缺氧微环境提升卵巢癌细胞的干样特性

摘要

背景

研究缺氧是否影响卵巢癌细胞的干样特性及其在缺氧条件下的生物学行为。

方法

卵巢癌细胞株ES-2和OVCAR-3在不同的氧张力下培养，以进行增殖、细胞周期和侵袭分析。通过集落形成和球体形成测定来检测细胞的克隆潜能。干细胞表面标记物、SP和CD44^明亮的和CD44^昏暗的流式细胞术分析细胞。通过Western blotting检测HIF-1α、HIF-2α、Ot3/4和Sox2的蛋白表达。

结果

低氧条件下培养的两种细胞株生长相对缓慢，G0/G1期延长。然而，如果细胞在1%O下预处理₂在恢复常氧前48小时，与常压培养的细胞相比，细胞增殖率显著提高，浸润能力增强，菌落和球体显著增多。CD44细胞^明亮的细胞表达的Oct3/4和Sox2水平明显高于CD44^昏暗的细胞并形成了更多的克隆和球体在体外细胞缺氧处理导致两种细胞系中CD44表达增强，OVCAR-3细胞系中CD133表达增强。与这些发现平行的是，在ES-2和OVCAR-3细胞系中观察到侧群（SP）细胞数量显著增加，Oct3/4和Sox2的表达上调。

结论

我们的结论是，卵巢癌细胞通过上调干细胞相关因子来提升其干细胞样特性，从而在缺氧条件下生存，并且在回到高氧环境时表现得更具攻击性。

背景

缺氧微环境在许多实体肿瘤中常见，包括乳腺癌、前列腺癌、脑肿瘤、恶性黑色素瘤、转移性肝癌和卵巢癌[1–5]. 实体肿瘤经常会遇到缺氧应激。快速增殖的癌细胞可能会超出其血管网络并限制O₂肿瘤内扩散。肿瘤血管结构和功能异常导致的灌注缺陷也可能导致缺氧应激[6]. 缺氧不仅导致组织坏死，而且对肿瘤细胞生物学也有很大影响，对凋亡和其他细胞死亡信号的敏感性降低，而促进血管生成、增殖和系统转移的信号增强[7]. 肿瘤缺氧不仅是放射治疗的一个主要问题，而且还与许多常规化疗药物耐药性的发展有关[8,9]. 癌症干细胞尤其被证明可以逃避放疗和化疗，并能在其他器官形成转移瘤。包括卵巢肿瘤在内的几种体细胞肿瘤被认为含有一小部分称为肿瘤干细胞的干细胞样细胞，这些干细胞具有自我更新、分化和引发新肿瘤的能力[10–17].

低氧诱导因子（HIF）可以通过氧的有效性进行调节。HIFs被认为是低氧应激转录反应的关键调节剂。除了在细胞应激反应中的适应性功能外，最近的研究还揭示了HIF在生理和病理过程中的重要作用[6]. 越来越多的证据表明，HIF调节许多基因，包括葡萄糖代谢、细胞存活、红细胞生成、干细胞维持、血管生成相关标记物以及对化疗和放疗的耐药性[18]. 胚胎干细胞标记物、转录因子Oct3/4（也称为POU5F1）和Sox2在维持胚胎干细胞和原始生殖细胞的自我更新中起着关键作用。Oct3/4是POU家族的同源域转录因子。一些实验室发现，Oct3/4和Sox2的表达在肺癌、胃癌、结直肠癌、直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌等不同体细胞肿瘤的癌细胞生存、自我更新、分化和增殖中具有重要作用[19–21].

此外，肿瘤干细胞通常代表肿瘤细胞总数中的一小部分，可以在细胞表面标记物表达的基础上进行富集。据报道，一些表面标记物与肿瘤干细胞或祖细胞相关。在卵巢癌中，早期祖细胞与一些特定的表面标记物如CD44、CD133和CD117相关[22–26]. 然而，CD44⁺和CD133⁺卵巢癌中的亚群被认为是异质的，由祖细胞和分化细胞组成[24,27].

