基因芯片分析显示G蛋白偶联受体和相关蛋白在HEK293、AtT20、BV2和N18细胞系中的表达

摘要

背景

G蛋白偶联受体（GPCR）是研究最广泛的基因超家族之一。数以千计的GPCR研究已经利用了异源表达系统，例如人类胚胎肾细胞（HEK293）。尽管通常被视为“空白板条”，但这些细胞系内生地表达GPCR和相关信号蛋白。特定GPCR研究的结果可能会受到这种基本上未知的受体和/或信号蛋白补体的深刻影响。描述细胞系中GPCR表达谱的信息几乎不易获取。可获得的信息往往局限于范围——在数百个GPCR和相关蛋白中，不太可能找到有关特定细胞系中十几个以上蛋白表达的信息。微阵列技术允许快速分析数千个候选基因的mRNA水平，但尽管通常公开，结果可能难以有效获取，甚至难以解释。

结果

为了弥合这一差距，我们使用微阵列测量了四种常用于GPCR研究的细胞系（HEK293、AtT20、BV2和N18）中非化学感受性GPCR和100多种GPCR信号相关基因产物的mRNA水平。

结论

这项研究为研究人员提供了这四种细胞系所拥有的内源性信号传导系统的易于获取的mRNA图谱。这将有助于选择最适合研究GPCR和相关信号蛋白的细胞系。它还提供了对GPCR和那些信号蛋白之间潜在相互作用的更好理解。

背景

G蛋白偶联受体（GPCR）基因超家族由数百个成员组成，在所有组织中广泛表达，并作为多种配体的受体。其中大约有100个受体被认为是孤立的GPCR，因为还没有证实它们的内源性配体[1]. 具有七个跨膜α-螺旋结构域的特征[2]，GPCR介导从细胞生长到神经传递的广泛细胞过程[1–三]. 许多GPCR的分类系统已作为生物信息工具开发出来[三–5]. 最常用的GPCR分类系统之一，由Kolakowski提出并由Vriend开发[4,6,7]根据与原型受体的结构相似性，将GPCR分为六类。A类GPCR是最丰富的（>80%的GPCR），由视紫红质的高序列同源性定义，包括化学感受器。B类GPCR也称为分泌素样受体。C类GPCR是代谢性谷氨酸样受体。F/S类受体由卷曲/光滑的受体组成，尽管对其与G蛋白偶联的能力存在争议[2]. 哺乳动物中不存在D类/真菌信息素和E类/cAMP受体。

通过配体结合激活时，GPCR与由三个亚基组成的异源三聚体G蛋白偶联：Gα、β和γ。G蛋白α亚基分为四类：G_{输入/输出}，G_秒，G_q个、和G_12/13[8]. 每个亚单位与特定的细胞蛋白靶点（例如腺苷酸环化酶）偶联，通过该靶点调节细胞活性。Gβ/γG蛋白亚基能够作用于其自身的特定靶点，例如调节离子通道活性[9–11]. 因此，异源三聚体G蛋白的有效补充将影响其反应谱。

调节系统控制GPCR信号传导的时间和持续时间。GPCR激酶（GRKs）磷酸化激动剂占据的受体，通常导致受体脱敏。β-抑制素是一种支架蛋白，用于激活GPCR并阻止G蛋白与受体结合。它们还用于将GPCR信号在空间上分离到有丝分裂原活化蛋白激酶等分子[12,13]. G蛋白信号转导（RGS）蛋白的调节子增强Gα亚基的GTPase活性，是另一个在精细调节GPCR信号转导中很重要的蛋白质大家族[14,15].

由于其在许多细胞功能中的中心作用，GPCR是重要的治疗靶点。不同的报告估计，在所有处方药中，有30%至50%是针对GPCR的。有趣的是，这些药物仅针对约10%的非化学感觉受体，留下数百个GPCR作为潜在的药物靶点[2,9,16].

