Wnt和Notch对干细胞自我更新和分化的调节在结肠腺癌序列中是保守的

摘要

背景

结肠癌干细胞是肿瘤中的自我更新细胞，可产生分化程度更高的肿瘤细胞的所有谱系。在这方面，它们与非恶性对应物非常相似，后者负责肠道衬里。这表明，尽管在癌症发生和发展过程中发生了许多遗传变异和形态变化，但仍存在残余的体内平衡调节。

调查结果

使用来自正常组织、腺瘤组织和癌组织的大量人类和小鼠肠道衍生类器官培养物，我们发现Notch信号不仅在正常组织中，而且在小鼠和人类的腺瘤和癌阶段协调自我更新和谱系决定。此外，在几乎所有结肠癌中携带激活突变的Wnt途径，并不像之前预测的那样在腺瘤和癌中具有组成性活性，但仍显示出决定疾病所有阶段干细胞的异质性活性模式。

结论

这些数据首次全面概述了Wnt和Notch介导的信号转导在腺癌序列不同阶段的作用，并表明尽管发生了突变，这些形态发生途径仍然是正常和恶性肠道组织结构和层次的关键决定因素。

介绍

肠干细胞（ISCs）依赖多种形态发生途径的整合，包括骨形态发生蛋白、Hedgehog、Notch和Wnt信号级联，从而确保正常的肠道内稳态[1]. 结直肠癌（CRC）是一个多步骤的过程，在这个过程中，基因突变通过腺瘤病变诱导正常粘膜转变为浸润性癌[2]. 腺瘤的发生可能是通过解除这些形态发生途径的调控。首先，在所有CRC患者中都可以看到导致Wnt级联反应激活的突变[1,三]. 然而，这些激活突变从未导致完全激活，而是导致精细调节的Wnt活性水平[4]. 此外，经常观察到细胞间通路活性的变化。与这些概念相一致的是我们最近的观察结果，它明确指出Wnt通路调控是CRC中癌干的基础[5]. 结肠癌干细胞（CSC）具有高Wnt通路活性的功能，具有自我更新能力，并有分化为癌组织中所有细胞系的潜力[6]. 因此，ISCs和CSCs之间的这些相似性可能表明，在肿瘤发生过程中，对形态发生信号的反应不会丢失。尽管有大量关于形态发生途径在控制肠组织细胞命运和增殖中的作用的数据，但令我们惊讶的是，很少有研究试图全面评估其在肿瘤进展各阶段中的作用。例如，Notch抑制导致腺瘤中杯状细胞积聚[7]Wnt信号在这一阶段的作用知之甚少。

使用来自正常组织、腺瘤组织和癌组织的大量人类和小鼠肠道类器官培养物[8,9]，我们对Wnt和Notch形态发生途径在CRC发展不同阶段的作用进行了全面概述。我们发现，在疾病的各个阶段，Notch抑制降低了茎干，增强了杯状分化。相反，Wnt活性与正常、腺瘤和癌组织中的干细胞有关。我们的结果表明，结肠癌变在早期和晚期始终保持着正常肠道的许多特征。

调查结果

正常肠上皮细胞培养物迅速自组织成典型的由上皮细胞组成的单层类器官结构（EpCAM⁺)围绕中央管腔（图1). 如前所示，类器官包含各种分化的肠道细胞类型，包括神经内分泌细胞（嗜铬粒蛋白A，CHGA）（附加文件1：图S1A）、杯状细胞（MUC2）和肠上皮细胞（Villin）（图1A）[8,9]. 通过MUC2染色判断，腺瘤培养物含有分散的杯状细胞（图1B） ，但似乎缺少CHGA⁺单元格（附加文件1：图S1A）与之前的观察结果一致[10]并在相应的原发肿瘤材料上染色（附加文件1：图S1B）。有趣的是，当分析来自单个细胞克隆并据报道富含CSC的CRC球形培养物时[11]，我们检测到各种血统的存在（图1C） 包括CHGA⁺神经内分泌细胞谱系。这表明，即使在晚期癌症中，也会发生向不同上皮细胞系的分化，并且无论何时，这一过程都可能在疾病的所有阶段进行类似的协调。

图1

CRC发展多阶段肠道培养的多线潜能。共聚焦和免疫组织化学图像的代表性概述，显示了小鼠器官样培养物中的上皮细胞（EpCAM）、杯状细胞（MUC2）和肠上皮细胞（Villin）（A）来自小肠（小鼠）和结肠（人类）的健康上皮，（B）腺瘤（C）腺癌（人类）。比例尺：50μm。