以前，已经发现SP细胞具有癌症干细胞的某些特性[28,29]肿瘤干细胞也在其表面表达ATP-结合盒糖蛋白转运体。这些转运体有效地泵出活性染料，从而在荧光激活细胞分选FACS图中检测到特征性的未标记侧细胞群。

缺氧对卵巢癌细胞癌干样特征的影响尚未完全阐明。因此，本研究的目的是检验缺氧是否会影响卵巢癌细胞系的干细胞样特性在体外采用增殖试验、细胞周期分析、渗透试验、集落形成试验、成球试验、SP、FACS和Western blotting等方法。反复研究表明，卵巢癌细胞系OVCAR-3和ES-2在缺氧条件下表现出明显较高水平的干样特征体外试验。

材料和方法

细胞系和细胞培养

人类卵巢癌细胞株ES-2和OVCAR-3购自美国类型培养物收集中心（ATCC，Manassas，VA，USA），并保存在我们的实验室中用于本研究。对于常规细胞培养，2×10⁵细胞接种在25厘米内²培养瓶保存在RPMI 1640培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）中，补充10%胎牛血清（Invit罗gen）和100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素，置于5%的加湿CO中₂37°C的培养箱。

缺氧细胞培养

本研究使用Xvivo密闭培养系统（Xvivo系统300 C，Biospherix，USA）来获得不同培养箱中的准确氧气张力。在常规细胞培养中培养24小时后（使细胞附着在烧瓶上），将细胞转移到具有不同氧气控制的不同腔室中进行可变培养期，然后采集细胞进行附加检查，包括MTT、球体和集落形成分析、细胞周期分析、，流式细胞术分析、Western blotting、SP和FACS。

MTT分析

为了评估缺氧对细胞增殖的影响，将2000个细胞/孔置于180μl完整RPMI-1640培养基中，在两种常压（20%O₂)或缺氧（1%O₂)MTT分析前可变培养时间段的条件。此外，为了研究缺氧预处理对细胞增殖的影响是否不同，首先在常压（20%O₂)或缺氧（1%O₂)培养48小时后，重新检测细胞，然后在MTT检测前在常压下培养一段时间。在培养细胞达到其时间表后，添加5 mg/ml 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；USA），并在37°C下培养4小时，然后向每个孔中添加150μL二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich）并彻底混合。然后摇晃平板15分钟，使用波长为490 nm的分光光度计测定吸光度（μQuant；Bio-Tek Instruments，Winooski，VT，USA）。

细胞周期分析

细胞在缺氧或常压下培养48小时，然后收获到15毫升无菌锥形管中，离心并用冰镇PBS清洗。细胞计数后，1×10⁶将细胞在−20°C的70%乙醇中固定24小时，用冷PBS洗涤并重新悬浮在含有50μg/ml PI和100单位/ml A型RNase的PBS缓冲液中。然后在室温下在黑暗中培养细胞30分钟。优化门控后，使用70μm尼龙膜过滤样品，并使用LSRII流式细胞仪（Becton Dickinson，San Jose，CA，USA）进行分析。使用FlowJo软件（7.6版）分析数据。

侵入试验

如前所述，用24个transwell小室（Costar，Bodenheim，德国）进行侵入试验[30]. 简单地说，1x10⁴收集细胞并将其重新悬浮在200μl无血清RPMI-1640培养基中，然后将其置于顶室中。将500μl RPMI-1640培养基加入10%胎牛血清，填充在横孔的下室。将细胞悬浮液应用于基质凝胶膜上，并在37°C下孵育24小时。细胞通过基质凝胶迁移，并用70%甲醇固定过滤器，用0.2%结晶紫染色，用ddH洗涤₂O并在显微镜下计数。