识别配体、研究受体-蛋白质相互作用以及测量受体激活的细胞效应通常是通过在HEK293和AtT20等细胞系中异源表达GPCR来实现的[17,18]. 它们还用作提取它们的细胞类型的模型（例如，BV2表示小胶质细胞，N18表示神经元）[19–21]. 然而，这些细胞系仍然是一个黑匣子；研究人员在没有充分了解GPCR和相关蛋白补体的情况下使用它们。在这些细胞系中存在未知蛋白可能会混淆一系列其他合理的实验，GPCR及其调节蛋白的差异表达可能解释了不同细胞系报告结果的差异[13,17,22–25]. 同样清楚的是，GPCR可以与其他GPCR形成低聚物。这些低聚物可赋予感兴趣的转染GPCR不同的信号特性，并可增加变化性和复杂性层。

使用基于聚合酶链反应（PCR）的方法，在受体对受体的基础上定义GPCR表达的努力只触及了表面。即使是广泛使用的HEK293细胞，也只有不到30个GPCR的表达被描述[17,26]. 最近开发的高通量方法使得同时检测数千个基因的mRNA水平成为可能。微阵列分析在可获得性和成本方面已经足够成熟，使其应用于这个问题变得容易处理。我们并不是第一个利用微阵列技术检测HEK293细胞中mRNA表达水平的人[26]然而，对这些细胞系进行微阵列分析的大多数研究都检测了感兴趣的特定基因产物，并且只报告了这些基因产物的数据[20,26–28]. 它们的完整数据集可以通过NCBI获得，但非专业用户很难访问和整理。

因此，我们试图鉴定并获取用于GPCR研究的四种细胞系（HEK293、AtT20、BV2和N18细胞系）的内源性表达的非化学感受性GPCR的全部补体。使用微阵列分析，我们测量了这四种细胞系中每一种的mRNA水平，专门确定了GPCR和100多种GPCR相关基因产物的表达水平，并在此处报告。

结果

我们首先检测了HEK293细胞，这是一种用5型腺病毒DNA转化人类胚胎肾细胞的细胞系。1977年开发的HEK293细胞可能是用于GPCR和其他相关蛋白异源表达（瞬时和稳定表达）的最广泛的细胞系[17]. 数字1,2,三,4,5和6显示在HEK293细胞中发现的GPCR和GPCR相关基因产物的mRNA水平。A类GPCR，如图所示1和2HEK293细胞表达特定受体家族中几种不同类型受体的mRNA：多种类型的腺苷、溶血磷脂、嘌呤能、前列腺素和蛋白酶激活受体等。在与孤儿GPCR研究相关的结果中（图三)，HEK293细胞含有高信息水平的GPR37，2种孤儿-LGR（糖蛋白激素）受体——LGR4和LGR5，GPR39，以及非常高水平的褪黑素相关受体GPR50。因此，HEK293细胞可能是用于这些受体去形态化的合适工具。有趣的是，HEK293细胞含有已知配体的B类GPCR相对较少的mRNA（图4A级)，但许多B类孤儿GPCR的水平相当高。如图所示，C类GPCR也是如此4B类虽然它们确实含有高水平的GABA_B类R1受体信息，尽管缺少GABA的mRNA_B类R2，是形成一个功能齐全的GABA-B受体所必需的。最后，对于GPCR，HEK293细胞包含多种类型的卷曲受体和平滑受体（图4摄氏度). 数字5和6显示各种类型的GPCR信号相关基因产物的mRNA水平，如G蛋白及其许多靶点和下游效应器，以及调节GPCR信号的蛋白、GRK、β-抑制素（ARRB）和RGS蛋白。有趣的是，HEK293细胞表达腺苷酸环化酶和蛋白激酶A和C（PRKA，PRKC）以及磷脂酶C（PLC）的多种亚型的mRNA，而磷脂酶A（PLA）和RGS蛋白的多样性有限。HEK293细胞的每个亚单位似乎都有几乎全部的G蛋白亚型，这使得这些细胞成为一个很有吸引力的环境，可以表达任意数量的GPCR来研究下游G蛋白介导的信号。

