Pinocembrin通过失活αvβ3整合素/FAK/p38α信号通路抑制TGF-β1诱导的人Y-79视网膜母细胞瘤细胞上皮间质转化和转移

摘要

背景

蜂胶中最丰富的黄酮类化合物是松茸素。在本研究中，我们研究了松属素对TGF-β1诱导的人Y-79视网膜母细胞瘤细胞上皮-间充质转化（EMT）和转移的抗转移作用。

结果

首先，研究结果表明，在非细胞毒性浓度下，松柏素显著抑制TGF-β1诱导的Y-79细胞侵袭和迁移能力。Pinocembrin降低TGF-β1诱导的Y-79细胞波形蛋白、N-钙粘蛋白、αv和β3整合素的表达。分子数据还显示，松属素抑制TGF-β1诱导的基质金属蛋白酶-2/9（MMP-2/-9）的酶活性、蛋白和信使RNA水平下调所涉及的黏着斑激酶（FAK）和p38α信号的激活。其次，松霉素还强烈抑制κBα抑制剂（IκB a）的降解和核因子κB（NF-κB）的核水平。此外，在松柏素处理下，进一步观察到对NF-κB结合能力的剂量依赖性抑制。

结论

研究结果表明，松柏素通过灭活αvβ3整合素/FAK/p38α信号通路，抑制TGF-β1诱导的上皮-间充质转化（EMT）和Y-79细胞的转移。因此，我们的研究结果表明松霉素对视网膜母细胞瘤细胞具有抗癌潜力。

背景

视网膜母细胞瘤是儿童（0-5岁）最常见的原发性眼内肿瘤。在美国，这种疾病最常见的是单侧散发性肿瘤，而较少出现双侧遗传性肿瘤。这种疾病有两种类型，遗传遗传型和非遗传非遗传型。约55%的视网膜母细胞瘤儿童为非遗传型。具有遗传形式的儿童在以后的生活中有罹患其他癌症的高风险。如果不治疗，患者会在两年内死于颅内扩张和疾病传播[1]. 人类视网膜母细胞瘤具有侵袭和转移的模式。直接侵袭沿着视神经扩散到大脑，也可以植入眼眶组织和邻近骨骼[2]. 目前的治疗方法包括眼球摘除术、外照射放疗、冷冻疗法、光凝、光凝和化疗[三]. 尽管这些方法的存活率超过95%，但仍需要更好的治疗方案来改善遗传性视网膜母细胞瘤的视觉效果并避免眼球摘除[4–6]. 因此，对转移进行有效的化学预防治疗将对视网膜母细胞瘤死亡率产生重要影响。

肿瘤细胞的转移是一个复杂的多阶段过程。为了促进细胞运动，入侵细胞需要改变细胞间的粘附特性，重新排列细胞外基质（ECM）环境，抑制失巢凋亡并重组细胞骨架[7]. 整合素是一个跨膜粘附受体家族，由19个α和8个β亚单位组成，它们以非共价方式相互作用，形成多达24种不同的异二聚体受体。整合素与ECM蛋白结合或整合素交联增加FAK的酪氨酸磷酸化[8]. FAK是一种非受体酪氨酸激酶，主要定位于细胞基质粘附，是影响细胞生存、分化、增殖、迁移和组织重塑的局灶粘附的中心调节器[9–11]. 一旦定位于跨膜整合素受体聚集的位点，酪氨酸磷酸化FAK在多种细胞外信号触发的信号转导中发挥重要作用[12]并代表生长因子和整合素激活的信号通路之间协同相互作用的收敛点[13–15]. 最近有报道称，癌干细胞与上皮-间充质细胞转化（EMT）之间存在联系，研究表明，当上皮细胞失去特征，获得间充质特性，变得能动时，就会发生形态和分子变化，在癌细胞的侵袭中起着关键作用[16,17]. 蜗牛（蜗牛1）、鼻涕虫（蜗牛2）、ZEB1或Twist的表达，以及间充质标记物如N-cadherin和vimentin的表达和E-cadherin的丢失是EMT的关键分子标记[18]. 转化生长因子β1（TGF-β1）是肿瘤EMT的主要诱导因子。TGF-β1是一种多效性细胞因子，可以通过多种信号通路介导广泛的细胞效应。一些研究报告称TGF-β1可以促进血管生成，促进侵袭，并抑制宿主免疫系统[19].

