大肠腺瘤整体DNA甲基化与风险的横断面研究

摘要

背景

DNA甲基化被认为是一种关键的表观遗传学机制，其在几种恶性肿瘤发展中的作用的证据正在积累。我们评估了正常结肠粘膜组织和血白细胞DNA的整体甲基化与大肠腺瘤风险之间的关系。

方法

招募了40至65岁的患者，他们计划进行结肠镜检查。在结肠镜检查过程中，从降结肠取了两次健康、外观正常的粘膜活检。还采集了空腹血样。在从正常结肠粘膜和血白细胞提取的DNA中量化LINE-1（长穿插核元素-1）重复序列的甲基化状态，作为整体甲基化的替代测量。对317名受试者、108名至少有一个病理证实的腺瘤受试者和209名正常结肠镜受试者进行了总体DNA甲基化与腺瘤风险之间关系的统计分析。

结果

男性结肠组织DNA中LINE-1甲基化与腺瘤风险之间存在统计上显著的负相关，男性和两性甲基化最低的四分位数与最高的四分位相比较（调整后的ORs分别为2.94和2.26）。对于血液，尽管比值比估计的总体模式是低甲基化四分位与最高甲基化四分位相比风险增加，但没有观察到具有统计意义的关系。在组织和血液中测得的LINE-1甲基化水平之间存在中度相关性（Pearson相关性0.36）。

结论

我们观察到，外观正常的背景结肠粘膜中LINE-1 DNA甲基化水平较低与男性腺瘤风险增加相关，而男性和男性的腺瘤风险均增加。尽管这些发现为结肠粘膜组织中LINE-1 DNA甲基化与腺瘤风险之间的关系提供了一些支持，但还需要大规模的前瞻性队列研究来证实这一结果。在这些研究完成之前，LINE-1甲基化作为腺瘤风险增加的生物标志物的临床用途尚不确定。无论如何，这项研究有助于更好地理解全球DNA甲基化作为CR致癌早期事件的作用，并对未来的病因学研究具有启示。

背景

人们对阐明异常全局DNA甲基化作为结直肠癌癌变早期事件的作用有着广泛的兴趣。结直肠癌是全球第三大最常见的癌症，其死亡率和发病率都很高[1–三]. 尽管过去10年来男性和女性的结直肠癌死亡率呈下降趋势，但结直肠癌仍是加拿大和美国男女癌症死亡的第二大原因[4,5]. 大肠肿瘤发展的经典模型包括从异常增殖上皮异型增生到腺瘤（腺瘤性息肉）再到结直肠癌（腺癌）的逐步组织学进展[6–9].

DNA甲基化被认为是调控基因表达和染色体稳定性的关键表观遗传机制，并且越来越多的证据表明它在几种恶性肿瘤的发生发展中起着作用[10–12]. 全球DNA甲基化是指CpG（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤）位点内甲基化胞嘧啶的全基因组含量[13,14]. 大多数CpG位点（约80%）是在重复序列中发现的，DNA的多个拷贝通常是甲基化的[15]. LINE-1（长散布核元素-1）序列平均大小为900个碱基对，约占人类基因组的17%[16]和是全球DNA甲基化测量中研究最广泛的重复序列[17,18]. LINE-1甲基化水平已被证明是全球DNA甲基化的可靠替代测量[19–23].

以CpG位点内甲基化胞嘧啶数量普遍减少为特征的整体DNA低甲基化被认为是结直肠癌发生的早期和持续事件[24–28]与致癌过程早期的驱动机制有关，包括染色体不稳定性[29–31]，染色体突变率升高[32,33]和印记丢失[34–36]. Yamada等人[28]与对照组相比，低甲基化小鼠模型中的微腺瘤（结肠粘膜内小病变）数量显著增加，表明低甲基化可能促进小鼠结肠早期肿瘤的发展[28]. 在人类中，通过比较大肠肿瘤组织中的甲基化模式和从同一患者获得的匹配的相邻正常组织，初步研究了整体DNA甲基化在大肠肿瘤发生中的作用[37–42]或来自非疾病对照受试者的正常结肠组织[37,38]. 这些研究表明，与匹配和不匹配的正常结肠组织相比，几乎所有结肠肿瘤（良性腺瘤和癌症）的CpG位点内甲基化胞嘧啶的减少程度更高（整体甲基化水平低）。然而，从致癌机制的角度来看，这些使用肿瘤组织的研究设计在区分可能驱动肿瘤发生的异型增生-腺瘤序列早期发生的整体低甲基化和腺瘤-癌序列后期发生的甲基化变化方面是有限的，或可能促进肿瘤进展的药物，或仅仅是该过程中的乘客[43].

