唑来膦酸增强多西紫杉醇对骨环境中前列腺癌生长的影响

摘要

背景

在激素抵抗转移疾病发展后，前列腺癌是无法治愈的。最近的化疗史表明，对于难以治疗的疾病目标，组合治疗往往是最好的治愈机会。在本研究中，我们检测了新一代二膦酸盐唑来膦酸（ZOL）和多西紫杉醇对LuCaP 23.1的联合作用，LuCaP是一种前列腺癌异种移植物，在骨环境中生长时可刺激成骨细胞反应。

方法

使用LuCaP 23.1细胞的椎体内注射在骨环境中生成肿瘤，并用ZOL、多西紫杉醇或其组合治疗动物。通过骨密度测量和组织形态计量学分析评估对骨和肿瘤的影响。

结果

ZOL降低了骨环境中LuCaP 23.1的增殖，而有效抑制皮下肿瘤生长的剂量的多西紫杉醇在骨环境中没有表现出任何作用。联合用药显著抑制了LuCaP 23.1肿瘤在骨中的生长。

结论

总之，溶骨抑制剂ZOL与多西紫杉醇联合使用可抑制前列腺肿瘤在骨中的生长，是一种潜在的治疗选择。

背景

晚期前列腺癌（CaP）患者遭受激素难治性疾病和骨转移的严重后果。在发生转移性激素抵抗疾病后，CaP是无法治愈的，中位生存期为9至12个月。考虑到与激素难治性钙磷蛋白和骨转移相关的过程直接导致患者发病率（疼痛、骨折、骨髓衰竭）的近确定性，可消除晚期疾病、减缓进展的治疗方式，或改善晚期CaP患者的生活质量是非常重要的。激素治疗、放射治疗和化疗不能治愈激素难治性疾病[1]. 通过多种机制攻击肿瘤细胞可能被证明更有效地杀死肿瘤细胞；因此，联合化疗是当今临床最有希望的主题之一。

唑来膦酸（ZOL）是新一代双膦酸盐（BPs）中最有效的一种，双膦酸盐是一种抑制骨溶解的化合物，已用于治疗骨疾病和骨转移疾病[2–7]，并刺激癌细胞凋亡[8–10]. ZOL对肿瘤细胞的作用[11,12]包括前列腺肿瘤[13–19]，已在文献中报道。在我们之前的体内我们的研究表明，ZOL不抑制皮下CaP肿瘤的生长；然而，前列腺癌细胞在骨环境中的生长被显著抑制，但肿瘤并未被根除[15]. 我们还表明，ZOL对骨肿瘤影响的可能机制是间接的，通过对骨细胞的影响[19]. 综述了ZOL在肿瘤相关骨病患者治疗中的价值和潜力[5]最近有大量报告证明了ZOL治疗对晚期前列腺癌患者的益处[20–31]. 然而，与我们的临床前研究平行，这些已发表的结果表明，双酚类药物可以减缓疾病的进展，但尚未治愈。因此，将双酚类药物与其他药物（如化疗药物）结合，以控制肿瘤生长，同时调节肿瘤诱导的骨重塑，已成为一种有希望的新治疗策略。

多西紫杉醇是一种微管蛋白解聚抑制剂，已成为治疗晚期CaP最有价值的化疗药物。第二阶段研究表明前列腺特异性抗原（PSA）水平降低，生存率提高，剂量和治疗方案从25–75 mg/m不等²每1或3周[32–37]. 然而，这种治疗的毒性是显著的，尚未完全治愈[34].

最近的化疗史表明，对于难以治疗的疾病目标，组合治疗往往是最好的治愈机会。因此，在各种癌症的治疗中，对双酚类药物与其他药物的组合进行测试具有重要意义。许多关于双酚类药物联合化疗的初步研究都是针对乳腺癌或骨髓瘤进行的，这些肿瘤的骨病变具有高度溶骨性。分类单元与双酚的组合在体外显示出抗肿瘤侵袭和粘附的附加效应[38]诱导乳腺癌细胞凋亡在体外[39]和体内[40]. 此外，在标准化疗中加入双酚类药物可以持续减少乳腺癌患者的骨骼并发症[41–43]. 在晚期CaP患者中，ZOL联合多西紫杉醇和低剂量磷酸雌曲霉素最近被证明可以降低血清PSA和疼痛水平[34]. 此外，沃多斯等据报道，超过一半的患者在2个月时，ZOL与多西他赛联合使用可使血清PSA降低50%以上[25]. 据报道，阿仑膦酸钠联合紫杉醇在预防CaP动物模型骨转移方面比单独治疗更有效[44].

