两个新的5’非翻译外显子的功能表征揭示了NOD2蛋白表达的复杂调控

摘要

背景

NOD2是细菌细胞壁成分胞壁二肽的天然免疫受体。NOD2富含亮氨酸重复区的突变导致对胞霉素二肽的识别受损，已与克罗恩病（一种人类慢性炎症性肠病）相关。NOD2的组织特异性组成和诱导表达模式已被描述为复杂调控事件的结果，其分子机制尚未完全了解。

结果

我们已经确定了两个新的外显子二氧化氮基因（指定的外显子1a和1b），剪接到标准外显子2上，构成两种可选转录亚型（即外显子-1a/1b/2和外显子1-a/2）的5'非翻译区。这两个新的转录物表达丰富，似乎构成了生理条件下NOD2转录物的大多数。我们确认了该基因先前已知的第一外显子（指定外显子1c）在未刺激的单核细胞中的表达。含有三个短上游开放阅读框（uORFs）的第二个备选外显子1b的内含物在TNF-α刺激下或在炎症肠粘膜的促炎条件下下调体内使用融合到萤火虫荧光素酶（LUC）报告子的不同5'UTR剪接形式，我们证明uORF对翻译效率具有雷帕霉素敏感的抑制作用。

结论

两种替代启动子在二氧化氮基因导致组织特异性和环境依赖性二氧化氮转录亚型模式。我们首次证明了上下文相关的选择性剪接与uORF介导的翻译抑制有关。结果表明，在炎症信号的背景下，复杂的平行控制机制独立调节NOD2的表达。

背景

NOD2（CARD15，NLRC2）是NACHT/LRR受体家族的成员，其特征是具有中心核苷酸结合和寡聚结构域和由富含亮氨酸重复序列（LRR）重复序列组成的C末端传感器结构域[1,2]. NOD2的LRR被描述为直接或间接识别细胞内的胞壁二肽（MDP），MDP是革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌丰富的细胞壁成分[3,4]. MDP的识别导致蛋白激酶RIP2/RICK募集到N末端效应器结合域，该域由两个相邻的半胱天冬酶募集域（CARD）组成。随后，经典的IKK/IκB/NF-κB通路通过诱导的邻近信号被激活[5]. NOD2已被确定为克罗恩病（CD）的第一个主要易感基因[6–8]. 三种基因组变异二氧化氮基因，一个移码(2066847卢比，L1007fsinsC）和两个错义突变(2066845卢比–G908R，2066844卢比–R702W）代表主要的致病功能变体，并与微生物触发时转录因子核因子-κB（NF-κ[6–10]. 最近研究表明，促炎刺激，如TNF-α、IFN-γ和脂多糖（LPS）激活肠上皮细胞系和原代肠上皮细胞以及单核细胞HL-60细胞中NOD2（CARD15）基因的表达[11,12]. 这种上调至少部分依赖于NF-κB与二氧化氮标准第一外显子前面的启动子区域。

在执行突变检测和基因模型验证时NOD2/卡15，我们进行了跨物种比较和EST数据库分析，结果表明该基因的5'区注释不完整。因此，我们研究了NOD2（CARD15）基因座的基因组区域，以获得额外上游外显子的证据。我们发现，另外两个未翻译的外显子位于先前描述的NOD2（CARD15）基因第一外显子的上游，它们存在于转录亚型中，不包括先前报道的典型外显子1。这两个外显子在促炎条件下都显示出不同的剪接模式在体外（单核细胞）和慢性炎症性肠病（IBD）患者的结肠活检体内一个包含两个新外显子的长亚型包含三个短上游开放阅读框架（uORF），这三个开放阅读框架被证明可以抑制各自转录物的翻译效率。这些结果为NOD2表达的复杂调控提供了证据，包括两个启动子的交替使用和uORF对翻译的转录后调控。

结果

NLR家族的数据库和种间比较

数据库序列和跨物种比较表明，5'的当前注释是NOD2/卡15成绩单不完整：卡15Genbank记录AF178930中注释的基因结构由12个外显子组成，翻译起始于外显子1，终止密码子位于外显子12。Ogura报道的Northern分析显示外周血白细胞中有两种转录物[5]. 此外，数据库中的CARD15 mRNA亚型在其5'部分和外显子数量上存在差异（AF178930[5]; AJ303140型[6]).