图1

A类GPCR的mRNA表达水平HEK293、AtT20、BV2和N18细胞系已知配体的A类GPCR mRNA水平的微阵列分析。灰色线表示具有统计学意义的阈值，而暗条是检测到具有统计学意义的mRNA水平的蛋白质。白色条表示存在但未达到统计显著性的蛋白质的mRNA水平。缩写：5-HT=5-羟色胺；促性腺激素释放激素=促性腺激素释放激素。

图2

A类GPCR的mRNA表达水平HEK293、AtT20、BV2和N18细胞系已知配体的A类GPCR mRNA水平的微阵列分析。灰色线表示统计显著性阈值，暗条表示检测到mRNA具有统计显著性水平的蛋白质。白色条表示存在但未达到统计显著性的蛋白质的mRNA水平。缩写：MCH=黑色素浓缩激素；TRH=促甲状腺激素释放激素。

图3

A类孤儿GPCR的mRNA表达水平HEK293、AtT20、BV2和N18细胞系未知配体的A类GPCR mRNA水平的微阵列分析。灰色线表示统计显著性阈值，暗条表示检测到mRNA具有统计显著性水平的蛋白质。白色条表示存在但未达到统计显著性的蛋白质的mRNA水平。缩写：ND=未确定。

图4

B类、C类和F/S类GPCR的mRNA表达水平HEK293、AtT20、BV2和N18细胞系已知配体GPCR mRNA水平的微阵列分析。A： B类GPCR。B： C类GPCR。C： F/S类GPCR。灰色线表示统计显著性阈值，暗条表示检测到mRNA具有统计显著性水平的蛋白质。白色条表示存在但未达到统计显著性的蛋白质的mRNA水平。缩写：BAI=脑血管生成抑制剂；CELSR=Cadherin EGF LAG七通路G型受体；CRF=促肾上腺皮质激素释放因子；ND=未确定；PACAP=垂体腺苷酸环化酶激活多肽；VIP=血管活性肠肽。

图5

GPCR相关信号蛋白的mRNA表达分析HEK293、AtT20、BV2和N18细胞系GPCR相关信号蛋白mRNA水平的微阵列分析。灰色线表示统计显著性阈值，暗条表示检测到mRNA具有统计显著性水平的蛋白质。白色条表示存在但未达到统计显著性的蛋白质的mRNA水平。缩写：GRK=GPCR激酶；PKA=蛋白激酶A；PKC=蛋白激酶C。

图6

GPCR相关信号蛋白的mRNA表达分析HEK293、AtT20、BV2和N18细胞系GPCR相关信号蛋白mRNA水平的微阵列分析。灰色线表示统计显著性阈值，暗条表示检测到mRNA具有统计显著性水平的蛋白质。白条表示存在的蛋白质的mRNA水平，但没有达到统计学意义。缩写：ND=未确定；PLA=磷酸酶A；PLC=磷脂酶C；PLD=磷脂酶D；RGS=G蛋白信号调节器。

接下来我们分析了AtT20细胞系，这是一种神经内分泌细胞系，来源于一种具有神经元样特性的小鼠垂体瘤[29]. 该细胞系常被用作神经内分泌细胞模型，是研究GPCR对离子通道调控的有用细胞系[18,30,31]. 与HEK293细胞不同，目前很少有人对AtT20细胞中存在的GPCR和相关信号分子进行鉴定。我们目前的结果表明，AtT20细胞表达多种GPCR mRNA。数字1和2表明它们具有许多类型的a类受体，每种类型都有几个亚型。根据我们的分析，它们表达腺苷、趋化因子、多巴胺、神经肽FF、前列腺素和生长抑素受体的几种不同亚型，以及其他类型的一些个体成员。图三显示AtT20细胞具有有限宽度的a类孤立GPCR。在B类中，AtT20细胞表达多种胰高血糖素、孤儿脑特异性血管生成抑制剂（BAI）和孤儿lattrophilin受体的mRNA（图4A级). 与HEK293细胞一样，AtT20细胞表达GABA的mRNA_B类R1（GABA含量可检测但不显著_B类R2 mRNA），但与HEK293不同，它们表达几个代谢型谷氨酸受体基因（图4B类). 对于AtT20s中的F/S类，我们检测到六个卷曲受体的mRNA，但没有检测到平滑受体的mRNA（图4摄氏度). 与HEK293相比，AtT20的GPCR信号相关基因产物的储备相对较少，尤其是在G蛋白亚基中（图5和6).