球体形成分析

根据上述方法进行球体形成分析[31]. 将ES-2和OVCAR-3细胞在不同的氧张力下接种48小时，然后从细胞培养瓶中取出并收获。单细胞（每孔1000个细胞）在常压下在超低附着六孔板（超低簇板，生命科学）上重新镀膜和培养。这些细胞在常压条件下培养14天，然后在反向错误复制下评估球体并进行计数（一个球体内超过30个细胞被视为一个完整的球体）。此外，单个CD44的球体形成分析^明亮的和CD44^昏暗的细胞（每孔800个细胞）也按照上述方法进行。所有实验都重复了三次。

集落形成分析

将80%融合液中的细胞在不同氧气条件下培养48小时，然后用PBS洗涤并从细胞培养瓶中取出，用计数细胞计数器（Invitrogen）进行计数。将500个细胞/孔置于6孔板中，在20%的氧气压力下放置14天，用4%的福尔马林缓冲液固定菌落15分钟，然后用1%的结晶紫染色30分钟。用PBS轻轻清洗板并在显微镜下进行菌落评估之前干燥。此外，CD44^明亮的和CD44^昏暗的细胞（500个细胞/孔）也采用上述方法进行集落形成试验。对含有30个以上细胞的菌落进行计数。菌落形成效率计算如下：菌落数/种子细胞数×100%。数据是三个独立实验的代表。

流式细胞术和流式细胞仪

在缺氧（1%O）下培养48小时后₂)或常氧（20%O₂)细胞进行胰蛋白酶解、计数并用最终浓度为1×10的冷FACS缓冲液（PBS+BSA 0.02%）洗涤⁶细胞/试管。细胞在冰上用0.5%BSA预封闭30分钟，然后在黑暗中孵育30分钟，在冰上使用直接与别藻蓝蛋白（APC）结合的CD44单克隆抗体和直接与异硫氰酸荧光素（FITC）结合的CD133单克隆抗体，均来自BD Pharmingen公司。在用冰镇PBS洗涤两次后，将细胞悬浮液置于800μl FACS缓冲液中，通过70 mm尼龙网过滤。样品在LSRII流式细胞仪上进行分析（Becton Dickinson，San Jose，CA，USA）。对采集的每个样本进行活细胞和单个细胞门控，并使用APC小鼠IgG2b和FITC小鼠IgG2b（均来自美国BD Pharmingen）作为阴性对照。实验分三次独立进行。使用FlowJo软件（7.6版）分析数据。

对于FACS，将细胞分离到可存活的单细胞悬浮液中，并用如上所述直接与APC结合的CD44单克隆抗体进行染色。相应的非免疫同种型作为阴性对照。前10%CD44⁺用FACS分离并测定为CD44^明亮的细胞和底部10%的CD44^-用FACS分离细胞并测定为CD44^昏暗的细胞。FACS采用流式细胞仪（Becton Dickinson）进行。

SP分析

用于SP分析，1×10⁶细胞悬浮在含有2%胎牛血清和2 mM HEPES缓冲液的预热RPMI 1640培养基中。在存在或不存在维拉帕米（50μM；Sigma），并在37°C下培养90分钟，间歇摇晃。培养结束时，用含2%FBS的冰镇HBSS清洗细胞，在4°C下离心，并在含有2%FBS冰镇HBSS中重新悬浮。向细胞中添加最终浓度为2μg/ml的碘化丙锭，以筛选活细胞。在使用LSRII流式细胞仪（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA）进行分析之前，通过70μm细胞过滤器过滤细胞以获得单细胞悬浮液。通过双重判别法从分析中丢弃细胞聚集体。用红色（蓝色，402-446 nm）对SP细胞进行可视化或分类与蓝色（红色，650–670）紫外线通道均为线性模式。