为了解决这个问题，我们首先评估了不同培养物中Notch通路的药理抑制作用。如前所述，二苯氮杂卓（DBZ）介导的Notch抑制导致培养的小鼠肠上皮和腺瘤的杯状细胞分化（附加文件2：图S2）。重要的是，用DBZ处理来自正常、腺瘤或腺癌组织的人类上皮类器官培养物，也会导致杯状细胞明显增加（图2A-B）和对MUC2部队信使核糖核酸水平（图2C） ●●●●。这种杯状细胞样分化似乎只在已经表达少量MUC2的培养物中观察到（附加文件三：图S3）。更重要的是，DBZ治疗后，所有培养物的克隆形成潜能都明显降低，这与（癌症）干细胞的损失一致（图2D和附加文件2：图S2），这意味着Notch路径依赖的自我更新和细胞命运决定在肿瘤发展的所有阶段都保持不变。

图2

Notch通路在整个CRC进展过程中类似地协调。（A）用10μM二苯扎西平（DBZ）处理的人类培养物中MUC2（绿色）的典型共焦显微镜图像显示，MUC2表达增加，分化为杯状细胞系（B）通过计算MUC2的数量来量化杯状细胞的数量⁺10个随机场中的细胞，放大63倍。所示值为MUC2的百分比⁺与单元格总数相关的单元格。（C）用qRT-PCR进一步测量MUC2表达的增加。MUC2部队mRNA水平被标准化为GAPDH公司mRNA和表达为与DMSO对照相比的折叠诱导。该图表示三个不同实验的平均值±SD。（D）DBZ治疗导致克隆发生性降低。所描述的结果具有代表性，来自三个独立的实验，分别来自人类健康结肠类器官（N=2）、腺瘤（N=3）和腺癌（N=3.）。比例尺：50μm.*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001（t检验）。

其次，我们使用TCF/LEF报告子结构（TOP-GFP）仔细评估了所有衍生培养物中Wnt途径的活性[5]. 如上所述，在大肠癌的发展过程中经常观察到Wnt通路的失调，我们已经证明高Wnt活性可以作为腺癌的功能性CSCs标记物[5]. 此外，最近的报告强调了Wnt靶点和干细胞标记物LGR5在腺瘤和癌中的异质性表达[12,13]. 正如预期的那样，通过不同的GFP模式可以检测到健康上皮和腺癌类器官培养物中Wnt途径活性的层次（图三A） ●●●●。有趣的是，腺瘤培养物也显示出异质性Wnt活性，TOP-GFP^高的腺瘤细胞显示高水平的干细胞标记基因。更重要的是，TOP-GFP^高的腺瘤细胞代表克隆形成部分。这表明正常上皮和腺癌CSCs已知的Wnt通路的功能分级也可识别腺瘤的干性（图三C-D）。

图3

功能性Wnt活动在整个CRC开发过程中保持不变。（A）小鼠肠上皮、小鼠腺瘤和人腺癌切片的免疫组织化学染色显示异质性β-连环蛋白细胞内分布，表明Wnt信号层次体内（上面板）。图像以20倍放大率拍摄。TOP-GFP报告子在来自相应组织的培养物中的慢病毒转导显示Wnt活性的异质性在体外（下面板）。共聚焦显微镜图像是在63倍放大率下拍摄的。（B）TOP-GFP的qRT-PCR分析代表图^高的和TOP-GFP^低的小鼠腺瘤培养物的组分。首先用GAPDH mRNA对几个Wnt靶基因和干细胞标记的mRNA值进行标准化，并将其表达为与TOP-GFP相比的折叠诱导^低的.（C）和D）分选后的TOP-GFP细胞中的集落形成效率表明^高的两种小鼠的细胞都表现出较高的克隆形成潜能（C）和人类（D）腺瘤培养。所示数据表示来自小鼠腺瘤培养物（N=2）和人类腺瘤培养液（N=2）的三个独立实验的平均值±SD。比例尺，50μm.*p<0.05，**p<0.01，***p<0.01（t检验）。