接下来我们检查了BV2细胞，这是一种经常用作小胶质细胞功能研究模型系统的细胞系[32]. 如图所示1和2BV2细胞主要具有过敏毒素、趋化因子和前列腺素A类GPCR的mRNA，这与免疫系统衍生细胞系的预期一致。它们还表达其他受体类型的分散mRNA，例如一些毒蕈碱、生长抑素和脂质受体等。正如文献报道的那样，BV2细胞表达CB2大麻素受体（Cnr2）[33]这使得它们在这里检测的其他细胞系中独一无二。我们还观察到大量不同的a类孤儿GPCR mRNA的表达，如图所示三尽管B类孤儿的剧目不太多样化（图4A级)或C级（图4B类)受体存在。BV2细胞仅在显著但较低的mRNA水平表达一种C类GPCR：代谢型谷氨酸受体mGluR1（Grm1）。图4摄氏度显示BV2细胞具有几种不同类型的卷曲受体和平滑受体的mRNA。BV2细胞具有大量GPCR信号相关基因产物（图5和6). 虽然没有HEK293细胞广泛，但BV2细胞具有多种不同磷脂酶、PKA、PKC和腺苷酸环化酶的亚型。它们的β-抑制素、RGS蛋白和GRK水平也表明它们具有高度调节GPCR信号的能力。

最后我们研究了N18细胞系。这种细胞系来源于神经母细胞瘤，通常用作神经元样细胞系。它被用作分析离子通道功能对毒素和其他调节物的反应的工具[19,34–37]. 我们发现N18细胞具有广泛的a类GPCR mRNA，如图所示1和2N18细胞具有几种毒蕈碱型乙酰胆碱、腺苷、趋化因子、神经肽、前列腺素、蛋白酶激活的和生长抑素受体的mRNA，以及一些其他类型的个体，如CB₁大麻素受体（Cnr1）。与BV2细胞一样，N18细胞也有相当多a类孤儿GPCR的mRNA（图三)也有类似的配置文件。它们进一步表达广泛补体B类GPCR的mRNA（图4A级)但表达了C类GPCR的有限概况（图4B类). 它们也有许多不同类型卷曲受体的mRNA，但缺乏平滑受体的mRNA（图4摄氏度). N18细胞表达大量GPCR信号相关基因产物。它们具有丰富的G蛋白水平和多种PKA亚型。根据检测到的GRK、RGS和β-抑制素mRNA的分类，N18细胞的GPCR也可能受到严格调控（图5和6).

为了用微阵列分析验证我们的发现，我们对这四种细胞系进行了定量实时PCR（qPCR）分析。我们选择了一系列GPCR，主要是孤儿受体（Cnr1、Cnr2、Gpr3、Gpr12、Gpr35、Gpr83和Gpr119），以及两种磷脂酶（Plcb1和Plcb4）作为候选者，使用这种替代方法测量它们的mRNA水平。我们选择了在四个细胞系中具有不同表达谱的基因。数据以图形形式绘制7以一种方式将使用qPCR在每个细胞系中测量的mRNA拷贝数与我们的微阵列实验测定的mRNA水平相关联。qPCR数据与我们的微阵列数据大体一致。我们观察到所有基因的拷贝数都较高，我们观察到这些基因的微阵列表达具有统计学意义，这表明我们的微阵列和qPCR数据之间总体上具有良好的相关性。qPCR确实检测到一些基因的mRNA，这些基因的表达水平在微阵列分析中没有达到统计意义。这些基因在AtT20细胞中为Plcb4、Gpr3和Gpr92，在N18细胞中为Plcb1、Gpr83和Gpr92。