松霉素（5,7-二羟基黄酮，图1A） 是蜂胶中的一种水不溶性黄酮，以纯化合物的形式提取。它也存在于坚果松、桉树叶和阿拉伯胶中。现在松属素可以通过合成获得，因此数量丰富[20]. 松果体蛋白已被证明具有广泛的药理作用，包括抗菌作用[21,22]，抗氧化剂[23]、抗诱变和抗炎活性[24,25]. 尽管许多研究表明，松霉素具有多种生物学特性，但该化合物对癌症的作用机制尚不清楚。根据我们的研究结果，我们推测松脂素可能具有抗转移特性。因此，本研究利用TGF-β1作为诱导剂诱导Y-79视网膜母细胞瘤细胞的EMT，并研究松属素对该细胞模型的抗转移作用及其作用机制。

图1

松属素对Y-79细胞活力和生长的影响。（A）松脂素的化学结构。（B）在不同浓度（0、5、10、20、40、60、80和100μM）下，用或不用松霉素处理培养细胞24小时。然后，通过MTT法测定细胞活力。（C）细胞固定并用PI染色，然后用流式细胞仪（FACS）分析细胞周期分布。（D）使用或不使用药物（10 ng/ml TGF-β1和5μM松脂蛋白）处理细胞24 h，并通过MTT法测定细胞活力。值代表三个独立实验的平均值±SD(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01,***第页 < 0.001，与未经治疗的对照组（剂量0）相比。

方法

试剂和抗体

松胚蛋白（纯度≧95%）购自Extrasynthesis（法国Genay）。聚-D-赖氨酸、二甲基亚砜、Tris-HCl、EDTA、SDS、苯甲基磺酰氟、牛血清白蛋白（BSA）、明胶、结晶紫、亮氨酸肽、Nonide P-40、脱氧胆酸、原钒酸钠、鼠αvβ3整合素特异性单克隆抗体和选择性αvβ3-整合素拮抗剂环RGD（cycloRGDfV）肽购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）；蛋白质检测试剂盒从Bio-Rad Laboratories（Hercules，CA，USA）获得。Dulbecco的磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶-EDTA和RPMI 1640培养基购自Life Technologies，Inc.（Gibco/BRL，Gaithersburg，MD）。Matrigel从BD Biosciences（马萨诸塞州贝德福德）购买。抗E-钙粘蛋白、N-钙粘素、波形蛋白、FAK、FAK（Tyr397、Tyr576、Tyr 925）、ERK1/2、ERK1/2（Thr202/Tyr204）、JNK1/2、JNK1/2（Thr183/Tyr185）、p38α和p38α（Thr180/Tyr182）的抗体购自Cell Signaling Tech.（美国马萨诸塞州贝弗利）。NF-κB（p50和p65）、β-肌动蛋白和C23抗体购自BD转导实验室（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。增强化学发光（ECL）试剂盒购自Amersham GE Healthcare UK Ltd（英国白金汉郡）。

细胞培养和松脂素处理

人类视网膜母细胞瘤Y-79细胞系来自BCRC（台湾新竹生物资源收集研究中心）。细胞在37°C的5%CO湿化环境中培养₂-95%空气。在补充有10%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和抗生素（100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素）的培养基中。Y-79细胞悬浮培养，浓度为10⁵-10⁶细胞/ml。在所有抗转移检查中，细胞培养在多聚-D-赖氨酸涂层培养板中。将松属素原液溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，并通过0.2μm圆盘过滤器过滤消毒。向培养基中添加适量的松霉素储备溶液（DMSO中的1 mg/ml），以达到指示的浓度（最终DMSO浓度小于0.2%）。

细胞活力测定

为了评估pinocembrin的细胞毒性，进行了MTT[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基-四唑仑溴化物]测定以确定细胞活力[26]. 简单地说，细胞以4×10的密度播种⁴细胞/ml置于24孔板中24小时。然后，在不同浓度下用或不用松霉素处理细胞24小时。每个浓度重复三次。此外，为了进一步研究松属素和/或TGF-β1是否影响细胞活性，在有或无药物（10 ng/ml TGF-？和5μM松属素）的情况下处理Y-79细胞24小时。暴露期后，取出培养基，然后用PBS洗涤细胞。然后，更换培养基，用MTT溶液（5mg/ml）/孔孵育4小时。去除培养基，将formazan溶解在异丙醇中，并在563 nm处进行分光光度测定。通过与未经处理的对照细胞进行比较，估计活细胞的百分比。

流式细胞术分析

采用流式细胞术和FACScan（Becton Dickinson Immunocytometary Systems，UK）测定松属素对Y-79细胞周期进展和TGF-β1诱导的avβ3整合素表达的影响。首先，为了分析细胞周期的分布，首先用不同浓度的松属素处理细胞24小时，然后用胰蛋白酶化法收集细胞，用75%的无水乙醇固定，用PBS洗涤，再悬浮在含有0.5 mg/ml RNase A和0.01 mg/ml碘化丙啶（PI）的1 ml PBS中室温下在黑暗中放置30分钟。用流式细胞仪分析细胞周期曲线。使用ModFit LT 3.0软件（Verity software，Topsham，ME）分析细胞周期亚G1、G0/G1、S和G2/M期的细胞百分比。此外，用流式细胞术测定avβ3整合素的细胞表面表达。将Y-79细胞置于六孔培养皿中。然后用PBS清洗细胞，并在37°C下用胰蛋白酶分离。细胞在含有1%多聚甲醛的PBS中固定10分钟。在PBS中冲洗后，将细胞与抗avβ3整合素的鼠抗人抗体（1:100）在4°C下孵育1 h。然后再次清洗细胞，并用异硫氰酸荧光素结合的山羊抗兔次级IgG（1:100；Leinco Tec.Inc.，St.Louis，MO，USA）孵育45分钟，然后用流式细胞仪进行分析。