蛋白质印迹分析

收集培养细胞并用200μl全细胞蛋白RIPA缓冲液（25 mM Tris HCl pH 7.6，100 mM NaCl，1%NP40，1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，Thermo Scientific Pierce，Bonn，Germany）和添加的新制备蛋白酶抑制剂（0.1μM抑肽酶，1.0 mM PMSF，1μM亮氨酸肽，1μM Pepstatin），然后将样品在−70°C下冷冻30分钟。样品在15000℃下离心每分钟转数在4°C下放置15分钟，将上清液转移到新试管中。根据制造商的说明，使用Bio-Rad蛋白质分析法（美国加利福尼亚州Hercules）测量蛋白质浓度。用台式加热器（111002型，Boekel Scientific，Feasterville，PA，USA）在100°C的SDS负载缓冲液（500 mM Tris HCl pH 6.8；每个样品50μg蛋白质（10%甘油、2%十二烷基硫酸钠、0.6 M DTT、0.05%溴酚蓝），经10%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并转移至聚偏二氟乙烯转移膜（Bio-Rad）。在室温下用5%的非脂肪干乳在0.05%TBS-Tween中封闭膜90分钟，并在4°C下与针对GAPDH（0.2μg/ml）、Oct3/4（1μg/mlμg/ml）均来自美国明尼阿波利斯R&D Systems公司。然后，将膜与相应的二级HRP结合抗体孵育，包括抗山羊IgG-HRP抗体（1:2000）或抗小鼠IgG-HRP抗体（1:1000），均来自美国明尼阿波利斯R&D System公司。免疫复合物通过增强化学发光显示（GE Healthcare、Bucks和英国）。western印迹实验至少重复了三次。

统计分析

数据显示为每个实验至少3个实验的平均值±SEM。数据分析采用SPSS软件（16.0版）。使用Student’sT型测试(P（P） < 0.05被认为具有统计学意义。

结果

缺氧导致G0/G1细胞周期延长，生长速度相对较慢

采用MTT法对ES-2和OVCAR-3卵巢癌细胞株进行缺氧或常压培养，观察缺氧对细胞生长的影响。如图所示1安培，细胞在1%O下培养₂（缺氧）生长相对较慢于常压培养的细胞(P（P） < 0.01），尽管生长差异在最初48小时内并不明显，但表明细胞生长在缺氧条件下受到抑制。然后用细胞周期分析检测在缺氧或常氧条件下培养的细胞。可以重复显示，OVCAR-3和ES-2细胞中G0/G1期细胞的数量显著增加，与缺氧培养细胞中的74.1±4.5%和71.44±6.6%相比，常氧培养细胞中G0期细胞的数目分别为50.8±6.2%和53.17±1.98%（图1B年). 如柱状图所示，两种细胞系中G0/G1期的差异具有统计学意义(P（P） < OVCAR-3和P（P） < ES-2为0.05），表明在缺氧条件下有更多的静止细胞。

图1

缺氧延长了G0/G1状态，细胞生长相对缓慢。OVCAR-3和ES-2细胞在缺氧或常压下维持不同时间。（A）生长曲线表明，缺氧条件下的细胞生长相对较慢于常压条件下的那些细胞(P（P） < 0.01).（B）细胞周期分析显示，缺氧培养的细胞中G0/G1期延长，相应的直方图显示两种细胞系中G0/G2期均显著增加，具有统计学意义(P（P）<OVCAR-3和P（P） < 0.05（对于ES-2）。

低氧预处理促进细胞增殖和侵袭

为了探讨低氧预处理对细胞生物学行为的影响，进行了增殖和侵袭试验。如图所示2安培所有低氧预处理细胞的生长速度均高于常氧培养的对照细胞。当细胞在缺氧条件下预处理48小时，然后在常压下培养时，两种细胞系的MTT值均显著高于常压下的细胞(P（P） < 0.05). 此外，我们的侵袭性检测显示，缺氧预处理细胞中的侵袭性细胞数量显著增加，包括OVCAR-3和ES-2细胞。如图所示2B型OVCAR-3细胞在缺氧条件下侵袭细胞数量增加2.9倍，ES-2细胞在缺氧情况下侵袭细胞数增加3.5倍(P（P） < 0.0001）。

图2

缺氧预处理诱导细胞增殖和侵袭潜能。所有细胞在缺氧或常压下培养48小时，然后恢复常压状态进行增殖或侵袭试验。（A）缺氧预处理48小时的细胞比常氧培养的细胞生长速度明显快(P（P） < 0.05).（B）细胞侵袭试验表明，在两种细胞系中，缺氧预处理组的浸润细胞明显多于正常氧对照组(P（P） < 0.0001).

