无Bax时NDV诱导细胞凋亡；线粒体上游凋亡蛋白参与的证据

摘要

背景

最近有研究表明，HeLa细胞感染新城疫病毒（NDV）后，基质（M）蛋白与Bax结合，随后激活了固有的凋亡途径。此外，感染NDV后Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白水平几乎没有变化。

发现

为了进一步研究Bcl-2家族成员的作用，用NDV株AF2240感染Bax基因敲除和野生型HCT116细胞。虽然这两种细胞都通过激活内在途径和线粒体释放细胞色素c而发生凋亡，但Bax基因敲除细胞的死亡百分比明显低于wt细胞（感染后48小时超过10%）。在一项平行实验中，研究了NDV对HT29细胞（最初不含Bcl-2）的影响。HT29细胞的凋亡与Bax从细胞质重新分布到线粒体有关，与HeLa和wt HCT116细胞相似。

结论

尽管在NDV诱导的细胞凋亡过程中Bax的存在有助于更快的细胞死亡，但得出的结论是，线粒体上游的其他凋亡蛋白也参与其中，因为癌细胞无论在存在或不存在Bax的情况下都会死亡。因此，经典的Bax/Bcl-2比值可能不是NDV诱导的细胞凋亡的主要决定因素。

调查结果

新城疫病毒（NDV）是一种高度传染性的禽流感病毒，属于该属腮腺炎病毒属来自副粘病毒科[1,2]. 由于新城疫病毒在大多数鸟类中造成高死亡率，因此其对全世界家禽业造成的经济损失是公认的[三,4]. 根据其致病性，NDV株主要分为三种主要的病理类型[5,6]中生菌株导致临床上较低或不明显的呼吸道疾病，中生菌株引起中间症状并具有中等死亡率，最后是速生菌株，导致严重的肠道损伤和神经系统影响，死亡率很高。马来西亚NDV株AF2240是1960年代在该国暴发期间分离出来的一种内脏营养性快速繁殖株，目前主要用作马来西亚疫苗试验中的挑战病毒[7]. 另一方面，由于NDV可以选择性杀伤人类癌细胞，因此NDV在癌症病毒治疗中也获得了很大的兴趣[5]. 研究表明，NDV通过激活线粒体途径诱导癌细胞凋亡[8,9]. 已知Bcl-2家族的蛋白质是该途径的中枢调节器[10]. Bcl-2蛋白本身起着促生存因子的作用，而Bax等促凋亡成员则启动凋亡[11]. Bcl-2家族的所有成员通过其被称为Bcl-2同源（BH）结构域1至4的保守结构域相互作用或与其他蛋白质相互作用[12]. Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Bak、Bid和Bad是调节线粒体膜通透性转换孔（MPTP）的已知成员[13——16]充当细胞凋亡的检查点。我们最近发现NDV的基质（M）蛋白通过BH3结构域与HeLa细胞中的人Bax蛋白直接相互作用[17]. 这种相互作用激活Bax，随后启动线粒体释放细胞色素c，进一步激活内在途径。NDV感染后，一些细胞系中caspase-3等caspase的激活也被频繁报道[8,18——20].

Bax基因敲除细胞对NDV感染更具抵抗力

在目前的研究中，研究了NDV在缺乏Bcl-2和Bax的情况下对癌细胞的影响；HT29人结肠腺癌细胞系（最初不含Bcl-2，从ATCC购买）、HCT116 Bax−/−（由美国马里兰州约翰霍普金斯医科大学的Bert Vogelstein善意提供）和wt结肠癌细胞系（由美国加利福尼亚大学欧文分校的Eric Stanbridge善意提供）在6孔培养板中培养，并按照标准方案感染NDV株AF2240（NDV 30 HA单位为1.0×10⁶培养细胞）[21]. Bax杂合子中野生型Bax等位基因的靶向灭活产生Bax缺陷HCT116细胞[22].

感染后，这些细胞株的形态变化和膜泡完全明显。在感染后的不同时间点（18小时、36小时和48小时），通过流式细胞术和PI染色检查细胞的死亡细胞数，并绘制相应的图表（图1). 感染后48小时，75.76%的HT29细胞、68.71%的wt HCT116细胞和58.09%的HCT116 Bax−/−细胞呈阳性染色。HCT116 Bax−/−细胞系中的死亡细胞百分比与wt HCT116之间的差异具有统计学意义。

图1

PI染色NDV感染细胞百分比的比较。通过流式细胞术获得18 h、36 h和48 h不同时间点的数据。误差条表示三个独立测量值的平均值标准误差。感染后48小时HCT116 Bax−/−细胞与wt HCT116细胞的细胞死亡百分比差异具有统计学意义。*，p<0.05。

Bax从细胞质到线粒体的转运

随后，如前所述收集NDV感染细胞的细胞溶质和线粒体部分[9]并用抗Bax克隆2D2抗体（Zymed，USA）对样品进行SDS-PAGE和Western印迹（图2). HT29和wt HCT116细胞系显示，NDV感染后，线粒体部分Bax的数量增加（未显示），而细胞溶质部分Bax检测不到。同时检查敲除HCT116细胞中是否存在Bax。