细胞基质粘附试验

用5μg/ml抗αvβ3单克隆抗体（mAb）或80 nM环RGD肽（cyclo-RGDfV）预处理Y-79细胞30分钟，然后用10 ng/ml TGF-β1在5μM松柏素存在或不存在的情况下刺激24小时。随后，以1×10的密度接种细胞⁵细胞/ml，置于24孔板中，涂有500μl IV型胶原（10μg/ml）；然后培养30分钟。然后，用PBS洗涤液去除非粘附细胞，并将粘附细胞固定在乙醇中。用0.1%结晶紫染色后，在0.2%Triton X-100中溶解固定细胞，并在550 nm处进行分光光度测定。

跨井侵入和迁移分析

通过在6孔培养皿中使用悬挂细胞培养插入物（BD Biosciences，San Jose，CA；孔径，8-μm）进行侵袭和迁移测定。通过侵袭试验测定Y-79细胞通过涂有Matrigel（BD Biosciences）的滤膜的能力。用过滤蒸馏水将Matrigel稀释至200μg/ml，并涂敷在过滤器插入物的上表面。简单地说，用5μg/ml抗αvβ3单克隆抗体（mAb）或80 nM环RGD肽（cyclo-RGDfV）预处理Y-79细胞30分钟，然后用10 ng/ml TGF-β1在5μM松柏素存在或不存在的情况下刺激。24小时后，用胰蛋白酶分离细胞，并在无血清培养基中重新悬浮。将含有10%胎牛血清的培养基作为化学引诱剂应用于下腔，然后将细胞以1×10的密度接种在上滤器上⁵无血清培养基中的细胞/ml。将平板在37°C、5%CO2中孵育24小时，从孔中取出过滤器插入物，并用棉签擦拭过滤器上表面的细胞。过滤器用甲醇固定10分钟，用Giemsa染料染色1小时，然后在光学显微镜下计数侵入过滤器下表面的细胞。数据显示为随机选择的字段中附着到底部表面的平均单元数。每项实验一式三份。为了测量Y-79细胞的迁移能力，将细胞接种到带有8μm孔聚碳酸酯过滤器的跨孔中，该过滤器未涂覆基质凝胶。在有或无药物（TGF-β1和松属素）的情况下处理迁移细胞。迁移试验按侵袭试验所述进行测量。

电泳分析法

电池（4×10⁵细胞/ml）接种到培养物中，用10ng/ml TGF-β1刺激2小时，然后在不同浓度的皮诺伞蛋白（0、1、2.5和5μM）中孵育24小时。随后，收集条件培养基并进行明胶酶谱分析，以检测MMP-2和MMP-9的活性。样品与加载缓冲液混合，在含有0.1%明胶的8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。在140和110 V下电泳3小时。然后将凝胶在酶谱洗涤缓冲液中洗涤两次（2.5%Triton X-100在双蒸馏H中₂O） 室温下去除SDS，然后在37°C下在酶谱反应缓冲液（40 mM Tris–HCl，10 mM CaCl）中培养12–16小时₂，0.02%NaN_三)，用考马斯蓝R-250（0.125%考马斯亮蓝R-250，0.1%氨基黑，50%甲醇，10%乙酸）染色1h，用脱色溶液（20%甲醇，10%醋酸，70%双蒸馏h）脱色₂O） ●●●●。使用数字成像分析系统通过密度计测量来量化代表MMP-2和MMP-9潜在形式水平的非染色带。

总RNA的分离、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和DNA电泳

使用总RNA提取Midiprep系统（台湾Viogene BioTek公司）从人类Y-79细胞中分离出总RNA。总RNA（2μg）用1μl dNTPs（2.5 mM）、1μl寡核苷酸dT（10 pmole/μl）、1微升RTase（200 U）、1微米RNase抑制剂和5倍反应缓冲液转录成20μl cDNA。合适的引物（MMP-2，5′-GGCCCTCGTCACTCGAGAGAT-3′nt 1337-1356；MMP-2的反义，5′-GGCATCCGGTTACGGGGA-3′，nt 2026-2007；MMP-9，5′-AGGCCTACAGTGTTG-3′nt 1201-1220；MMP-9,5′-CAGTCCAACAAGAAGAGAGAGGT-3′nt 1700-1683；GADPH，5′-CGGAGTCAACAGGTGTGT-3′，nt94-126；反义5′-AGCTCTCCATGGTTGAAGAC-3′，nt399-375）用于PCR扩增。采用铂Taq聚合酶（Invitrogen）在以下条件下进行PCR：94°C 30个循环1分钟，59°C（MMP-2）或60°C（MMP-9和GAPDH）1分钟，72°C 1分钟，然后在72°C下10分钟。