图7

微阵列分析的定量聚合酶链反应验证对来自（A）HEK293、（B）AtT20、（C）BV2和（D）N18细胞系的10个基因进行定量PCR分析。将qPCR分析测定的mRNA水平与图1、图3和图6中微阵列分析测量的mRNA含量绘制成图。虚线表示微阵列数据的统计显著性阈值。介于0和该阈值之间的点表示通过微阵列分析检测到的基因，但未达到统计显著性。较低的临界阈值（Ct）表示mRNA拷贝数较高。

讨论

诱导已知蛋白在模型细胞系统（如此处分析的细胞系）中表达的能力是一个显著而重要的工具。然而，利用这些细胞系的GPCR研究界对GPCR的补充及其表达的相关信号机制只有有限的数据。当细胞系用于异源表达时，忽视细胞系的内源性蛋白表达谱可能导致对受体功能性质的错误结论。事实上，细胞环境可以对GPCR信号产生巨大影响（参见[22]. 微阵列技术现在已经足够成熟，可以确定基因组测序物种细胞系的mRNA表达。然而，即使在进行了微阵列研究的地方，他们的数据仍然只有那些有足够手段、经验和时间提取有用信息的人才能名义上获得。缺乏对普遍感兴趣的信号蛋白mRNA表达的系统性公开研究阻碍了使用这些重要细胞系的研究。这项研究提供了在GPCR研究中常用的四种表型不同的细胞系中检测数百种不同GPCR和相关信号蛋白的数据。

HEK293细胞可能是使用最广泛的细胞系，超过4000份出版物引用了该细胞系，并且初步工作已经确定了一些内源性受体（见下文）。我们通过证明HEK293细胞表达至少75种不同的GPCR mRNA来扩展这一知识。我们的分析证实了关于HEK293细胞中GPCR mRNA表达模式的许多报道：ADORA2B、CHRM3、F2R、F2RL1、GABABR1、GPCR5A、GPR19、LGR5、LPAR1、LPAR2、P2YR1、PTGER2、S1PR和SSTR5[17,26,38–46]. 据报道，HEK293细胞具有一些受体的mRNA，在我们的研究中，这些受体未在统计上显著表达：5HT1D、5HT6、5HT7、ADRA2（a-c）、ADRAB2、AGTR1、BDKRB2、DRD2、GPR1、GPR161、GRM4、P2YR2和SSTR2[17,26,46–50]. 我们的结果还表明，HEK293细胞表达大多数G蛋白亚单位亚型、腺苷酸环化酶、蛋白激酶A和C以及磷脂酶C的多种亚型的mRNA。此外，它们有助于研究G蛋白介导的信号调节，如β受体1和2 mRNA的显著水平，可见GRK3-5和许多RGS亚型。

目前对AtT20细胞中GPCR的表达模式知之甚少。我们证实了AtT20细胞中存在Sstr1和Sstr2 mRNA[30]，但没有观察到之前报道过的任何其他受体（如Chrm4）的显著水平[51]、Vipr1a、Adcyap1r1或Sstr5[30,52,53]. 据报道，AtT20细胞对CRF敏感，因此缺乏显著水平的CRF受体mRNA是令人感兴趣的[54]. 尽管有报道称Hrh3或Hrh4组胺受体存在，但未检测到其mRNA[55,56]，但发现Hrh2水平较低。转速1[31]未检测到，Tacr2和Tacr3也未检测到。我们也没有发现孤儿Cmkor1/Cxcr7[57]. 值得注意的是，至少有两个AtT20克隆可用，这可能解释了我们发现的一些差异。一般来说，与其他测试的细胞系相比，AtT20细胞具有更少种类的GPCR相关信号和调节基因产物。在我们研究的大约120个GPCR信号基因产物中，AtT20细胞有45个显著表达信号相关蛋白，而其他3个细胞系中的每个细胞系都有72个或更多。AtT20细胞是唯一没有明显β-阻遏素1（Arrb1）或GRK3-5水平的细胞。仅发现三种RGS基因产物处于显著高水平：Rgs14、Rgs20和Snx13。

