廓，而管腔轮廓显示了物种之间的一些共享和独特特征。

讨论

小鼠肿瘤的基因表达谱分析及其与人类肿瘤的比较确定了与单个小鼠模型、一般小鼠模型以及两种癌症相关的特征。首先是发现一些小鼠模型在模型中发展出高度相似的肿瘤，而其他小鼠模型在表达和组织学表型上表现出异质性。对于同质模型，由于个体间的混淆差异较小，因此简化了对治疗进展或反应的研究。这种一致性的一个例子甚至延伸到了TgC3（1）中发生的次要事件-标签模型中，许多肿瘤共享扩增和高表达克拉2（图3小时)-这一特征在人类基底样肿瘤的一个子集中也很明显。

与“同质”模型相比，TgWAP等模型-T型 ₁₂₁ 、DMBA诱导和布尔卡1^{有限公司/有限公司};TgMMTV-核心；第53页^+/-，其中给定模型中的单个肿瘤通常显示不同的基因表达谱和组织学。这些模型很可能属于可以解释其异质性的三种场景之一：第一种，以TgWAP为代表-T型 ₁₂₁ 模型[37]是因为转基因只负责启动肿瘤发生，使进展事件随机进化，潜伏期更长。这种模型可能会产生不同的肿瘤亚型，这取决于肿瘤进展过程中被中断的后续通路。第二种可能性是，起始事件会产生基因组不稳定性，因此多个不同的路径可能会受到实验因果事件的影响，这可能是布尔卡1-灭活肿瘤。第三种情况是，转化的目标细胞是一个多功能祖细胞，能够分化为多种上皮细胞系，甚至间充质细胞系（例如，DMBA诱导的和布尔卡1^{有限公司/有限公司};TgMMTV-核心；第53页^+/-); 角蛋白IF分析支持这一假设，即使在组织学上同质的肿瘤中，也存在两种类型的上皮细胞（图2克/千克). 两种上皮细胞标记物阳性的单个细胞亚群也支持这种可能性（图第2节). 其他假设包括多种细胞类型维持转化事件的可能性，以及广泛的非细胞自主组织反应的发生。无论这些异质模型的转换范式如何，对进展或治疗反应的研究最好是通过首先按亚型进行亚设定，然后关注生物表型来完成。

人类肿瘤和潜在的小鼠肿瘤之间的基因组比较至少有两个主要应用。首先，此类研究应确定包含特定类别人类肿瘤的个体和/或全局特征的模型。这里确定的重要全局特征的例子包括将小鼠和人类肿瘤分为基底组和管腔组。似乎有四种小鼠模型出现了潜在的管腔样肿瘤（TgMMTV-Neu公司、TgMMTV-PyMT公司、TgWAP-Myc公司和TgWAP-国际3)这并不奇怪，因为MMTV和WAP都被认为在分化的肺泡/腔细胞中直接表达[38,39]; 然而，值得注意的是，不同物种的管腔分布在统计学上并不显著，可能是因为小鼠管腔肿瘤中缺乏ER和ER调节基因。一些小鼠模型确实显示出与人类基底样肿瘤一致的表达特征，包括TgC3（1）-标签、TgWAP-标签和布尔卡1-缺陷模型。用于TgC3的SV40 T抗原（1）-标签和TgWAP-标签模型使p53和RB失活，这也是人类基底样肿瘤中发生的两种可能的事件，因为已知这些肿瘤具有包涵体第53页突变[2]，具有较高的有丝分裂级别和最高的增殖基因表达（图三) [2,三]，这是已知的E2F目标[40]. 人类乳腺癌的增殖特征本身就是预后[41]，也是对化疗反应的预测[42]. 这些数据表明，人类基底样肿瘤可能会损害RB功能，并突出了小鼠和人类乳腺癌的一个重要共同特征。

这个发现布尔卡1损失（与第53页突变）在小鼠中引起具有基础样表型的肿瘤是显著的，因为人类携带巴西航空公司1种系突变也会导致基底样肿瘤[三,32]和大多数人类巴西航空公司1突变型肿瘤p53缺乏[43,44]. 这些数据表明，基底样细胞类型或其祖细胞的保守易感性是由于巴西航空公司1,TP53型，以及皇家银行-路径丢失。大多数DMBA诱导的癌也表现出基底样细胞谱系特征，这表明这种细胞类型也容易受到DMBA介导的肿瘤发生的影响。最后，一些TgMMTV-重量1通过基因表达，肿瘤表现出基底样和管腔样特征的结合，这与该模型的肿瘤通常包含两种乳腺上皮细胞系的观察结果一致[45].