CARD15 mRNA物种和NOD家族其他成员APAF-1和CARD4（NOD1）的5'UTR的比较表明存在显著差异。与沉积的CARD15 mRNA中的105或146个核苷酸相比，APAF-1（577 nt）和CARD4（424 nt）转录物中的5'UTR都更长。对CARD15的基因组位点的检查显示了CARD15位点组织的另一个差异。虽然APAF-1和CARD4的第一个外显子位于CpG岛上，并且通过常用的启动子/第一外显子预测程序在各自的基因组位点预测其位置，但在这种情况下未发现CARD15基因的5'端。CARD4和CARD15的基因结构表明，这两个基因是同源的，因为它们的外显子/内含子结构在外显子大小和内含子相位方面非常相似。这种相似性在基因的5'部分不存在。

人类（NM_022162.1）、小鼠（NM_145857.2）和牛（NM_001002889.1）转录本的种间比较卡片15显示外显子2上游缺乏同源性（增刊。图1）。

CARD15基因的额外上游外显子

我们用FirstEF程序扫描了外显子2上游的13 kb[13]. 该程序在前面描述的外显子1前面没有检测到CpG岛。预测程序在CARD15基因座外显子1上游约3.5kb的CpG岛上检测到一个启动子和第一个外显子。使用位于预测外显子和已知外显子2的引物进行RT-PCR。从外周血白细胞的cDNA中获得两个扩增子（图第1页). 克隆和测序表明，较小的物种对应于预测的第一个外显子剪接到CARD15的外显子2。较大的扩增子包含一个附加外显子，位于新的外显子1和外显子2之间，与预测属于独立外显子的一个外显子相对应粒状的-同源转录本[6]. 典型剪接位点位于基因组DNA上干预序列的两侧（图1B年). 我们命名这些新识别的外显子1a和1b，并保留先前描述的第一个外显子的名称（外显子1）（如AF178930）。这些外显子还通过使用外显子2中的基因特异性反向引物进行cDNA末端5’快速扩增（RACE）来确认，序列保存在NCBI数据库中（AY187245，短替代5'UTR；AY187422，长替代5'UTR；AY187243，典型外显子1）。在描述转录物的系统方法中也发现了短替代5'UTR，其中包含替代启动子区域（DA224866[14]).

图1

人NOD2基因5’区的结构和转录亚型的表达（A）基因组背景下新的两个外显子的序列。外显子大写，代表上游ORF的ATG用粗体印刷。在外显子2中用作替代翻译起始的生产性ATG用星号标记。（B） 来自两个交替启动子的交替剪接亚型的图形表示。STP，uORF的终止密码子。下面是由单字母氨基酸代码描述的交替翻译的蛋白质亚型的表示。（1） 表示典型外显子1中的原始起始，（2）表示两种新转录亚型在外显子2中使用的替代起始。（C） 用TNF-α（10 ng/ml）处理原代单核细胞12 h。按照概述放大NOD2，并在琼脂糖凝胶（D）上进行分析。在人体多组织板中放大NOD2。注意白细胞中短亚型外显子1a/2的优势。（E） 健康对照组结肠活检和克罗恩病患者炎症组织RT-PCR实验的密度分析。描述了NOD2的短（外显子1a/2）和长（外显父1a/1b/2）亚型之间的比率（**p<0.002；*p<0.05，Student’s T检验，来自n个=8名健康对照组和n个=11名发炎的克罗恩病患者；n个=5份来自健康对照的回肠样本，以及n个=来自克罗恩病患者的5份发炎回肠样本）。

使用位于外显子1的正、反义引物与外显子1a和1b的正向和反向引物相结合的RT-PCR，未在人类单核细胞cDNA和各种器官cDNA中检测到包含外显子的扩增子以及新的外显子（心脏、大脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠和结肠）(数据未显示). 当在外显子2、3或4中使用反向引物时，外显子1c中的引物PCR扩增结果为阳性。这些结果与其他发现一起证实了典型外显子1的存在和/或诱导[5,11,15]指出使用两种替代促进剂。

剪接亚型的分布和调控

为了确定替代转录亚型的表达模式，我们使用跨越外显子1a到4的引物，通过RT-PCR方法分析成人组织中的表达。DNA测序（未显示）证实了产生的扩增子的身份。RT-PCR分析表明，NOD2替代亚型的mRNA在小肠、结肠、前列腺、肺和肝脏中大量表达。有趣的是，长亚型和短亚型之间的比率差异很大，例如外周血白细胞显示出短外显子1a/2亚型的显著优势（alt 5'UTR NOD2 a，图。一维).