BV2细胞通常用于研究小胶质细胞生物学。这些细胞存在于两种状态之间：静止状态和激活状态。例如，在干扰素γ治疗（启动状态）后，BV2细胞同时增加Cnr2和Gpr55 mRNA水平，而在脂多糖治疗（激活状态）时，这些水平降低[58]. 在我们的案例中，BV2细胞是在预期促进静息状态的条件下培养的。我们可以证实文献报道的BV2细胞表达Adora3[59]，序号2[33,58]，Mtnr1a[60]，加尔2[61]、Ccr5、Cxcr3[62]和Rgs2、10、12[27,28,63]. 我们还检测到受体的mRNA，据报道，这些受体在受到Ccrl2等刺激时上调[28,64]、Ptafr、Ptigr[64]和Rgs7[65]. 在这里，我们也发现了一些已知受体，我们发现其mRNA水平低于我们定义的统计显著水平：Hcrtr1[66]，Gpr55[58]和Cx3cr1受体[67]. 我们没有检测到激活上调的Prokr1[27]也不适用于激活后下调的Oprm1、P2ry1和Gpr149[27,28]. 几份报告已确定在BV2和原发性小胶质细胞中存在mGluRs[21,68,69]. 有趣的是，一般认为Grm1不存在于BV2细胞中，但这是我们唯一显著检测到的。我们确实发现Grm3、6和8的水平较低且不显著。这些差异可能是由于细胞系的激活状态不同所致。BV2细胞似乎具有不同的受体和信号基因产物。

在所测试的细胞系中，特征最差的是N18神经母细胞瘤细胞系。已知它们表达Cnr1[70]我们的分析证实了这一点。据一些报道，它们不表达毒蕈碱受体[71]，但我们的分析表明，它们具有三种不同类型（Chrm2、3和4）的mRNA，与其他报告一致[72,73]. 这些研究还发现了分泌素、前列环素、阿片类和α的证据₂-肾上腺素能受体支持这一点，我们发现Ptgir1、Ptger1、Ptger3、Ptger 4、Oprd1、Oprl1和Adra2b的mRNA水平显著升高。Sctr、Adra2a、Oprk1和Oprm1的mRNA水平也没有达到统计学意义。另一份报告描述了P2ry2表达[74]，但对于这一点，我们只发现了较低的非显著水平。除了这些报道之外，似乎很少有人知道该细胞系中的GPCR信号，该分析大大扩展了我们对其GPCR表达补体的了解，至少在mRNA水平。与BV2细胞一样，N18细胞似乎拥有大量GPCR、效应器和调节蛋白，始终是所分析的每个受体类别中最高的表达者之一。

有趣的是，即使是最高产的细胞系也只表达了非化学感受性GPCR全谱中的一小部分（约360）。在这四种细胞类型中，BV2细胞表达的GPCR总数最高（108），其次是N18（105）、AtT20（79）和HEK293细胞（73）。BV2细胞具有最大的A类受体总丰度（88），但与N18细胞具有相同数量的A类孤立GPCR（图三). 另一方面，HEK293细胞具有更多B类和C类孤儿的信使核糖核酸（图4). 有趣的是，BV2和N18细胞系更常被用作特定细胞类型的模型，它们表达最多样化受体的mRNA。这可能导致对广谱配体的更大敏感性，我们在这两个细胞系中测量的高mRNA水平的大量信号蛋白证明了这一点。同样令人感兴趣的是，HEK293和AtT20细胞具有这四个系中最低数量的GPCR。低表达（数量和类型）可能会使这些细胞系成为更好的分化细胞模型，从实验角度来看，可能会使特定细胞系作为可引入感兴趣基因产品的“干净板岩”更具吸引力。

mRNA表达水平不能保证特定mRNA被正确翻译、折叠和运输以产生功能蛋白。我们的发现与基于PCR的方法报道的结果之间的差异可能是由于细胞系中随时间、传代数和生长条件的不同而出现的差异。差异还可能归因于通常用于提取和扩增mRNA的基于PCR的技术：在某些情况下，此处引用的许多研究中使用的技术，其中一些不允许相对量化，可能检测到受体mRNA水平很低，没有达到统计意义的阈值。鉴于微阵列和基于PCR的技术之间的潜在差异，我们采用qPCR分析来测试微阵列结果的有效性（图7). 我们的qPCR结果和微阵列数据之间的总体一致性为以下概念提供了信心：微阵列分析准确地反映了这些GPCR及其信号蛋白的mRNA的存在。