与使用肿瘤组织的方法相反，一项研究设计比较了结肠镜检查患者结肠粘膜活检组织与结肠腺瘤（作为结肠直肠癌的替代终点）的整体甲基化模式对于没有腺瘤的参与者，有可能更好地阐明异常的整体甲基化作为结肠腺瘤/癌症早期病因的潜在标记物的作用。Cravo等人之前仅进行了两项小型观测研究[44]（N=12个腺瘤，N=8个正常结肠镜检查）和Pufulete等人[45]（N=35腺瘤，N=76正常结肠镜检查）使用这种类型的研究设计检查了整体甲基化水平与结肠腺瘤之间的关系[44,45]. 结果表明，大肠腺瘤患者正常健康大肠粘膜的整体甲基化水平较低[44,45]与无结直肠病理学的患者相比，异常的整体低甲基化可能代表整个结直肠粘膜的普遍“场”变化，这可能先于和/或引发结直肠肿瘤/腺瘤的发展[40,42,46].

为了更好地了解异常的全局DNA甲基化在人群水平的大肠肿瘤发生（腺瘤发展）早期阶段的作用，需要进一步评估全局甲基化与腺瘤风险之间的关联。为此，我们评估了外观正常的结肠粘膜组织样本中LINE-1甲基化水平（作为整体甲基化的替代测量值）与大量健康结肠镜检查患者中腺瘤风险之间的关系。我们假设正常结肠粘膜中异常的整体甲基化反应了结肠腺瘤发生的潜在倾向，因此，整体DNA低甲基化与腺瘤风险增加相关。作为次要目标，我们还研究了血白细胞中测得的LINE-1甲基化水平与腺瘤风险之间的关系。

方法

研究人群

2009年至2012年期间，计划在安大略省金斯顿市Hotel Dieu医院的区域内窥镜中心进行结肠镜筛查的40至65岁患者在结肠镜检查前约1至4个月通过邮件招募。结肠镜检查的适应症包括一级或二级亲属大肠腺瘤或癌症家族史阳性、粪便隐血试验（FOBT）结果阳性和平均风险筛查。本研究未招募先前诊断为炎症性肠病（IBD-溃疡性结肠炎或克罗恩病）的患者，以及具有已知的易患结直肠癌的遗传性疾病史（遗传性非息肉性结直肠癌、家族性腺瘤性息肉病）的病人。在之前的结肠镜检查中发现任何胃肠道异常（腺瘤、增生性息肉或癌症）或在结肠镜检查前5年内新诊断、复发或治疗任何癌症类型（非黑色素瘤皮肤癌除外）的受试者也不受邀参与本研究。此外，根据当前结肠镜检查结果诊断为IBD或结直肠癌的患者被排除在最终研究人群之外，因为担心这些患者的总体DNA甲基化水平可能与目标时间段（腺瘤前发展）不一致。为了确定均质腺瘤结果组，分析中不包括锯齿状腺瘤、无柄锯齿状腺癌或仅增生性息肉的患者。

在结肠镜检查时，在EDTA（乙二胺四乙酸）真空吸尘器中采集空腹静脉血样本，并立即将其置于冰上，并在抽血后45分钟内离心。去除黄色层（血白细胞），并将其储存在-20ºC下，直至提取DNA。在结肠镜检查过程中，为了代表降结肠的整体甲基化水平，从降结肠取两个健康、外观正常的粘膜组织进行夹点活检，两个组织之间相距10 cm，距离任何病变、息肉或其他粘膜异常至少10 cm。标本立即放置在细胞裂解液中（5-PRIME DNA隔离试剂盒，加拿大安大略省马卡姆市Inter Medico），并保存在-20°C。