缺氧增加细胞的球形和集落形成能力

在常氧条件下，两种细胞系中都可以观察到球体（图第3页). 相比之下，缺氧预处理增加了球体的数量，VCAR-3细胞增加了1.96倍，ES-2细胞增加了1.59倍（图3B公司). 缺氧预处理的细胞也用集落形成试验进行检测。与常压下保存的细胞相比，缺氧预处理细胞中观察到更多的菌落（图3C公司)OVCAR-3细胞和ES-2细胞分别增加了2.38倍和2.86倍（图三维).

图3

低氧预处理提高了细胞的球形和集落形成能力。 （A）图第3页显示了在常压下培养的具有代表性的细胞球体。（B）三个独立实验的结果显示，缺氧预处理组的两种细胞系的球体明显多于对照组(P（P） < 0.0001).（C）集落形成实验显示缺氧预处理细胞中有更多的集落。（D）三项独立实验的结果显示，低氧预处理组的菌落数明显多于正常氧对照组(P（P） < 0.0001).

缺氧上调CD44和CD133的表达

考虑到缺氧的影响，用流式细胞术检测表面标志物CD44和CD133。低氧条件下，OVCAR-3细胞中CD44表达增加1.99倍，低氧培养的ES-2细胞中CD42表达增加2.73倍（图4A级). OVCAR-3细胞中CD133的表达也增加了1.48倍，而ES-2细胞在缺氧条件下几乎没有变化（图第4页). 所有这些数据表明，缺氧诱导这些细胞系中CD44的表达，并对CD133的表达产生积极影响，至少在OVCAR-3细胞中是如此。

图4

缺氧诱导的分子干样表型。卵巢癌细胞在缺氧（1%O₂)或在额外分析前常压48小时。（A）相比之下，低氧培养的OVCAR-3和ES-2细胞中CD44的表达水平明显较高。（B）低氧培养的OVCAR-3细胞中CD133的表达水平也显著升高，但ES-2细胞中的CD133表达增加不明显。（C）SP分析也显示，缺氧条件下OVCAR-3和ES-2细胞中的SP细胞数量显著增加。（D）缺氧培养的OVCAR-3和ES-2细胞中诱导HIF-1α和HIF2-α表达；（E）OVCAR-3和ES-2细胞中Oct3/4和Sox2的表达也相应增加。

缺氧丰富SP细胞

为了确定缺氧是否影响卵巢癌细胞的干细胞特性，对在常压（20%O₂)或缺氧（1%O₂)48小时。如图所示4摄氏度缺氧可使OVCAR-3和ES-2细胞中的SP细胞富集，与常压培养的细胞相比，缺氧培养的OVCAR-2细胞和缺氧培养的ES-2细胞分别增加了约7倍和3.7倍。

缺氧上调HIF和转录因子

低氧诱导因子是低氧激活的转录因子的主要家族。研究缺氧对卵巢癌细胞株HIF-1α和HIF-2α表达的影响。缺氧培养48小时的细胞中，OVCAR-3和ES-2细胞中HIF-1α和HIF-2α的表达均显著增加，而常压缺氧培养48 h的细胞仅呈弱阳性（图4D（四维）). 在常氧培养中，HIF-2α水平高于HIF-1α水平。与常氧培养的细胞相比，缺氧培养48小时的ES-2和OVCAR-3细胞中Oct3/4和Sox2的表达显著增加（图第四版).