在本研究中，我们使用ZOL和多西紫杉醇联合评估成骨细胞CaP异种移植物LuCaP 23.1的骨重塑和肿瘤生长的变化。

方法

异种移植

所有程序均按照华盛顿大学动物护理和使用委员会和NIH指南进行。LuCaP 23.1是一种产生PSA的人CaP异种移植物[45]在雄性无胸腺小鼠皮下（SC）保存。

椎体内肿瘤及多西紫杉醇和唑来膦酸治疗

40只雄性SCID小鼠（4-6周龄，Fox Chase SCID小鼠，Charles River，Wilmington，MA）右胫骨注射2×10⁵如前所述，LuCaP 23.1细胞[15]. 简言之，1–2×10⁵将10~20μl分离的单个LuCaP 23.1细胞注射到胫骨近端。手术后，动物接受丁丙诺啡作为止痛药（皮下注射2 mg/kg体重），直到完全恢复（通常<24小时）。通过测量血清前列腺特异性抗原（PSA）水平监测肿瘤生长。当骨肿瘤形成时，动物被随机分为4组（血清PSA平均水平：5–10 ng/ml）。分组如下：1）对照组皮下注射PBS；2） ZOL治疗组每周皮下注射两次ZOL（每次2.5μg，~0.1 mg/kg，瑞士巴塞尔诺华制药公司）；3） 多西紫杉醇治疗组，每两周接受一次多西紫杉醇腹腔注射（每次注射400μg，20 mg/kg，Aventis Pharmaceuticals Inc.Bridgewater，NJ）；和4）一组接受ZOL+多西他赛联合治疗，每周皮下注射两次ZOL（每次2.5μg，~0.1 mg/kg），每两周腹腔注射多西他塞（每次400μg，20 mg/kg）。多西他赛溶于乙醇和聚山梨酯80中。注射前用5%葡萄糖制备最终稀释液。每周采集血样以测定血清PSA水平（IMx总PSA测定，伊利诺伊州雅培公园雅培实验室）。在入组7周后处死小鼠。在献祭前测量生长板附近区域的骨密度（BMD）（PIXImus Lunar密度计，GE Healthcare，Waukesha，WI）。在献祭前对胫骨进行了放射学检查。在牺牲时，每组的五个肿瘤胫骨被植入甲基丙烯酸酯中进行骨组织形态计量学（BHM）分析。

骨组织形态计量学

对每组5只动物（Skeletech，Inc.，Bothell，WA）胫骨中部用Goldner染色的钙化胫骨6μm纵切面进行BHM分析。计算胫骨整个纵切面的骨体积百分比和肿瘤体积百分比（分别为%BV/TV和%TuV/TV）。骨小梁的详细分析，包括以μm为单位的小梁厚度（Tb.Th.）、每毫米小梁数量（Tb.N）、以μm为单位的小梁分离（Tb.Sp.）、成骨细胞表面与骨表面的比率（百分比）、破骨细胞数量与骨表面的比率（百分比），在生长板附近的区域（生长板下方0.525–1.225mm，注射部位）进行类骨表面到骨表面的百分比（Os.S/BS）和类骨厚度（Os.Th.）。结果的统计分析是使用配对和不配对的学生t检验进行的。

多西紫杉醇对皮下肿瘤的影响

将LuCaP 23.1肿瘤碎片植入6至8周龄雄性SCID小鼠的右肩胛区。每周测量两次肿瘤体积，计算为L×H×W×0.5236。肿瘤达到200毫米后^三在大小上，动物被随机分为两组。第1组：每两周腹腔注射PBS；第2组：动物每两周腹腔注射20 mg/kg多西紫杉醇（新泽西州普林斯顿市布里斯托尔·迈尔斯施贵宝）。每周监测两次肿瘤生长。当肿瘤达到约1000毫米时，将动物处死^三或者当动物受到伤害时。

结果

LuCaP 23.1导致显著的新骨形成，伴有明显的骨膜反应。ZOL治疗后胫骨的X线照片显示，骨密度较高，周长较小。重要的是，用ZOL和多西紫杉醇联合治疗的胫骨显示出致密骨，骨膜反应减少。因此，X线照片显示，单独使用ZOL和联合使用ZOL+多西紫杉醇均能减少LuCaP 23.1椎体内肿瘤的广泛骨膜骨形成。图中给出了对照组和治疗组动物胫骨射线照相外观的典型示例1安培图中显示了对照组和治疗组胫骨组织学外观的典型示例1B–E级.单独使用ZOL治疗后，肿瘤体积减少（红色/粉红色染色），骨体积增加（绿色染色）（图1摄氏度)或ZOL+多西紫杉醇组合（图1E级)可以在与对照动物的比较中清楚地看到（图1B年). 用ZOL治疗的动物的骨骼在生长板附近的区域似乎更有组织性。这种影响可能是由于该区域的骨体积较大（数据未显示）。