为了分析NOD2的不同UTR mRNA亚型的比率是否受细胞因子刺激的调节，纯化了原代人单核细胞并用TNF-α（10 ng/ml）刺激12 h。编码NOD2新亚型的转录物按照概述进行扩增，并在琼脂糖凝胶上进行分析（图。1摄氏度). 此处，刺激静息单核细胞导致长型（外显子1a/1b/2；alt 5'UTR NOD2 b）亚型降低到几乎无法检测到的水平，而编码替代短型的转录物水平增加。如前所述，通过克隆和计数PCR产物（>100个克隆）进一步分析NOD2刺激后UTR亚型的转录比[16,17]. TNF-α刺激后，含有短形式UTR的克隆的百分比同样增加(数据未显示).

克罗恩病患者的炎症结肠和回肠活检标本中检测到短UTR亚型显著增加。通过对结肠样本琼脂糖凝胶的密度分析，短型（外显子1a/2）在炎症CD活检中明显过度表达，而在接受结肠镜检查以进行常规癌症监测的对照受试者中，检测到的长型亚型（外显子1a/1b/2）是其的四到五倍（图1E级，p<0.002，学生T检验）。相反，在健康对照的非炎症活检中，观察到短型（外显子1a/2）的水平高于非炎症结肠样本。然而，在克罗恩病患者发炎的回肠活检中，只有短型（外显子1a/2）是可检测的（图。1E级，p<0.05）。

外显子1b上游ATG抑制翻译效率

序列检测表明NOD2 mRNA亚型与外显子1a直接连接到外显子2(alt 5'UTR NOD2未知2)允许从位于外显子2的第一个ATG进行翻译。较长的亚型（Exon1a/1b/2，alt 5'UTR NOD2 b)显示出可能会影响有效翻译的结构特征。外显子1b包含三个额外的上游ATG（uATG），前两个与终止密码子处于同一阶段，随后的CARD15开始，而第三个在不同的阅读框架中开始新的上游ORF（uORF）。在使用blastp和blastx算法的非冗余（nr）序列数据库中的第一个uORF产生的14氨基酸肽（MGLTLGRTMVSLKL）中，未发现与其他已知蛋白质有显著相似性。第二个uORF编码一个六氨基酸（MVSLKL）肽，第三个起始蛋氨酸产生4个氨基酸的uORF（MQID）。uATG和短uORF被认为是翻译水平上表达控制的调节因素。我们将两种新鉴定的剪接形式的外显子2 ATG上游的UTR插入报告基因载体，以便通过双重荧光素酶分析监测差异翻译效率（图2安培). HEK 293细胞和HL-60单核细胞(未显示)用短形式转染(alt 5'UTR NOD2未知2)显示出比转染含有较长亚型的载体的细胞高4倍的荧光素酶活性(alt 5'UTR NOD2 b; 图第2页). 使用由定点突变产生的三个uATG（ΔATG 1–3）的序列缺失结构，我们可以证明当去除uORF时，来自相同结构的翻译效率显著提高（图2摄氏度). 同样alt 5'UTR NOD2 b-Luc转染mTOR抑制剂雷帕霉素的细胞导致荧光素酶活性增加（图3)提示mTOR介导的翻译起始因子eIF2α和eIF4E的调节在控制uORF介导的NOD2翻译抑制中的作用[18–22].

图2

NOD2替代转录物5'UTR中的上游ORF（uORF）对翻译效率有影响（A）在荧光素酶报告基因（pGL Basic）前面克隆的含有NOD2的差异剪接选择性5'UTR（alt 5'UTR NOD2 A，仅含有外显子1a和alt 5'UTR-NOD2 b，含外显子1a和1b）的报告基因构建物ATG1-3表示uAUG和STP是各自的终止密码子。（B） 转染HEK293细胞中两种结构的组成荧光素酶活性。（C） uAUG的顺序删除（例如ΔATG 1表示第一个uAUG被删除）消除了长替代5'UTR（alt 5'UTR-NOD2 b）的抑制活性。所有值均对应于至少三个独立实验计算的平均值±SD。RLU，相对荧光素酶单位，通过双荧光素素酶分析测定*p<0.05，**p<0.01，学生T检验）。

图3

雷帕霉素可抑制选择性NOD2 5'UTR的翻译抑制从含有具有和不具有uAUG缺失的5’UTR外显子的构建体（ΔATG1.2.3和野生型）中测定相对萤光素酶活性。注意雷帕霉素处理（1μM）后uORFs的抑制作用显著降低。值表示从三个独立实验计算的平均值±SD。RLU，相对荧光素酶单位，通过双荧光素素酶分析测定*p<0.05，学生T检验）。