实验室方法

根据制造商提供的说明，使用5-PRIME DNA分离试剂盒（Inter Medico，Markham，ON，Canada）从结肠粘膜组织活检和血白细胞中提取DNA，纯化的DNA在使用前保存在−20°C。高分辨率熔融（HRM）剖面分析是一种实时荧光聚合酶链反应方法，用于测量LINE-1重复序列的甲基化状态，作为从每个结肠组织样本和血白细胞提取的DNA中整体DNA甲基化的替代测量。HRM在LINE-1 DNA甲基化测量中的应用和验证已在前面详细描述[47]. 简言之，在HRM之前，DNA被亚硫酸氢转化，导致DNA的一级序列改变，从而允许非甲基化胞嘧啶与5-甲基胞嘧啶的分化[48]. 引物被设计用于靶向LINE-1共有启动子区域，从该区域中选择8个代表性CpG位点进行HRM图谱分析，这些位点以前被验证为全球DNA甲基化状态的代表[20]. 通过比较参与者亚硫酸氢盐转化DNA与一组标准DNA参考对照品的熔融曲线，以及已知水平的非甲基化和甲基化胞嘧啶，获得了该代表性亚组CpG位点的LINE-1位点特异性甲基化百分比值。对两份组织DNA样本和96个平板上的血白细胞的亚硫酸氢转化DNA进行三次LINE-1甲基化分析。每个平板还包括一个无模板对照、一组参考甲基化标准和三个内部对照外周血DNA的重复，以评估批间变异性。

对两个组织DNA样本和血白细胞DNA分别进行了LINE-1甲基化的三次测量。如果由于高PCR阈值交叉点（Cp值>27），PCR值不令人满意，则排除单独的三次重复测量。此外，分析中排除了个别异常值（定义为与其余三个重复值中每个值的差异>10%）[47]. 每个个体受试者的平均组织和血液白细胞甲基化百分比值是通过对两个组织DNA样本的所有剩余三倍取平均值和分别对血液DNA样本的剩余三倍取平均值来计算的。

统计分析

为了确定有腺瘤和无腺瘤患者结肠组织或血白细胞DNA中LINE-1甲基化水平是否不同，结果状态定义如下：结肠镜检查未发现异常的研究对象被分配到“正常结肠镜检查”组。肠镜检查期间移除的任何异常组织均由专家胃肠道病理学家按照医院程序使用标准组织学标准进行评估。根据标准诊断标准，患有一个或多个经病理证实的管状、管状绒毛状或绒毛状腺瘤的受试者构成腺瘤组。

结肠组织和血白细胞DNA的总体平均LINE-1甲基化水平根据正常结肠镜检查参与者的性别分布分为四分位。此外，还使用连续代表性的性别特异性标准化LINE-1甲基化测量来检测腺瘤风险。这些分析分别针对男性和女性进行，并针对两性进行合并。进行无条件logistic回归估计优势比（OR）和95%置信区间（CI），作为年龄控制的关联性度量。性别特异性甲基化测量否定了进一步控制性别的必要性，腺瘤的其他风险因素不被视为潜在的协变量，因为它们被假设为是因果途径。比值比提供了一种对利益关系的方向、强度和统计意义的度量，但并不估计本研究样本中的患病率。

机构伦理获得了女王大学健康科学和附属教学医院研究伦理委员会的批准（文件号6004521），所有受试者均提供了知情同意书。

结果

在728名符合初始资格标准并收到招聘包裹的受试者中，444人同意参与该研究（61%的回复率）。另外48名受试者被排除在外，原因是结肠镜检查时间安排问题，或者结肠镜检查不完整（检查没有到达盲肠），或者主治医生没有进行两次健康组织活检。在剩下的396名受试者中，有66人因结肠镜检查（IBD、结直肠癌、锯齿状腺瘤、锯齿状无柄腺瘤或增生性息肉）的不合格诊断而被排除在外，剩下330名受试人员有资格进行组织和血液甲基化测量。317名受试者的组织中成功检测到DNA甲基化，其中280人也进行了血液甲基化检测。组织甲基化分析的病理结果（n=317）确定了108名至少患有一个腺瘤的参与者（101名患有管状腺瘤，7名患有管腔绒毛状腺瘤）和209名患有正常结肠镜检查的参与者。

对从每个组织和血液样本中分离的DNA进行HRM，一式三份。组织和血液三倍体内的组内变异系数分别为1.84%和1.81%。37个板中的每个板上都有一个内部对照样品，组间变异系数为0.89%。262名参与者获得了两份完成甲基化测量的结肠组织样本（两份组织样本平均值之间的皮尔逊相关性=0.66），其余55名研究对象的一份组织样本获得了甲基化值。

在我们的患者群体中，结肠镜检查的主要适应症是结直肠癌或大肠腺瘤的阳性家族史（表1). 那些因粪便潜血试验（FOBT）阳性而接受结肠镜检查的患者比有阳性家族史的患者更有可能被诊断为腺瘤。与女性相比，男性更容易被诊断为腺瘤（分别为53%和20%）。