图1

A.治疗和未治疗LuCaP 23.1骨肿瘤的X线照片在对照胫骨中可见LuCaP 23.1刺激的大量新骨形成。尽管ZOL和ZOL+多西他赛也能观察到大量骨形成，但与对照组和多西他xel治疗的胫骨相比，这些胫骨的骨膜活性降低。经治疗和未经治疗的LuCaP 23.1骨肿瘤的组织学外观用Goldner试剂染色的切片显示骨髓或肿瘤区域为粉红色，骨骼为绿色。生长板标有字母G。与对照组（B）和多西他赛组（D）相比，ZOL-（C）和ZOL+docetaxel治疗组（E）的骨体积显著增加，肿瘤体积减少。F.牺牲时的骨密度（BMD）测量测量所有四个治疗组的非肿瘤和肿瘤腿的BMD。肿瘤胫骨的BMD高于非肿瘤胫骨，但四个治疗组之间没有显著差异。

通过测量BMD，进一步评估成骨细胞CaP异种移植物LuCaP 23.1、ZOL和多西紫杉醇对骨的影响。与非肿瘤胫骨相比，所有肿瘤胫骨的BMD均增加（196-240%增加，全部p<0.0001，图1楼). 这些增加是由于LuCaP 23.1以及第2组和第4组服用ZOL刺激成骨细胞活性所致。然而，在四组之间，肿瘤胫骨的BMD没有观察到显著差异。与第1组的正常胫骨相比，第2组和第4组的非肿瘤胫骨的BMD较低但具有统计学意义的增加（第1组：0.0496±0.008 g/cm²，第2组：0.0551±0.001 g/cm²（111%），第4组：0.0605±0.001 g/cm²（122%），两者均<0.002）。

接下来，我们使用骨组织形态计量学对治疗对骨骼的影响进行了更详细的分析。与对照组相比，接受ZOL（2和4）的组的骨%BV/TV分别增加58%和75%（p=0.0836和p=0.0164）。这些结果与胫骨的组织学外观一致（图1B–E). LuCaP 23.1和ZOL均导致骨体积增加；因此，我们无法确定骨体积增加的来源——LuCaP 23.1、仅ZOL或肿瘤体积减少与ZOL的抗吸收特性相结合。在我们的研究中，%BV/TV与BMD值无关。这种不一致可能是由于处理对矿物沉积或所用方法的潜在影响。小梁数目和Tb。所有4组的Sp值相似，有Tb升高的趋势。仅接受ZOL治疗的第2组Th（第2组：p=0.0705）。Os公司。在ZOL治疗的动物中，S/BS降低了35–45%，但这些差异没有统计学意义，在Os中也没有发现差异。各组之间的Th。ZOL给药导致破骨细胞数量减少（表1，第1组与第2组：p=0.0092；第1组与组4：p=0.0030）。成骨细胞周长在任何治疗中都没有显著改变。

表1治疗对LuCaP 23.1和骨影响的组织形态计量学分析结果

我们研究的一个重要目标是确定ZOL和多西紫杉醇及其组合对肿瘤生长的影响。通过PSA血清水平监测治疗过程中的肿瘤生长。与对照组相比，单用ZOL和多西紫杉醇并未降低血清PSA水平（图2B型). 然而，这两种药物的联合使用将血清PSA水平降低至对照动物的约44%（p<0.05）。我们使用BHM分析测量了牺牲时的肿瘤体积。与对照组相比，单独使用ZOL显著降低了肿瘤体积（100.0±8.4%与.57.7±12.8%，p=0.027）。以所用剂量单用多西他赛对肿瘤抑制无效（92.4±16.2%，p=0.689）。重要的是，与对照动物相比，ZOL和多西紫杉醇联合使用可将肿瘤生长降低至36.4±5.00%，p=0.0002。与单独接受ZOL的动物相比，多西他赛联合ZOL治疗导致肿瘤体积减少；然而，这些结果没有达到显著性（63.0±8.6%，p=0.111）。

图2

A.ZOL和多西紫杉醇治疗对骨体积的影响通过骨组织形态计量学分析确定骨体积占总体积的百分比。与对照组相比，ZOL+多西他赛治疗显著增加了骨体积（p=0.0164，*）。%与对照组相比，ZOL组的BV/TV增加，但变化没有达到显著性（p=0.0839）。B.ZOL和多西他赛治疗对血清PSA水平的影响每周从每个治疗组、对照组（■）、ZOL抽血(●)，多西他赛(▼)，或ZOL+多西紫杉醇(○)，并分析PSA水平（ng/ml）。与对照动物相比，ZOL+多西他赛联合用药显著降低了PSA水平。C.ZOL和多西他赛治疗对肿瘤体积的影响通过骨组织形态计量学分析确定四个治疗组的肿瘤体积占总体积的百分比。与对照组相比，ZOL和ZOL+多西紫杉醇治疗显著降低了肿瘤体积（分别为p=0.027、0.0002）。与单独使用ZOL的动物相比，ZOL和多西紫杉醇联合使用可降低肿瘤体积；然而，这些结果没有达到显著性（p=0.111）。