讨论和结论

本研究的显著发现是，两个新的外显子（外显子1a和1b）在NOD2/卡15基因，似乎有助于在生理环境中严格调节NOD2蛋白水平。包含外显子1a和1b的转录物的表达由位于CpG岛内的替代启动子驱动，而包含规范外显子1的转录物则由NF-κB依赖的启动子调控。越来越多的证据表明，真核生物mRNA的5'-UTR对基因表达的转录后调节起着重要作用[23–26]. 大约10%的mRNA中存在主开放阅读框上游的AUG密码子（uAUG）或短上游ORF[27]. 虽然该机制的功能影响尚未在全基因组水平上进行研究，但最近对含有uAUG或uORF的选定UTR的研究表明，在从植物到哺乳动物的各个王国之间的负翻译控制中起着重要作用[28–32]. 人类可选5'-UTR区外显子1b内二氧化氮在位于外显子2的主要ORF上游发现了三个可变长度的uORF。如荧光素酶报告基因检测和uAUG定点突变所示，这些uORF对翻译效率产生负面影响。该效应对雷帕霉素敏感，表明真核翻译起始因子eIF2α和eIF4E的作用，这两个因子被证明是受调控的mRNAs亚群翻译起始的决定性因素顺式-监管小型上游开放阅读框架[18,22,33]. 虽然在用促炎细胞因子TNF-α刺激后，观察到代表新的短亚型的报告构建物有更高的荧光素酶表达的趋势，但仍需进一步研究以确定在急慢性炎症中调节elF活性的信号通路。

我们首次证明了上下文相关的选择性剪接与uORF介导的翻译抑制有关。这种额外的调节机制可能有助于炎症中NOD2蛋白水平的全面控制。我们发现，用促炎细胞因子TNF-α刺激单核细胞会将剪接亚型的比率转移到缺少包含调控uORF的外显子1b的较短亚型。同样，在克罗恩病患者的炎症结肠组织中，可以检测到短替代5'UTR转录亚型的优势，这可能导致在没有uORF的情况下蛋白质水平升高。中的三个主要变体二氧化氮(2066847卢比–L1007fsinsC，2066845卢比–G908R和2066844卢比–R702W）与涉及小肠的CD的一个独特亚表型遗传相关（维也纳分类L1和L3[34]) [35,36]. 在Paneth细胞中显示NOD2的高组成表达[37]代表在回肠末端分泌抗菌肽的特殊肠上皮细胞。基因消融节点2在小鼠中导致回肠中cryptdin（小鼠中的α-防御素同源物）表达的明显缺陷[38]. 一直以来，回肠CD中显示出人类α-防御素-5和-6的NOD2基因依赖性损伤[39]，这可能是CD发病机制中观察到的免疫屏障功能障碍的主要原因[40]. 有趣的是，在回肠活检中，我们观察到短（即翻译上更活跃的外显子1a/2）亚型具有更高的构成代表性。在发炎的回肠中只能检测到外显子1a/2。因此，我们假设这两种新亚型的选择性剪接有助于在炎症条件下观察到的NOD2蛋白水平的上调，以及不同细胞类型（即单核细胞和可能的Paneth细胞）中的高组成型表达。有趣的是，用TNF-α刺激单核细胞会导致NOD2短的选择性剪接亚型的下调，该亚型编码一种仅含CARD-的自抑制蛋白，该蛋白是通过跳过外显子3产生的[17]. 尽管涉及相互作用机制（外显子跳跃增加vs.减少），但TNF-α刺激后NOD2转录物剪接模式的这些复杂变化都导致细胞NOD2传感器功能的更高灵敏度。

一个明显的悖论是由以下事实造成的：二氧化氮在遗传学上与克罗恩病发生的高风险相关，而几个独立于各自的组检测到较高水平的NOD2蛋白二氧化氮基因型。然而，人们普遍认为，肠道炎症中NOD2表达上调是对细菌入侵的一般反应，是克罗恩病患者修复受损上皮屏障的徒劳尝试。我们的一个主要目标是分析两个替代启动子在不同细胞类型中的差异使用以及uORF介导的翻译抑制对NOD2蛋白水平的总体控制的调节作用。这些研究不仅可以对人类炎症性疾病的病理生理学提供更深入的见解，还可能有助于理解先天免疫系统在与共生菌群终身相互作用期间对敏感性和耐受性的复杂生理调节。

方法

5'区勘探：计算机分析，RT-PCR

使用计算机预测方法分析CARD15基因座（基因库：AF178930）的基因组序列，如[13]. 为了验证发布的二氧化氮在小鼠、奶牛和人类基因组序列中搜索基因模型、保守外显子（Twinscan基因预测[41])与预测的剪接位点有关[42]. 使用ClustalW校准不同物种的5’exon[43]. 先前报告和预测的外显子通过RT-PCR以及随后的PCR产物克隆和测序进行了验证：（i）在一组cDNA组织样本中，（ii）在来自新分离的单核细胞的cDNA中，以及（iii）在结肠活检的cDNA。