图2

NDV感染导致结肠癌细胞Bax移位和细胞色素c释放到胞浆中。感染wt HCT116、HCT116 Bax−/−和HT29细胞（感染后18小时、36小时和48小时）进行亚细胞分离。细胞溶质样品用抗Bax克隆2D2和抗细胞色素c克隆7H8抗体进行Western blotting分析。还检查了HCT116 Bax−/−细胞中没有Bax。

NDV感染Bax基因敲除细胞内途径的激活

此外，为了研究NDV感染细胞中的内在途径是否被激活，还通过用抗细胞色素c克隆7H8抗体对细胞液部分进行Western blotting来检测这些细胞从线粒体释放细胞色素c的能力（美国Biovision）（图2). 与先前报道的HeLa细胞相似[9]在NDV感染的HT29和wt HCT116细胞系中，Bax从胞浆转运到线粒体，随后细胞色素c从线粒体释放到胞浆。

此外，NDV感染的HCT116 Bax−/−细胞的细胞溶质部分中细胞色素c的数量也随着时间的推移而增加，这表明即使在没有Bax的情况下，该细胞系中的线粒体凋亡途径也被激活。

讨论

在这项研究中，经过几次试验，发现NDV感染的Bax基因敲除细胞的细胞死亡百分比低于wt细胞。这表明Bax的存在（及其随后与病毒蛋白（如M蛋白）的相互作用）加速了细胞凋亡事件。由于Bax基因敲除细胞在感染病毒后死亡，因此可以得出结论，NDV能够与Bax以外的凋亡蛋白相互作用。细胞色素c释放到胞浆中证明，线粒体途径是通过一些直接或间接影响线粒体表面蛋白质的其他相互作用激活的，从而形成释放线粒体因子的孔。

许多Bcl-2家族成员通过BH域相互作用[12]. 例如，Bax通过其BH3结构域与其中几个蛋白质结合[23,24]导致一系列复杂的相互作用。由于NDV的M蛋白包含一个与Bax相互作用的BH3结构域，因此在没有Bax的情况下，M蛋白可能激活其他促凋亡成员。然而，到目前为止，该病毒蛋白没有与Bad、Bcl-XL和BimL相互作用[17]. 融合（F）蛋白也未能与上述Bcl-2成员相互作用。此外，NDV大（L）蛋白上的BH3样区域尚未检测到其与Bcl-2家族蛋白结合的能力。

Bcl-2通常阻止Bax齐聚，以抑制其插入线粒体[10]. 由于NDV感染在缺乏Bax的情况下也会导致细胞凋亡，因此经典的Bax/Bcl-2比率[10——12]可能不是NDV诱导的细胞凋亡的主要决定因素。这一说法与我们之前的发现一致，即感染NDV后Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白水平几乎没有变化[9,17]. 此外，人们对Bcl-2家族抗凋亡成员在NDV感染过程中的作用知之甚少。由于HT29细胞不含Bcl-2，因此有必要检查Bcl-2的缺失是否在NDV诱导的凋亡中起重要作用，或者其过度表达是否对凋亡率有任何影响。

Bak和Bax具有几乎相同的蛋白质结构，共享相似的BH结构域，是迄今为止发现的唯一两种在线粒体表面形成寡聚孔的促凋亡Bcl-2家族蛋白。在缺乏Bax的情况下，Bak可以独立地从线粒体释放细胞色素c[25]因此，这些特点使其成为未来研究的优秀候选对象。虽然Bax是一种细胞溶质蛋白，Bak定位于线粒体，但它们都通过MPTP孔促进线粒体释放细胞色素c[13,26].

BH3-only成员（如Bid和Bad）位于线粒体的上游，在激活后向线粒体移动，分别激活Bak和Bax[16]并抑制Bcl-2和Bcl-XL功能[15]促进线粒体因子的释放。因此，如果NDV蛋白直接或间接（通过激活BH3-only蛋白）激活HCT116 Bax−/−细胞中的Bak，那么这可能是细胞色素c释放的可能原因。在未来的研究中使用Bak−/-细胞肯定会让我们进一步调查这一假设。另一方面，以前的研究表明，NDV可以杀死对Bak过度表达有抵抗力的Bcl-XL过度表达细胞[27]也克服了Livin的抗凋亡功能[28]是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的一个新成员，在黑色素瘤中经常过度表达。此外，已经发现，在感染RNA病毒期间，IRF-3的BH3样结构域介导与细胞溶质Bax（但不是Bcl-2、Bcl-XL或Bak）结合，诱导Bax活化，最终导致细胞色素c释放和凋亡小体形成[29]. 总之，这可能进一步表明，位于线粒体上游的蛋白质是此类活动的有力候选者。

总的来说，得出的结论是Bax不是NDV蛋白相互作用触发凋亡的唯一细胞蛋白。然而，Bax在HCT116细胞的凋亡中起作用，因为缺乏Bax有助于减缓细胞死亡。这进一步表明Bax和NDV蛋白之间的相互作用，例如与M蛋白的相互作用[17]在NDV诱导的细胞凋亡中起决定性作用。需要进一步研究，以发现NDV蛋白和细胞凋亡蛋白之间的其他可能相互作用。