比较研究的第二个主要目的是确定对小鼠模型的分析可以在多大程度上告知人类疾病并指导进一步的发现。通过对这里发现的新的潜在人类亚型（即克劳丁-罗亚型）的分析，我们发现了一个告知人类疾病的小鼠模型的例子。需要进一步分析以确认这是否是真诚地亚型；然而，具有统计学意义的基因与组织学上不同的小鼠肿瘤亚群重叠表明它是一个独特的生物实体。指导人类发现小鼠肿瘤的第二个例子是人类基底样肿瘤亚群和小鼠基底样TgC3中含有K-Ras扩增子的共同关联（1）-标签菌株肿瘤。

所有比较研究的一个重要警告是，小鼠和人类之间存在明显的生物学差异，这可能会或可能不会直接影响疾病机制。上述与内质网及其下游通路相关的生物学可能是固有物种差异的一个潜在例子。在人类，内质网在管腔肿瘤中高度表达[1]管腔表型的特点是一些受ER调节的基因的高表达公共关系和重新注册[22]以及其他可能受GATA3调节的管腔基因，包括AGR2公司和K8/18号[46]. 在小鼠中，ER的表达在我们测试的所有肿瘤中都很低甚至没有，就像大多数人类ER反应基因的表达一样。这一发现与之前的报告一致，即大多数晚期小鼠乳腺肿瘤为ER阴性([47]和中的引用）。然而，值得注意的是，两个人类管腔肿瘤定义基因(XBP1型和GATA3协议[46]，均在小鼠管腔肿瘤中高表达（附加数据文件2）。综上所述，这些数据表明，人类“内脏”轮廓实际上可能是至少两个轮廓的组合，其中一个是ER调节的，另一个是GATA3调节的；支持之间的链接GATA3协议管腔细胞起源于GATA3协议小鼠选择性丢失GATA3协议在乳腺中导致管腔细胞缺乏，或管腔细胞数量和/或成熟度显著下降[48,49]. 这些结果表明，在这里测试的小鼠模型中，人类管腔肿瘤中存在的ER调节基因盒缺失，GATA3介导的管腔信号仍然存在。由于小鼠的部分管腔肿瘤特征，我们认为小鼠管腔模型，包括TgMMTV-Neu公司这里描述的最像人类管腔肿瘤，更确切地说可能是管腔B肿瘤，这是一种内质网低表达且预后不佳的管腔肿瘤[2,三,21]. 而人类HER2+/ER亚型肿瘤和小鼠TgMMTV-Neu公司、TgMMTV-PyMT公司、和TgWAP-Myc公司在内部共享集群中彼此相邻（图4)，所有其他数据都反对这种关联。已经建立了一些小鼠ER阳性乳腺肿瘤模型[50–53]; 然而，这里没有对这些模型进行分析。

值得注意的是，本研究中检测到的许多表达模式仅在一个物种中观察到（附加数据文件5），其中一些差异可能是由于技术限制，而不是反映出重要的生物学差异。两个表达数据集之间的比较，尤其是来自不同物种的表达数据集，仍然是一个技术挑战。因此，我们承认根据数据分析方法引入工件的可能性。然而，我们相信，这里描述的分析确定了许多常见的和生物学相关的簇，包括增殖、基底上皮、干扰素调节和成纤维细胞特征，从而表明跨物种的数据组合行为确实保留了单个数据集中的重要特征。在本研究中，我们没有观察到许多小鼠乳腺癌模型，还有更多的模型将被开发出来。像我们在这里讨论的13个模型一样，我们预计其中一些模型将与人类亚型具有重叠的基因表达模式，而其他模型则不会。我们认为，有必要对更多样本进行额外研究，包括每个物种的更多多样性。这些分析确实证实了这样一种观点，即没有一种小鼠模型能够完美地代表人类乳腺癌亚型；然而，小鼠模型确实显示出与特定人类亚型的共同特征，正是这些共同点将为许多未来的研究奠定基础。

材料和方法

小鼠和人类肿瘤

小鼠肿瘤样本是从多名参与的研究人员那里获得的，他们都按照国际公认的指南维持小鼠并在0.5-1cm阶段收获小鼠肿瘤。有关菌株背景、启动子、转基因和特定等位基因等的详细信息，请参阅附加数据文件1。使用机构审查委员会（IRB）批准的方案从新鲜冷冻原发性乳腺肿瘤中收集所有人类肿瘤样本，并按照[21–23]. 这些人体样本的临床和病理信息可从北卡罗来纳大学微阵列数据库（UMD）获得[54].