CD44细胞^明亮的细胞显示干样属性

我们在实验中发现，通过FACS分离的SP细胞很难维持在体外很可能是由于赫斯特33342染料的化学损伤。此外，低氧条件下ES-2细胞中CD133的表达没有反复升高。因此，我们决定进一步研究CD44^明亮的特别考虑干细胞特征的细胞在体外如图所示5A级，CD44^明亮的卵巢癌细胞表达高水平的Oct3/4，而CD44^昏暗的两种细胞系中的细胞几乎不表达Oct3/4。CD44^明亮的细胞表达的Sox2水平高于CD44^昏暗的细胞。

图5

CD44细胞 ^明亮的 细胞表现出干样的特性。CD44^明亮的和CD44^昏暗的在进行额外的Western印迹、球体和集落形成分析之前，用FACS从OVCAR-3和ES-2细胞中分选细胞。（A）CD44^明亮的细胞表达的Sox2和Oct3/4水平高于CD44^昏暗的两种细胞系中的细胞。（B）CD44中较大的球体^明亮的CD44中不合格的细胞和细胞簇^昏暗的两个单元格行中的单元格都显示在左面板上，并带有相应的直方图（右面板）。（C）集落形成分析也显示CD44中有更多的集落^明亮的细胞与CD44的比较^昏暗的两个单元格行中的单元格（左侧面板）。三种独立的菌落形成分析显示，CD44中的菌落明显增多，具有统计学意义^明亮的细胞，与CD44相比^昏暗的两个细胞系中的细胞(P（P） < 0.0001，右侧面板）。

在球体形成试验中，CD44中几乎没有合格的球体^昏暗的细胞，而CD44中观察到更多的球体^明亮的单元格（图5A和B). 此外，CD44中可以观察到明显更多的菌落^明亮的细胞比CD44^昏暗的用集落形成分析法检测细胞（图第5页,P（P） < 0.0001).

讨论

缺氧是许多实体瘤的固有特征。病理学上众所周知，肿瘤细胞耐受缺氧环境。在胚胎和成人干细胞研究中，缺氧有利于细胞生长在体外[32–35]. 然而，对于癌细胞来说，尽管在这一领域已经取得了很大进展，但还没有充分研究缺氧如何影响干细胞的特性[18,36–39]. 因此，我们探讨了缺氧是否是卵巢癌细胞生长的驱动力在体外通过进行MTT实验。研究发现，尽管在最初的48小时内，细胞的生长差异并不明显，但缺氧条件下的细胞生长通常较慢于正常氧条件下的相应细胞。通过细胞周期分析进一步研究缺氧培养的细胞。我们发现，ES-2和OVCAR-3细胞株在缺氧48小时后都经历了显著的G0/G1期延长，表明缺氧时细胞更加静止。这一结果与其他肿瘤细胞研究一致[40–42]. 理论上，肿瘤干细胞在其生态位中的分裂和增殖速度应较低，这可能有助于降低其化疗和放疗敏感性[三,8,38].

然后，我们重点研究了缺氧预处理和常压培养对卵巢肿瘤细胞系的影响，因为在本研究中，我们发现如果始终处于缺氧状态，细胞会生长不良。将肿瘤细胞置于1%O₂48小时作为缺氧预处理组，然后将其恢复到正常氧下，以始终处于正常氧下的细胞作为对照。我们发现，缺氧预处理后的肿瘤细胞在常压培养下生长明显更快，浸润能力明显高于常压培养的细胞。这些结果表明，癌细胞在遇到缺氧应激时可能会转变为更像干细胞的状态，并在突然升高的氧气环境中以选择的方式发展出更具攻击性的表型，例如当肿瘤细胞渗入血流或当“休眠”时转移性实体瘤细胞通过迄今为止尚未明确的机制从骨髓中动员出来。这可能有助于解释为什么缺氧不仅导致组织坏死，而且对肿瘤细胞生物学产生强烈影响，对凋亡和其他细胞死亡信号的敏感性降低，当生态位允许时，促进血管生成、增殖和系统转移的信号增加[43–46].