我们还评估了20 mg/kg多西紫杉醇对皮下LuCaP 23.1肿瘤生长的影响。该剂量可有效抑制皮下LuCaP 23.1的生长（图3A级). 接受多西紫杉醇治疗的动物的血清PSA水平也显著降低（图3B公司). 血清PSA水平的降低与肿瘤体积一致。

图3

多西他赛对皮下LuCaP 23.1生长的影响LuCaP 23.1片段植入SC，动物接受20 mg/kg多西紫杉醇或安慰剂治疗。每周测量两次肿瘤体积，每周抽血测定血清PSA水平。绘制平均值±SEM。A.肿瘤体积：与对照组相比，多西紫杉醇给药显著降低了肿瘤体积。B.血清PSA水平：与对照动物相比，多西紫杉醇显著降低了PSA水平。

讨论

CaP是一种极为异质性的疾病，迄今为止，单一药物治疗策略未能治愈晚期前列腺癌。针对不同途径并产生显著且持续的临床活性且无严重毒性的新型多模式治疗组合现在被认为是治疗晚期CaP的下一个前沿领域。然而，正如预期的那样，并非所有联合疗法都优于单一疗法；例如.，ZOL与甲磺酸伊马替布（Gleevec）的组合[46]或大剂量的骨化三醇和地塞米松[27]据报道，除了单药治疗外，没有其他有益的效果。

ZOL最近已成为抑制正常和病理性骨吸收的有效治疗方法，这对骨转移的治疗产生了重大影响。在晚期CaP中，ZOL已被证明能显著降低骨痛和骨骼并发症的发生率[47]. 我们之前已经表明，ZOL在骨环境中抑制成骨细胞LuCaP 23.1的生长[15]我们的新数据表明，低剂量的ZOL（0.1 mg/kg）也能有效抑制LuCaP 23.1在骨中的生长。在之前的一篇文章中，我们报道了ZOL降低PSA水平和肿瘤体积[15]. 差异可能是由于当前研究中使用的ZOL剂量较低。在皮下注射LuCaP 23.1的动物中，多西他赛诱导的血清PSA水平的变化与肿瘤体积有关，而ZOL对LuCaP 23.1的骨治疗降低了肿瘤体积，但血清PSA的变化不显著。我们假设PSA可能并不反映CaP骨转移对ZOL治疗反应的变化，肿瘤生长和PSA表达的调节受到不同信号通路的影响，并且在骨环境中受到不同程度的影响。

尽管ZOL的主要作用是抑制破骨细胞骨吸收[19]，有一些证据表明ZOL具有直接抗肿瘤作用以及与紫杉烷可能的协同作用[9，17，48]。紫杉醇已被证明对实验性CaP骨溶解转移有效[49,50]，多西紫杉醇最近被批准为晚期前列腺癌的标准化疗。在本研究中，每两周给予20 mg/kg多西他赛显著抑制皮下LuCaP 23.1的生长。然而，多西紫杉醇作为一种单一药物对骨中LuCaP 23.1生长的抑制作用并不显著。我们推测多西紫杉醇在成骨细胞环境中的生物利用度可能会降低。

在本研究中，ZOL的给药明显具有使靶细胞对多西紫杉醇作用敏感的作用。事实上，与对照组相比，在存在ZOL的情况下，多西紫杉醇的额外作用（生长减少约37%）几乎与ZOL相同（减少约42%），尽管应该注意到，ZOL和ZOL/多西紫杉醇组合之间的比较没有达到统计学意义，因为在仅使用ZOL的组中存在较高的分散性。Kim最近发表了类似的结果等[50]，他报告称，ZOL和紫杉醇均抑制实验性CaP溶骨性骨转移模型中的肿瘤生长，且联合用药的抑制作用更为明显。还需要在雄激素依赖性临床前模型中使用药物组合进行研究，以将这些观察结果扩展到更类似于晚期CaP患者的环境。

结论

我们的数据表明，ZOL和多西紫杉醇联合使用可有效抑制前列腺癌成骨细胞转移的生长。由于多西紫杉醇等化疗药物的毒性，确保它们在给药时对疾病有效是很重要的。我们的数据表明，多西紫杉醇在成骨细胞CaP环境中的单药疗效可能有限，但ZOL可能使靶细胞对多西紫杉醇的作用敏感。这些数据支持对CaP患者进行这种联合的临床评估。