蛋白质印迹分析

如前所述，制备细胞的胞浆和核部分[27]. 蛋白质印迹法如下。变性样品（50μg纯化蛋白）在10-12%的SDS-PAGE凝胶上溶解。然后将蛋白质转移到硝化纤维素膜上。用含有1%（w/v）脱脂奶粉和0.1%（v/v）吐温-20（TBST）的Tris缓冲盐水（TBS）阻断膜的非特异性结合超过2小时。用TBST清洗膜三次，持续10分钟，并在4°C的TBST中用适当稀释的特定一级抗体培养过夜。随后，用TBST清洗膜，并用适当的二级抗体（辣根过氧化物酶偶联山羊抗鼠或抗兔IgG）孵育1小时。在TBST中清洗膜三次10分钟后，使用ECL Western印迹检测试剂通过增强化学发光进行带检测，并在FUJFILM Las-3000 mini（日本东京）中暴露ECL超膜。然后使用FUJFILM-Multi-Gauge V3.0软件通过密度计定量测定蛋白质。

电泳迁移率变化分析（EMSA）

用细胞核提取缓冲液提取细胞核蛋白，并通过电泳迁移率偏移分析（EMSA）进行测量[28]. 电池（1×10⁵/ml）收集在PBS缓冲液（pH 7.4）中，并在2000×克在4°C下保持5分钟。用缓冲液A（10 mM HEPES，1.5 mM MgCl）溶解细胞₂、10 mM KCl、0.5 mM DTT和0.5 mM PMSF（pH 7.9），含5%NP-40），在冰上放置10分钟，然后旋转剪切细胞质膜。以2000×克在4°C下保持10分钟。用高盐缓冲液B（20mM HEPES、420mM NaCl、1.5mM MgCl）提取含有细胞核的颗粒₂0.5 mM DTT、0.5 mM PMSF、0.2 mM EDTA和25%甘油）在冰上放置15分钟。裂解物在13000×克在4°C下保持10分钟。收集含有核蛋白的上清液，并在-80°C下冷冻直至使用。核组分的蛋白质含量用Bio-Rad蛋白质分析法测定。共有NF-κB结合序列的合成双链寡核苷酸5′-AGTTGAGGGGACTTCCCAGC-3′和3′-TCAACTCCCTGAAAGGGTCCG-5′用生物素末端标记。含有5μg核蛋白的结合反应，双蒸馏H₂O、 2μl 10倍结合缓冲液、2μg聚（dI·dC）和2 pmol寡核苷酸探针在室温下培养15分钟。通过添加超过200倍的未标记探针作为特定竞争对手进行特定竞争结合分析。蛋白质-DNA复合物形成后，将样品加载到0.5×TBE缓冲液中6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上，然后通过转移印迹仪转移到带正电荷的硝化纤维素膜（Millipore，Bedford，MA，USA）上，并在Stratagene交联剂中交联。用链霉亲和素-辣根过氧化物酶观察凝胶位移，然后进行化学发光检测。

瞬时转染和荧光素酶报告基因检测

通过NF-κB荧光素酶报告基因的表达来测定NFκB转录活性。Y-79电池（4×10⁴细胞/孔）被镀在六孔板中。根据制造商的方案，使用Lipofectamine Plus与质粒pGL3-NF-κB、pCMV-β-gal和pcDNA3.1瞬时共转染细胞。简单地说，将含有0.5μg pGL3-NF-κB和0.2μg pCMV-β-gal的转染混合物与Lipofectamine Plus试剂混合并添加到细胞中。8 h后，用10 ng/ml TGF-β1刺激细胞2 h，然后在5μM松脂蛋白中培养0、1、3、6和9 h。然后根据制造商的说明测量NF-κB-荧光素酶活性（Promega）。简单地说，用冷PBS洗涤细胞两次，并通过添加100μl 1X报告裂解缓冲液（24 mM Tris–HCl（pH 7.8）、2 mM二硫曲醇、2 mM-EDTA、10%甘油和1%Triton X-100）（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）进行裂解。离心后（13000×克，2 min），使用Sirus光度计（Berthold检测系统；OAK Ridge，TN），使用10μl细胞裂解液和100μl荧光素酶分析试剂（Promega）测量样品的荧光素素酶活性。荧光素酶活性以10 s的延迟和30 s的整合时间进行测量，并将其归一化为β-半乳糖苷酶或Renilla荧光素酶活性，以确定转染效率。所示值表示三次独立转染的平均值，每次转染一式三份。

统计分析

数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。使用方差分析（ANOVA）对结果进行统计比较。重大差异发生在第页 ≤ 0.05.