表1患者群体描述

组织中LINE-1甲基化值在男性、女性和两性组合中大致呈正态分布。表2介绍了LINE-1 DNA组织甲基化四分位数与男性、女性以及男女合并的腺瘤风险之间的关系。LINE-1甲基化的最高四分位数被用作比值比估计的参考值。与女性相比，男性的ORs（根据年龄进行调整）更大，但没有统计学差异（p值交互作用=0.65）。处于最低四分位的男性腺瘤风险在统计学上显著升高（年龄校正OR 2.94，95%CI:1.02-8.47）。对于合并的两性，ORs从高甲基化四分位数增加到低甲基化四分数位数，最低四分位数的腺瘤风险在统计学上显著增加（年龄和性别校正OR=2.26，95%CI:1.11-4.58）。

表2正常结肠组织活检中LINE-1 DNA甲基化与腺瘤风险之间的关系（n=317）

280名患者（185例正常结肠镜检查和95例腺瘤）的血液甲基化值可用。血液和组织甲基化值之间存在中度相关性（皮尔逊相关性0.36）。尽管比值比估计的总体模式是，与最高甲基化四分位数（参考值）相比，血白细胞中低甲基化四份位数的风险增加，但没有观察到具有统计学意义的关系（表三).

表3血白细胞中LINE-1 DNA甲基化与腺瘤风险的关系（n=280）

结肠组织或血白细胞中性别特异性标准化LINE-1甲基化水平的连续表达结果显示与腺瘤无关（见表2和表三). 当研究人群仅限于具有一级或二级亲属CRC或腺瘤阳性家族史的受试者时，所有分析（组织和血液）的结果均不受影响（数据未显示）。

讨论

本横断面研究利用健康的结肠镜筛查人群，评估正常背景结肠组织DNA中测得的LINE-1甲基化水平（作为整体甲基化的替代物）与结肠腺瘤风险之间的关系。总的来说，我们的结果支持了正常背景结肠粘膜中的整体DNA低甲基化与大肠腺瘤风险增加之间的关系。男性组织DNA中LINE-1甲基化与腺瘤风险之间存在统计显著的反向关系，男性和两性甲基化最低的四分位数与最高的四分位相比较（调整后的ORs分别为2.94和2.26）。与甲基化水平最高的受试者相比，低甲基化四分位数受试者的总体影响模式与腺瘤风险增加相一致。

我们的研究结果是迄今为止发表的最大的一项研究，该研究通过比较有腺瘤和无腺瘤的结肠镜检查患者结肠组织活检中外观正常的LINE-1 DNA甲基化水平来评估整体甲基化与结肠腺瘤发展之间的关系，与之前评估这种关系的两项较小的观察性研究大致一致（研究分别包括12例和35例腺瘤病例）[44,45]. 我们的研究在这两项研究的基础上进行了改进，纳入了从临床相关健康筛查人群中招募的更多参与者。此外，我们的结果与Belshaw等人的结果一致[49]据报道，与没有已知胃肠道病理的受试者相比，从结直肠癌患者形态正常的结肠粘膜中分离出的结肠隐窝中LINE-1甲基化水平显著降低[49].

考虑到与女性相比，结直肠腺瘤在男性中更常见[50,51]据报道，结直肠癌危险因素的性别差异[52,53]许多研究发现LINE-1甲基化水平在男性中较高[54]，评估LINE-1甲基化水平与按性别分层的腺瘤风险之间的关系对于了解异常LINE-1基因甲基化在CRC病因中的作用非常重要[55]. 据我们所知，这是第一项研究，报告了结直肠腺瘤/癌症风险背景下的性别特异性关系，尽管已经观察到男性和女性膀胱癌风险的差异[23,56,57]. 我们的研究结果表明，男性（而非女性）的全局/LINE-1低甲基化与腺瘤风险增加之间的关系表明，与女性相比，男性异常的全局DNA甲基化模式可能在早期CR肿瘤的发展中发挥更重要的作用。然而，由于样本量有限，尤其是针对女性的分析，因此对性别特异性结果的解释应谨慎。

尽管我们的结果与所有受试者的低血白细胞甲基化四分位数相关的腺瘤风险升高相一致，但与最高甲基化四等分位数相比，结合性别特异性分析，血白细胞中LINE-1甲基化水平与腺瘤风险之间没有统计学意义的关系。这些结果与之前的两项研究相反，这两项研究都报告了与血白细胞整体甲基化水平较低相关的腺瘤风险增加[45,58].