单核细胞分离和结肠活检样本

从四名健康志愿者（年龄24-33岁；1名女性）抽取的100 ml外周血中分离出单核细胞，并按前述方法进行培养[44]. CD患者(n个结肠活检=11，回肠活检=5）和正常对照(n个结肠活检n=8，回肠活检n=5）。根据临床需要，作为常规结肠镜检查的一部分，从炎症区域获得了多达六个额外的活检。克罗恩病的诊断是根据既定的临床、内镜和放射学检查结果进行的。在进行非特异性腹痛调查或癌症筛查的过程中，从大体和组织学上正常结肠的患者中获得正常对照组织切片。至少在手术前一天，所有患者都书面同意进行额外活检和/或匿名基因和功能分析。研究开始前，研究和样本收集得到了机构伦理委员会的批准。

取样后立即在液氮中快速冷冻活检。使用带聚四氟乙烯头的手动破碎机（德国不来梅Omnilab）在液氮下将速冻活组织切片粉碎成细粉，并根据制造商协议使用RNeasy Mini Kit（德国希尔登Qiagen）分离总RNA。通过标准甲酰胺凝胶电泳评估，洗脱的RNA被确定为完整的，并且当GAPDH特异性引物仅在逆转录后产生PCR产物时，表明没有污染基因组DNA。

mRNA分离和RT-PCR

使用来自Qiagen的RNeasy试剂盒从初级外周血单核细胞中分离出总RNA。如别处所述，逆转录300 ng总RNA[44]. 为了研究组织特异性表达模式，从Clontech（加利福尼亚州帕洛阿尔托，美国）获得了一个商业组织面板。用于扩增NOD2替代转录物的引物为（5'-CAC TGG GCT TTT GGC GTT C-3'（义）和5'-CGG CAA CCT GAT TTC ATC AC-3’（反义）。用于扩增规范转录物的引物为5'-GGA GTG GGC CTT GGA GTC GG-3'（正义）和5'-CCA GGA CAT TCT CTG TGT ATA T-3'（反义）。

应用以下条件：在95°C下变性5分钟；95°C下35次30秒循环，60°C下20秒循环，72°C下45秒循环；在72°C下最后延伸10分钟。为了确认在每个实验中使用等量的RNA，平行检查所有样品的β-actin mRNA表达。所有扩增的DNA片段在1%琼脂糖凝胶上进行分析，随后由BioDoc分析仪记录（Biometra，德国哥廷根）。

剪接变体的量化

为了确定包含外显子1a/1b/2和外显子2a/2的转录物的准确比率，我们采用了一种克隆测序方法，该方法已被描述为揭示基因型拼接效应[11,16,45]. 将30轮PCR（指数期）的PCR产物连接到TA-克隆载体（Invitrogen）中，并使用染料终止化学（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）在3730×L DNA分析仪上对所示数量的单个克隆进行测序。

报告者分析

在标准条件下，使用以下引物（限制性位点下划线）NOD2HindIIIpGL:AAGCTTGGAGTGGCCTGTGTC und NOD2NcoIpGL:CCATGGACATTTCACACCTGCG在cDNA中扩增NOD2替代转录物的5'u TR，并克隆到TA载体（Invitrogen）中。在HindIII/NcoI限制后，将插入物亚克隆到pGL2-荧光素酶质粒（Promega）中。所有结构在使用前均在ABI3730xL测序仪中进行了序列验证。根据制造商的说明，使用Stratagene的定点突变试剂盒对UTR进行修改。所有引物均购自Eurogentec（比利时列日）。

HL-60粒单核细胞和HEK293细胞购自德国微生物和细胞培养物收藏中心（DSMZ，德国布伦瑞克）。所有细胞均在RPMI+10%胎牛血清（FCS）中培养。用Fugene 6™（瑞士巴塞尔罗氏）进行转染，转染中使用了指定数量的相应质粒。转染后4小时更换培养基，以避免刺激时出现转染试剂。TNF-α购自R&D Systems（美国明尼苏达州），雷帕霉素购自Sigma（德国德伊森霍芬）。使用Promega的双荧光素酶报告基因试剂盒（DLR），使用雷尼利亚-包含由胸腺嘧啶激酶最小启动子驱动的质粒pRL-TK。使用Tecan Genios Pro（Tecan，Bubendorf，瑞士）分析细胞裂解产物。所有样品至少测量了两次，是三次独立实验的结果。萤火虫荧光素酶活性的结果被归一化为肾小球荧光素酶活性。