讨论

先前的研究强调了Wnt和/或Notch在结肠癌不同阶段的作用。例如，Notch抑制已被证明在小鼠腺瘤中诱导杯状细胞分化，并在结肠CSC中阻断干细胞[7,14]. 同样，我们之前已经证明Wnt活性决定了腺癌衍生结肠CSC中的干细胞。然而，本研究，首次对所有阶段的这些通路进行了全面概述，并通过显示Wnt通路的异质性在所有阶段持续存在，尽管Wnt通路发生明显突变，以及Notch信号在自我更新和细胞谱系决定之间保持平衡，扩展了这些令人惊讶的发现。目前，这种异质性背后的分子机制尚不清楚。然而，该组织似乎纯粹是上皮细胞固有的，因为不存在间充质龛体外试验。由于Wnt/Notch配体产生的paneth细胞的存在，正常上皮类器官培养物中存在Wnt活性差异[15]. 同样，腺瘤或腺癌中Wnt信号的调节也可能通过类似的机制实现。在这方面，值得注意的是，据报道，小鼠腺瘤中存在类泛乙烷细胞，并与LGR5密切相关⁺腺瘤干细胞[13]. 此外，微环境衍生信号，如HGF和Jagged-1[5,16]也可能负责这个Wnt层次结构。

结论

我们对一组独特的培养物的数据显示，在疾病的所有阶段，组织以高度相似的层次结构组织，细胞类型包括多种分化谱系，这些培养物代表正常、恶性肿瘤前病变以及人类来源的腺癌组织。在这里，我们发现Wnt和Notch通路不仅对这一层次结构的协调至关重要，而且它们在调节自我更新和细胞命运方面的功能在癌症发展过程中也保持不变。此外，我们的数据提供了证据，证明正常肠上皮中协调层次结构的强大机制与上皮细胞紧密相连，并且其调控在整个致癌过程中持续存在（图4). Wnt和Notch通路，即使受到突变或异常调节，也在这个层次的调节中保持其中心位置。正常组织和肿瘤组织之间的这些相似性显著地使针对这些途径的靶向治疗具有挑战性，因为它将影响正常层次结构。了解相似性，但首先是分子机制的差异，将有助于突出可用于治疗设计的关键差异。

图4

定义自我更新和谱系规范的信号结构在结肠癌进展中保持不变。虽然基因命中在进展过程中积累（例如，腺瘤中描述为APC突变），但定义自我更新和谱系规范的信号在正常组织和癌组织之间的编排类似。在每个进展步骤的左侧，干性电位由Wnt信号的梯度定义（正常干细胞和癌症干细胞中为绿色，高（深绿色），分化（肿瘤）细胞中为低（浅绿色））。每个进展步骤的右侧部分描述了对特定形态发生线索的反应；在这种情况下，抑制Notch信号促进向杯状细胞（粉红色）分化。

材料和方法

小鼠组织培养

学术医学中心动物实验委员会（DEC）批准了所有动物实验。正常隐窝（C57B7/6）和腺瘤培养（Lgr5-EGFP-IRES-creER^T2段/APC公司^{flox/flox公司})小鼠培养物的产生和维持如前所述[8]和[17]分别是。

人体组织培养

人体组织是根据荷兰法律获得的，并经AMC医学伦理委员会批准。如前所述，培养并维持人类隐窝、腺瘤和癌细胞[9,18].

二苯扎西平治疗和克隆形成性测定

在克隆形成试验中，每孔共镀150个隐窝和5000个腺瘤细胞，一式三份，分别在10μM二苯氮杂卓（DBZ）（默克）治疗3天和7天后测量细胞外生长。对于统计分析，采用了双尾t检验。在10μM DBZ治疗后，在超低贴壁96孔板（Corning）中以1、2、4、8、16、32、64和128个细胞/孔的极限稀释方式测定腺癌的克隆原性。使用R软件包对结果进行统计评估(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html).

慢病毒转导

有机物转导[19]，均使用TCF/LEF报告器执行，驱动GFP表达（TOP-GFP）是Laurie Ailles送的礼物。在克隆原性分析中，对5000个细胞进行了分类（FACSAria，BD）TOP-GFPhigh和TOP-GFFlow。

RT-qPCR分析

使用RNeasy试剂盒（Qiagen）提取总RNA，并使用SuperScript®III逆转录酶（Life Technologies）和随机引物（Invitrogen）合成cDNA，使用2xSYBR Green Master Mix（Roche）进行RT-qPCR测量。有关引物，请参阅附加文件4.

免疫组织化学和免疫荧光

对福尔马林固定石蜡包埋组织的免疫组织化学染色进行分析，并使用标准技术进行分析。8腔培养玻片（BD）用于全贴装免疫荧光染色。图像是在徕卡TCS-SP2上拍摄的。有关抗体，请参阅附加文件4.