我们观察到结肠组织中测得的LINE-1甲基化水平与血液白细胞之间只有适度的相关性，这可能解释了血液LINE-1的甲基化和腺瘤风险的无效结果。此外，可用于血白细胞分析的受试者较少，因此检测相关性的统计能力有限。我们的非显著发现，加上结肠组织和血白细胞LINE-1甲基化之间只有适度的相关性，对于规划甲基化标记物和结直肠癌/腺瘤风险的未来流行病学调查具有重要意义，只有血液或其他可获得的DNA来源可用于甲基化分析[59].

这项基于临床的研究使用了风险增加的生物标志物，避免或限制了观察性研究的许多传统偏见。特别是，由于本研究依赖于组织样本和病理报告的盲法甲基化分析来分别评估暴露和结果，因此不太可能存在信息偏见。虽然我们的研究人群不能代表整个普通人群（由于结肠镜检查的临床招募率和反应率），但考虑到我们的样本代表了一个相关的亚组转诊到区域性结肠镜检查项目，而且，因为研究目标是为了理解假设一致的生物关系，而不考虑所研究的人群。此外，传统的风险因素被认为是DNA甲基化的上游（在因果途径上），因此混杂的控制不受关注。

本研究依赖于横截面暴露和结果测量，因此在时间性、流行事件和暴露窗表征方面受到横截面设计的经典限制。然而，通过检查暴露（LINE-1甲基化）和结果（腺瘤），这些限制都在一定程度上得到了缓解，它们本身就是因果链中的中间事件，时间尺度比暴露与癌症的关系更短。然而，反向因果关系仍然是对所观察到的关系的潜在解释。

结果（腺瘤）和暴露（LINE-1甲基化）的无差别错误分类可能使我们的结果偏向于零。据报道，腺瘤结肠镜检查的“漏检率”，一厘米或更大的腺瘤为6-12%，直径小于一厘米的腺瘤高达25%[60]. 对于我们的研究，由于所有结肠镜检查都是由经验丰富的学术胃肠病学家在一个临床中心进行的，预计腺瘤的漏检率不那么令人担忧，他们每年都要进行200多次结肠镜检查，并参与一个持续的质量控制计划，其中包括息肉检测和盲肠检查的特定审计目标插管率[61,62].

我们对整体DNA甲基化的横截面测量旨在表示发育不良腺瘤序列启动前LINE-1甲基化水平。尽管有一些证据表明，随着时间的推移，个体内的全球甲基化水平是稳定的[63]，由于这种假设，可能存在一定程度的错误分类。我们重点关注基因组中的LINE-1重复元素，这些元素通常被高度甲基化，作为全球DNA甲基化的替代物。尽管LINE-1甲基化与基因组不稳定性密切相关[31,64–66]由于这种替代性测量导致的甲基化状态的非差异性错误分类可能会减弱本研究中观察到的效果。此外，两个结肠组织样本的甲基化水平之间0.66的相关性表明降结肠中LINE-1甲基化状态的一些异质性，并表明我们的结果可能无法推广到从结肠其他部位进行的组织活检。

结论

结直肠癌风险增加的生物标志物研究对于了解结直肠癌病因具有巨大潜力。我们的结果表明，外观正常的结肠粘膜中LINE-1 DNA低甲基化与腺瘤风险增加相关，表明健康背景结肠粘膜中异常的整体低甲基化代表了潜在的普遍表观遗传畸变，通常被称为“场缺陷”，这可能会增加大肠腺瘤/癌症的发病倾向[46,67–70]. 尽管这些发现为大肠粘膜组织中LINE-1 DNA甲基化与腺瘤风险之间的关系提供了一些支持，但还需要进行大规模的前瞻性队列研究来确认结果。在完成这些研究之前，结肠组织（或血白细胞）DNA中LINE-1甲基化的这一测量作为腺瘤风险增加的生物标记物在临床应用中的作用尚不明确。然而，尽管我们的发现的临床意义尚不清楚，这项研究有助于更好地理解结肠组织中整体DNA甲基化作为CR致癌早期事件的作用，并对未来的CRC病因学研究具有指导意义，该研究以整体DNA低甲基化为信息终点，调查可疑的环境和生活方式风险因素。