结果

松霉素对Y-79细胞的细胞毒性

在这项研究中，我们首先检测了pinocembrin对Y-79细胞的细胞毒性的影响。如图所示1B、 在0-5μM的浓度范围内，松霉素对Y-79细胞的细胞毒性没有影响。为了验证这一点，在随后的所有实验中都应用了剂量范围，以避免细胞生长和细胞毒性对观察到的功率计的影响，并进行了一系列研究，以测量细胞生长和对松柏素刺激的细胞毒性。首先，通过流式细胞术测定松霉素对Y-79细胞周期进展的影响（图1C） 这表明，5μM松属素处理24小时对细胞周期分布没有影响。在较高浓度（10、20、40、60、80和100μM）下，松霉素增加了G1组分（从60.26%增加到73.57%），导致细胞明显聚集在G1亚期，同时以剂量依赖性的方式降低了S组分。因此，结果表明，以0至5μM的浓度处理24小时后，对Y-79细胞没有细胞毒性。此外，如图所示1D、 在存在TGF-β1的情况下，5μM浓度的松属素对细胞活力没有任何毒性作用。因此，在随后的实验中使用了非细胞毒性浓度的pinocembrin（0-5μM）。

Pinocembrin通过αvβ3整合素抑制TGF-β1诱导的Y-79细胞基质粘附、侵袭、迁移和上皮-间充质转化

先前的研究表明，TGF-β1通过αvβ3整合素信号影响细胞的侵袭和迁移[29]. 因此，我们假设αvβ3整合素信号通路可能参与TGF-β1诱导的Y-79细胞的细胞基质粘附、侵袭和迁移。首先，为了研究低细胞毒性的松属素是否抑制TGF-β1诱导的Y-79细胞粘附特性，进行了细胞基质粘附试验。如图所示2A、 TGF-β1（10 ng/ml）处理Y-79细胞可诱导细胞粘附。特别是，5μM松属木霉素抑制了TGF-β1诱导的Y-79细胞粘附47.3%。用5μg/ml抗αvβ3单克隆抗体（mAb）或80 nM环RGD肽（cyclo-RGDfV）预处理Y-79细胞30分钟，然后用50 ng/ml TGF-β1在5μM松柏素存在或不存在的情况下刺激24小时。用抗αvβ3单克隆抗体或环RGD肽预处理Y-79细胞，分别使TGF-β1诱导的细胞粘附降低39.7%和49.3%。此外，与仅使用TGF-β1治疗相比，联合使用抗αvβ3单克隆抗体或环RGD肽和松属素分别减少了TGF-？诱导的细胞粘附75%或75.7%。环状RGD肽（cyclo-RGDfV）已被证明能以高亲和力结合αvβ3，并在低浓度下有效阻断其功能。此外，我们还研究了松属素对Y-79细胞侵袭和迁移的影响。如图所示2B和C，用5μM松脂蛋白处理细胞，结果表明，与仅用TGF-β1处理相比，TGF-α1诱导的Y-79细胞的侵袭和迁移明显减少。用5μg/ml抗αvβ3单克隆抗体或80 nM环RGD肽预处理细胞30 min，均能显著抑制TGF-β1诱导的细胞侵袭和迁移。此外，与仅使用TGF-β1治疗相比，联合使用抗αvβ3单克隆抗体或环RGD肽和松属素分别减少了64.3%或70.3%以及65.7%或74.0%TGF-？诱导的细胞侵袭和迁移。上皮-间充质转化（EMT）是侵袭性癌细胞发展过程中的一个关键进展。我们评估了松霉素对EMT标记的影响。通过TGF-β1的刺激，松果体蛋白治疗增加了E-钙粘蛋白水平，降低了波形蛋白和N-钙粘蛋白（图2D） ●●●●。综上所述，这些结果表明，pinocembrin可能通过激活αvβ3整合素受体来抑制TGF-β1诱导的肿瘤粘附、侵袭和高转移性Y-79细胞的迁移。