众所周知，上皮性卵巢癌中的癌干细胞可以是CD133⁺[24]或CD44⁺亚群细胞[26]这些特异性标记物可能是这种毁灭性疾病的潜在治疗靶点。因此，本研究探讨了缺氧对这两个标记物表达的影响。我们的结果表明，48小时内1%O₂治疗可使ES-2和OVCAR-3细胞系中的CD44表达增加约2.0-2.7倍，并使OVCAR3细胞系中CD133表达增加约1.5倍。这些结果得到了其他报告的支持，即缺氧有助于CD133的扩张⁺胰腺癌细胞[47]和CD133⁺胶质瘤干细胞[48]. 也有报道称，缺氧使CD44富集⁺/CD24型^-乳腺癌干样细胞[49]和CD44⁺小鼠间充质干细胞[47–50].

为了研究缺氧对干细胞表型的影响，我们评估了SP细胞的比例，因为SP分析已成功用于鉴定肝细胞癌、乳腺癌和卵巢癌中的癌干细胞[14,23,29,51,52]. 我们发现缺氧可以诱导OVCAR-3细胞和ES-2细胞中的SP亚群。此外，SP细胞的增加与HIF-1α和HIF-2α在两种细胞系中表达水平的增加平行。众所周知，与周围肿瘤或正常组织相比，实体肿瘤内经常发生缺氧，肿瘤未分化部位的缺氧更为严重。肿瘤细胞对缺氧的最初反应是激活缺氧反应转录因子。缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α是缺氧条件下激活的重要因子。据报道，缺氧导致其他卵巢癌细胞株HIF-1α表达增加[42,53]这与我们目前的研究基本一致。已经观察到HIF通过调节一些靶基因，如葡萄糖转运蛋白、乙醇酸酶、血管内皮细胞生长和生长因子，影响肿瘤的表型[16,18,54].

缺氧的干样特性影响可能通过转录因子发挥，如Oct3/4[16,32]和Sox2[55]. Oct3/4和Sox2是维持胚胎干细胞和原始生殖细胞自我更新的转录网络中的关键参与者。几项研究表明Oct3/4和Sox2在维持成人体干细胞的干样特性中发挥作用[56,57]. 我们的研究证实Oct3/4和Sox2在OVCAR-3和ES2细胞系中均弱表达，并且这些蛋白的表达在缺氧暴露后上调。此外，Oct3/4和Sox2表达水平的增加与缺氧条件下HIF-1α和HIF-2α表达水平的升高平行。先前的研究表明HIF-2α与Oct3/4的启动子结合并直接诱导其表达和活性[58]提示缺氧环境下卵巢癌细胞中HIF-2α和Oct3/4的相互作用具有潜在作用。

自从CD44被认为是乳腺癌和卵巢癌中肿瘤干/祖细胞的假定表面标志物以来[23,26,27,49]由于在缺氧条件下，其在OVCAR-3和ES2细胞系中的表达显著上调，我们决定进一步分析CD44的表达是否与这些细胞中的任何干细胞性质相关。Oct3/4在CD44中的表达^昏暗的细胞几乎为阴性，而其在相应的CD44中的表达^明亮的细胞显著增加。我们对分离出的相应CD44进行了额外的集落形成和球体形成分析^昏暗的和CD44^明亮的FACS的单元格。CD44中重复出现明显更多的球体和菌落^明亮的CD44以外的细胞^昏暗的细胞。因此，我们的结果证实缺氧显著增加CD44和CD44的表达^明亮的卵巢癌细胞系OVCAR-3和ES2中的细胞具有明显更高的干样特性。

结论

总之，我们的研究结果表明，卵巢癌细胞OVCAR-3和ES2在缺氧条件下表现出延长的G0/G1期、更静止的状态和更多的SP细胞。同时，这些细胞在缺氧条件下表达较高水平的CD44、CD133、Oct3/4和Sox2。进一步证实CD44^明亮的细胞有助于提高细胞的干样特性。如果细胞在1%O中培养₂在48小时后恢复到常氧状态，细胞的生长速度明显高于常氧状态下的细胞，具有更高的渗透潜能和更高的集落和球体形成能力。结论是，卵巢癌细胞可以通过上调干细胞相关因子来提升其干细胞样特性，从而在缺氧条件下生存，并且在回到高氧环境时表现得更具攻击性。