微阵列实验

从小鼠肿瘤和FVB和BALB/c近交系的野生型乳腺样品中收集总RNA。根据制造商的协议，使用RNeasy Mini Kit（美国加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen Inc.）纯化RNA，使用20-30 mg组织。使用RNA 6000纳米实验室芯片试剂盒评估RNA完整性，然后使用生物分析仪进行分析（安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉，美国）。使用低RNA输入扩增试剂盒（Agilent）逆转录、扩增总RNA（2.5μg）并用Cy5标记。这些实验的通用参考RNA样本包括从等量的C57Bl6/J和129只雄性和雌性第1天幼崽（来自北卡罗来纳州Cam Patterson博士的礼物）中采集的总RNA。对参考RNA进行逆转录、扩增并用Cy3标记。将扩增的样品和参比物与安捷伦小鼠寡核苷酸微阵列（G4121A）共杂交过夜。然后在GenePix 4000B扫描仪（美国加利福尼亚州桑尼维尔市分子设备公司）上对其进行清洗和扫描，并使用GenePix4.1软件进行分析，然后上传到我们的数据库中，在该数据库中自动执行Lowess归一化。

微阵列数据分析

所有初级微阵列数据均可从UMD获得[54]以及GSE3165系列（小鼠和新人类数据）、GSE1992、GSE2740和GSE2741（之前发布的人类数据）下的基因表达总览[55]. 通过要求两个通道中的Lowess归一化强度值大于30来筛选所有分析的基因。日志₂然后报告每个基因的Cy5/Cy3比率。在最终的数据集中，只包括70%或更多样本中报告值的基因。基因以中位数为中心，然后使用Cluster v2.12进行分层聚类[56]. 对于小鼠非监督分析和人-鼠非监督聚类分析，我们在至少三个或更多样本中筛选出变化至少三倍或更多的基因。对基因和阵列进行平均连锁聚类，并使用JavaTreeview v1.0.8进行聚类查看和显示[57].

小鼠固有基因集分析

根据122份小鼠样品的无监督聚类分析中的皮尔逊相关值0.65或更大，选择实验样品的内在“组”。该分析由Max Diehn/Stanford University使用内在基因标识符v1.0进行[1]. 从文件中删除了技术复制品，并给每个高度相关节点的成员提供了相同的类号，给每个不在0.65相关性截止值范围内的样本一个自己的类。使用这些标准，确定了16组样品（参见这些组的附加数据文件1），并使用低于平均固有基因值的一个标准偏差标准选择了866个“固有”基因列表。使用此处使用的232个样本中的146个样本的子集创建了包含1300个基因的人类内在列表，并在Hu中进行了描述等. [21].

共识聚类

抄送[20]使用基因模式1.3.1（2005年1月6日建立）在当地进行，该模式从布罗德研究所的分发网站下载[58]. 对所有基因的小鼠数据集进行分析，仅对固有基因进行分析。K类数（或重点类数）的范围从2到15，用于评估各种可能的组。使用具有平均链接的欧几里得距离测度，我们在列和行归一化的情况下重新采样1000次。

结合小鼠和人类表达数据集

Jackson实验室的小鼠基因组信息学（MGI 3.1）报告了同源基因。对于人类和小鼠数据集，分配给安捷伦寡核苷酸探针ID号的基因座链接ID用于分配给MGI ID号。如果单个基因由多个探针表示，则使用冗余探针的中值。这导致总共14680个安捷伦探针的直系配对。在合并这两个数据集之前，每个数据集都被列标准化为N（0,1），行中值居中，探针标识符被转换为MGI ID。在两个数据集中，通过过滤器（与上述相同）的基因中的小鼠和人类MGI标识符的交集在总组合数据集中产生了7907个同源基因。接下来使用距离加权判别法对该数据集进行系统偏差校正[24]. 最后，将组合数据集用于平均连锁层次聚类分析。

基因集富集分析

我们采集了232份人体样本，根据仅对人类数据集（附加数据文件6）的聚类分析，使用Hu开发的新的固有/UNC人类基因列表，将其分为基底样、管腔样、HER2+/ER-、克劳丁低和正常乳腺样等. [21]. 其次，还根据图中的聚类模式对小鼠样本进行了分类1使用小鼠固有基因列表，并分配到I-X组。使用1%的FDR分别对每个鼠类和所有其他鼠类进行两类非配对SAM分析[36]产生了10个类别特异性基因列表。仅使用与每次分析相关的高表达基因集（忽略与给定类别相关的低表达基因），GSEA[35]使用GSEA R包在R（v.2.0.1）中执行[59]. 然后将这10个小鼠基因集与每个人类亚型基因集进行比较，并报告了显著的丰富性。对于这些丰富的统计强度，GSEA使用家族错误率（FWER）来校正多次测试，并使用FDR来减少假阳性报告。所有GSEA使用的参数为：nperm=1000，weighted.score.type=1，nom.p.val.threshold=-1，fwer.p.val.threshald=-1、fdr.q.val.treshold=0.25，topgs=12，adjust。FDR.q.val=FALSE，gs.size.threshold.min=25，gs.size.threshold.max=2000，reverse.sign=FALSE，preproc.type=0，random.seed=3338，perm.type=0，fraction=1，replace=FALSE。