图2

松霉素对TGF-β1诱导的Y-79细胞的细胞基质粘附、侵袭、迁移和上皮-间充质转化的抑制作用涉及αvβ3整合素的激活用5μg/ml抗αvβ3单克隆抗体（mAb）或80nM环状RGD肽（cyclo-RGDfV）预处理Y-79细胞30分钟，然后用10ng/ml TGF-β1在存在或不存在5μM pinocembrin的情况下刺激24小时，然后按照方法中所述进行细胞基质粘附分析。（B）在侵袭试验中，用5μg/ml抗αvβ3单克隆抗体（mAb）或80 nM环RGD肽（cyclo-RGDfV）预处理细胞30分钟，然后在有或无5μM松柏素的情况下用10 ng/ml TGF-β1刺激细胞24小时。然后用transwell检测8小时的侵袭力；聚碳酸酯过滤器（孔径为8μm）预涂有基质凝胶。培养8小时后，固定过滤器底部的细胞，染色并计数。（C）使用聚碳酸酯过滤器，通过transwell测量6小时的迁移分析。培养6小时后，固定、染色和计数过滤器底侧的细胞。（D）用TGF-β1（10 ng/ml）在不含或含有5μM松属素的情况下预处理细胞0、30、60、120、180 min，然后用Western blotting法用抗E-钙粘蛋白、抗N-钙粘素、抗波形蛋白和抗β-肌动蛋白抗体测定细胞溶解物提取物，如方法所述。值代表三个独立实验的平均值±SD(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01,***第页 < 0.001与仅TGF-β1治疗相比）。

Pinocembrin抑制TGF-β1诱导的Y-79细胞整合素水平

整合素将ECM与细胞内细胞骨架结构和信号分子联系起来，并参与许多细胞过程的调节，包括粘附、信号传递、运动、存活、基因表达、生长和分化[30]. 在这里，我们探讨了松柏素对TGF-β1诱导的Y-79细胞整合素表达的影响。首先，用TGF-β1（10 ng/ml）预处理细胞，然后在不同浓度的松属素（0、1、2.5和5μM）中培养6 h。如图所示三A、 pinocembrin显著抑制TGF-β1诱导的Y-79细胞αν和β3整合素的表达水平。此外，用TGF-β1（10 ng/ml）预处理细胞，然后在5μM松脂蛋白中培养不同时间长度（0、30、60、120和180分钟）。随后的时间进程实验表明，当松脂蛋白浓度为5μm时，松脂蛋白αν和β3整合素的表达也以时间依赖的方式减少（图三B） ●●●●。此外，流式细胞术数据还表明，松霉素降低了TGF-β1诱导的ανβ3整合素的表达（图三C） ●●●●。

图3

松属素对TGF-β1诱导的Y-79细胞整合素水平的抑制作用。（A）用TGF-β1（10 ng/ml）对细胞进行预处理，然后在不同浓度的松属素（0、1、2.5和5μM）中培养6 h，并分析整合素。（B）用TGF-β1（10 ng/ml）预处理细胞，然后在5μM松脂蛋白中培养不同时间长度（0、30、60、120和180分钟），然后分析整合素。（C）流式细胞术检测整合素的表达。数值表示为三个独立实验的平均值±SD。*第页 < 0.05, **第页 < 0.01,***第页 < 0.001与0h治疗时间相比。

Pinocembrin抑制TGF-β1诱导的Y-79细胞MMP-2和MMP-9的表达

为了研究松柏素对TGF-β1诱导的MMP-2和MMP-9酶活性的抑制作用，采用明胶酶谱法检测条件培养液中MMP-2、MMP-9的活性，采集条件培养液，在松柏素处理或不处理的情况下刺激TGF-。MMP-2和MMP-9均在Y-79细胞的条件培养液中检测到，而TGF-β1显著增加了MMP-2、MMP-9的活性。此外，松霉素以剂量依赖性的方式抑制TGF-β1刺激的MMP-2和MMP-9活性（图4A） ●●●●。Western blotting分析进一步证实了所获得的酶谱结果。如图所示4B、 1μM松柏素处理可降低TGF-β1诱导的MMP-2或MMP-9的蛋白表达水平，而5μM松木素显著抑制TGF-。为了确定松霉素抑制MMP-9或MMP-2蛋白表达是否是由于转录水平降低，我们进行了RT-PCR并观察了MMP-2和MMP-9的mRNA表达。如图所示4C、 松柏素以剂量依赖性方式降低TGF-β1诱导的Y-79细胞MMP-2和MMP-9 mRNA表达。这些数据表明，pinocembrin可阻止MMP-2和MMP-9对TGF-β1的转录。这些结果表明，松属素的抗转移作用与抑制肿瘤转移的酶降解过程有关。

图4

松霉素对TGF-β1诱导的Y-79细胞活性和MMP-2/-9表达的抑制作用。用TGF-β1（10 ng/ml）对无血清培养基中培养的细胞进行预处理，然后在不同浓度的松属素（0、1、2.5和5μM）中培养。（A）收集条件培养基，通过明胶酶谱测定MMP-2/-9活性。（B）Western blotting分析MMP-2/-9蛋白表达。（C）RT-PCR检测MMP-2/-9 mRNA的表达。采用β-肌动蛋白和GADPH作为内部控制。

Pinocembrin抑制TGF-β1诱导的Y-79细胞FAK/p38α磷酸化

在许多信号传导环境中，粘附期间的FAK信号传导被证明能够调节整合素介导的信号传导并参与细胞转移，但其活性的机制尚不完全清楚。为了研究蛋白质是否可能磷酸化，我们通过TGF-β1诱导的非Smad（FAK/MAPK）和Smad信号通路的表达，进行了一项时间进程分析，以阐明其潜在机制。如图所示5A、 pinocembrin降低了TGF-β1诱导的Y-79细胞中Tyr 397、576和925位点FAK磷酸化。然而，松脂素并没有引起FAK总蛋白水平的任何变化。此外，MAPK家族也是FAK信号传导的靶点，因此我们接下来研究了Y-79细胞中JNK、p38α和ERK1/2的磷酸化。数据表明，松柏素降低了TGF-β1诱导的Y-79细胞p38α磷酸化，但不降低磷酸化JNK和磷酸化ERK。此外，我们发现pinocembrin在任何测量时间都不会导致磷酸-Smad2与总Smad2的比率出现任何显著偏差（图5B） ●●●●。JNK、ERK、p38α和Smd2的总蛋白水平与TGF-β1和松属素处理没有变化。

图5

松属素对TGF-β1诱导的Y-79细胞FAK/p38α磷酸化的抑制作用。（A和B）用TGF-β1（10 ng/ml）预处理细胞2 h，然后在5μM pinocembrin 0、1、2、3和6小时。通过Western blotting测定FAK（Tyr397、Tyr576、Tyr 925）、Smad2、JNK1/2、ERK1/2、p38α的总蛋白和磷酸化水平。β-肌动蛋白被用作内部控制。

松果体蛋白抑制TGF-β1诱导的Y-79细胞NF-κB的DNA结合活性及NF-κ的B和IκBα的表达

MMP-2和MMP-9基因的表达是通过NF-κB与其在MMP-2、MMP-9启动子中的结合序列的转录水平相互作用来调节的。化学预防性植物化学物质的主要分子靶点之一NF-κB[31]是一种转录因子，参与多种细胞过程，包括细胞因子基因表达、细胞粘附、凋亡和转移[32]. 这些炎性转移介质被发现被松霉素治疗改变。因此，我们使用转录激活分析来确定松脂素是否影响NF-κB依赖性转录。用TGF-β1刺激后，荧光素酶活性增加了约5倍，而TGF-？诱导的NF-κB活性则被松霉素以时间依赖的方式抑制（图6A） ●●●●。NF-κB的p65和p50亚单位已被证明在MMP-2/MMP-9基因的转录中发挥关键活性。此外，NF-κB的活化是通过IκBα的磷酸化而发生的，释放核因子κB进行核转位，从而与靶基因的启动子位点结合。因此，我们还进行了Western blot分析，以检测NF-κB（p65和p50）和IκBα的表达，以阐明松属素的抑制作用6B、 用5μM松柏素预处理细胞9 h，可显著抑制IκBα降解和NF-κB（p50/p65）核移位。由于TGF-β1刺激的NF-κB活化与IκBα降解相关，pinocembrin通过抑制IκBα的磷酸化来阻断TGF-β1诱导的IκBα降解。为了进一步确定NF-κB与MMP-2/MMP-9启动子结合位点结合的可能性，使用特定的寡核苷酸进行EMSA，如图所示6C、 在5μM的浓度下，松脂素强烈抑制TGF-β1刺激的NF-κB DNA结合活性。

图6

松属素对TGF-β1诱导的NF-κB转录活性/NF-κ子B/IκBα磷酸化和降解的抑制作用。（A）用TGF-β1（10 ng/ml）预处理细胞2 h，然后用5μ如方法中所述，0、1、2、3和9小时的松脂蛋白，以及通过荧光素酶报告基因分析的NF-κB转录活性。（B）对核提取物进行SDS–PAGE，然后用特异性内酰脲（抗NF-κB p50、抗NF-κB p65、抗p-IκBα、抗IκBα）进行蛋白质印迹。采用C23和β-actin作为内部对照。（C）EMSA测定的NF-κB DNA结合活性，如方法所述。通道1：核提取物与100倍多余的未标记共识寡核苷酸（comp.）孵育，以确认结合特异性。通道2表示不含TGF-β1（阴性对照）的Y-79细胞的核提取物。值表示三个独立实验的平均值±SD。(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01,***第页 < 0.001与仅TGF-β1治疗相比）。

讨论

视网膜母细胞瘤是儿童（0-5岁）最常见的原发性眼内肿瘤。由于其有局部侵袭和继发转移的倾向，通常预后较差。最近，抗转移药物被定义为一类新的癌症化学预防剂。松茸蛋白是蜂胶中含量最高的类黄酮之一。黄酮类化合物是一大类异质多酚，被认为对人类健康有积极影响，包括预防癌症。各种研究表明，松霉素具有多种抗癌作用，包括预防、抗癌和抗增殖作用体内和在体外模型。特别是，松脂素可以影响几个过程，并在调节各种分子靶点，包括NF-κB中发挥重要作用[33]、Smad2和PPARγ转录因子[34]、血管内皮生长因子[35]，转化生长因子-β1[34]、坏死因子-α、白细胞介素-1β、细胞间粘附分子-1、血管细胞粘附分子-1炎症细胞因子[36]，第38页地图[37]、ERK1/2和PI3K/Akt蛋白激酶[38]和其他酶（COX-2和MMPs）[39,36].