免疫荧光

使用标准免疫染色方法处理石蜡包埋切片（5μm厚）。抗体及其稀释度为α-细胞角蛋白5（K5，1:8000，PRB-160P，Covance，Berkeley，CA，USA）和α-细胞角蛋白8/18（Ker8/18，1:450，GP11，Progen Biotecknik，Heidelberg，Germany）。简而言之，载玻片通过一系列二甲苯和分级乙醇步骤脱蜡和水合。在沸腾的柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中进行热介导表位检索15分钟，然后将样品冷却至室温30分钟。用于免疫荧光的二级抗体与Alexa Fluor-488或-594荧光团（1:200，Molecular Probes，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）缀合。IF样品用VectaShield Hardset和DAPI安装介质安装（Vector，Burlingame，CA，USA）。

人KRAS2扩增试验

我们使用来自16个基底样肿瘤、一个正常乳腺组织样本、2个白细胞DNA和3个管腔肿瘤的基因组DNA进行实时定量PCR和荧光熔融曲线分析。使用DNAeasy试剂盒（Qiagen）提取DNA，并使用以下温度参数在LightCycler上进行扩增：95°C，8分钟；57°C 50次循环，6s；72°C，6秒；95°C，2秒；然后冷却至60°C，并以0.1°C/s的速度上升至97°C。使用LightCycler Faststart DNA Master SYBR Green I试剂盒（美国印第安纳波利斯罗氏应用科学公司），每个PCR反应在10μl反应中包含7.5 ng模板DNA。每个基因的相对DNA拷贝数是通过导入外部效率曲线并使用“正常”乳房样本作为内部校准品来确定的。对于每个样本，KRAS2的拷贝数除以ACTB和G1P3的平均拷贝数。如果相对折叠变化大于五个对照样品（两个正常白细胞样品和三个管腔肿瘤）平均值的三个标准偏差，则称任何肿瘤的扩增。

其他数据文件

本文的在线版本提供了以下附加数据。附加数据文件1是一个列出小鼠肿瘤和正常样本相关数据的表格，包括来源、转基因和启动子信息。附加数据文件2是所有小鼠肿瘤的完整无监督聚类图。样本根据其来源的小鼠模型进行着色，并使用三倍或更多样本的变异过滤器选择基因。附加数据文件三ia使用866基因小鼠固有基因列表绘制了完整的小鼠模型聚类图。附加数据文件4提供了应用于鼠标模型的CC分析。（a）CC矩阵使用866基因小鼠固有列表生成，聚类号为K=2到K=15。（b）经验累积分布（CDF）图对应于K=2至15范围内的一致性矩阵。（c）CC直接与基于层次聚类的结果进行比较。图中的树状图1（使用固有基因集）如图所示，下面是一个彩色矩阵，显示了基于CC中不同数量的K簇的样本分配。通过比较，显示了使用所有基因对小鼠数据集进行的分析（底部矩阵）。附加数据文件5是232份人类乳腺肿瘤样本和122份小鼠乳腺肿瘤样本的组合基因表达模式的完整无监督聚类图。这种无监督的聚类分析基于人类和小鼠微阵列之间的同源基因重叠，然后我们选择在三个或更多阵列上变化三倍或更多的基因子集。附加数据文件6显示了使用Hu的人类固有/UNC基因集对232个人类样本进行的聚类分析等. [21]. 该分析用于确定人类样本亚型（类基底、管腔、HER2+/ER-等），然后用于各种SAM和GSEA分析。样品根据其亚型进行着色：红色=类基底，蓝色=管腔，粉色=HER2+/ER-，黄色=claudin-low，绿色=正常乳房。附加数据文件7使用苏木精和伊红切片显示了六种不同人类“克劳丁-罗”肿瘤的组织学特征。附加数据文件8显示了小鼠路径模型与五种人类亚型的GSEA。附加数据文件9显示了10种小鼠类型的GSEA与ER阴性患者的临床ER状态和HER2状态。附加数据文件10显示了小鼠通路模型的GSEA与ER阴性患者的临床ER状态和HER2状态。