与EMT诱导相关的TGF-β1的促肿瘤活性已被证明适用于不同的肿瘤类型[40]. 一些报道表明，TGF-β1已被确定为肿瘤EMT的主要诱导剂。TGF-β1诱导的EMT导致上皮细胞极化形态的破坏，肌动蛋白应力纤维的形成，以及细胞迁移的增强[41]. TGF-β1分泌因子家族参与控制不同的生物过程，包括细胞增殖、分化和凋亡。此外，最近有报道称TGF-β1信号通路与癌细胞在细胞侵袭和肿瘤转移中的结合[42]. TGF-β1的这些作用与其诱导EMT和刺激细胞迁移的能力有关。此外，一些非Smad途径也被证明可以介导TGF-β1的细胞效应。其中包括ERK、JNK、p38 MAPK和PI3K/Akt。在这项研究中，我们已经证明，松柏素通过p38α信号通路抑制TGF-β1诱导的EMT。

我们进一步研究了E-cadherin、N-cadherin和vimentin表达水平的影响。E-cadherin是一种粘附连接蛋白和I型跨膜糖蛋白，在维持正常组织结构和抑制肿瘤侵袭中起着关键作用[43]. 先前的一项研究表明，E-钙粘蛋白介导的黏附丧失在上皮性肿瘤从良性向侵袭性转变中起着重要作用[44]. 最近的证据表明，另一种粘附分子N-cadherin的表达增加与肿瘤细胞侵袭潜能的增强有关。据报道，N-钙粘蛋白在鳞状细胞癌细胞系中诱导与E水平降低相关的间充质分散表型[45]. 波形蛋白是一种间充质标记物，已在一些癌细胞中观察到。以前已经证明波形蛋白在肝转移癌细胞中的表达显著增加[46]. 总之，我们的结果与TGF-β1处理的Y-79细胞中E-钙粘蛋白表达增加以及N-钙粘蛋白和波形蛋白减少的观点一致。细胞间黏附的丧失伴随着上皮结构的分离是细胞运动增强和肿瘤侵袭的先决条件。这些发现增加了N-cadherin和vimentin直接参与侵袭表型的可能性。除了在体外促进Y-79细胞的运动和侵袭活性外，N-cadherin和vimentin的表达还使Y-79细胞对TGF-β1高度敏感，刺激细胞迁移和侵袭以及MMP-2/-9的产生显著增加。当Y-79细胞被松霉素处理时，MMP-2/-9的活性和表达显著降低。值得注意的是，MMP-2/-9在肿瘤进展中发挥作用，因为MMP-2/-9基因在转基因小鼠中的过度表达导致乳腺癌模型中肿瘤发生增强[47]. 此外，Sasaki等人[48]据报道，肿瘤组织中MMP-2/-9 mRNA表达升高的肺癌患者生存率较低。我们已经证明，蛋白水解活性MMP-2/-9的减少参与了松属素介导的细胞侵袭和迁移。此外，MMP-2/-9基因的转录受上游序列调控，包括与NF-κB结合元件相对应的基序[49,50]. 在这里，我们还发现，松柏素通过阻止IκBα磷酸化和增强IκBα蛋白表达来抑制MMP-2/-9的表达，这两者都导致NF-kB DNA结合活性的失活。全面分析MMP-2/-9在Y-79细胞中的表达对于充分了解Y-79细胞的生物学特性和促进新的治疗策略的发展是必要的。

结论

鉴于这些先前的发现，我们提出了pinocembrin抗转移活性的可能机制的示意图。pinocembrin可以通过αvβ3整合素受体和FAK/p38α/NF-κB信号通路降低MMP-2和MMP-9的表达，从而有效抑制TGF-β1诱导的EMT和Y-79细胞的转移（图7). 基于我们的研究结果，我们认为，松果素通过下调早期和长期的内源性信号传导过程，促进了对TGF-β1介导的转移的强大保护作用。本文所揭示的发现和概念为进一步探讨松霉素的作用机制及其在预防肿瘤转移中的潜在有益作用提供了重要依据。

图7

pinocembrin抑制TGF-β1诱导的人Y-79细胞上皮-间充质转化和转移的机制。松果体蛋白通过avβ3整合素受体抑制TGF-β1作用，激活FAK和p38α，导致IκBα磷酸化，NF-κB（p50和p65）活化，核移位，NF-kb B与MMP-2/MMP-9启动子结合位点结合，MMP-2/MMP-9基因表达启动，并有助于抑制细胞EMT和转移。