结论

总之，对这四种细胞系中几乎全部非化学感受性GPCR和相关信号蛋白的微阵列分析大大扩展了我们对其潜在信号系统的理解。这些细胞系经常被用作特定细胞类型的模型、异源表达以及抗体筛选的对照。本研究提供了可访问的mRNA表达谱，我们希望这将有助于GPCR超家族的研究人员选择合适的细胞系来研究特定的GPCR或相关蛋白，并进一步了解GPCR与这些细胞系中相关蛋白之间的潜在功能相互作用。我们希望，在对其他常用细胞系（如CHO和COS7细胞）的宿主基因组（在本例中分别为仓鼠和绿猴）进行测序并可用于基因微阵列分析时，这项工作最终能扩展到这些细胞系。

方法

细胞培养

人类胚胎肾（HEK）细胞（目录号CRL-1573）和AtT20细胞（目录编号CRL-1795）购自美国类型培养收藏馆（马萨诸塞州波士顿）。BV2小胶质细胞取自Nephi Stella博士（华盛顿大学）[32,33]. N18神经母细胞瘤细胞来自华盛顿大学William Catterall博士[75]. Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）、青霉素、链霉素和胎牛血清（FBS）购自Gibco Life Technologies（马里兰州Rockville）。所有细胞系均在含有10%FBS、100单位ml-1青霉素和100μg ml-1链霉素的DMEM中生长，37°C，5%CO₂加湿空气。重要的是，BV2细胞保持在将BV2推向静止、非激活状态的条件下。

细胞制备、mRNA提取和微阵列分析

杂交和样品成像/量化由印第安纳大学基因组学和生物信息学中心进行。为了研究小鼠和人类mRNA表达，我们使用Nimblegen 4×72k阵列（分别为NCBI MM8和NCBI HG18；60 mer探针长度）。这些是四重阵列，可以检测四个样本中约20000个基因的mRNA表达。布局为每个目标提供了三个探针，我们对其值进行平均以获得样本值。我们培养了每个细胞系的四个10厘米的平板，当细胞生长到汇合时进行单独的提取。在无RNase条件下，使用TRIzol试剂（Invitrogen）从细胞中提取总RNA，然后进行氯仿处理（100 ul/ml）。离心后，提取含有总RNA的水相，并用异丙醇（500 uL/mL）处理5-10分钟。离心后，分离RNA颗粒，用乙醇（75%；1ml/1mL试剂溶液）洗涤，然后再次离心并风干。将RNA颗粒重新悬浮在无RNase水中。使用NanoDrop ND-1000评估总RNA数量，生物分析仪2100测定28S/18S比率以进行质量评估。为了合成杂交靶点，我们从10.0μg总RNA开始，使用Invitrogen的SuperScript双链cDNA合成试剂盒，使用寡核苷酸（dT）引物（Promega），然后使用1个外径CY3标记的随机九聚体引物（TriLink Biotechologies）和100 U Klenow片段3'>5'exo-（NEB）进行DNA标记每1.0μg双链cDNA。根据NimbleGen的用户表达分析指南，使用NimbleGen试剂进行单色杂交、杂交后清洗和扫描。图像是使用带有GenePix 6.0软件的GenePix4200A扫描仪采集的。使用NimbleScan 2.4（Roche NimbleGen）软件提取这些阵列的数据，并将其处理为PAIR文件。

我们使用两个单独的NimbleGen高密度阵列进行表达分析（设计名称=HG18 60 mer-expr 4plex和设计名称=MM8 60 mer-expr X4）。4丛阵列由4×72000个长寡核苷酸探针组成，长60个核苷酸。第一个是基于HG18，Build 36版本的NCBI智人基因目录，代表24000个蛋白质编码基因，每个目标有3个探针，1个重复，第二个是来自NCBI的MM8版本小家鼠基因目录，表示18869个蛋白编码基因，每个目标有3个探针，1个重复。

定量聚合酶链反应分析

使用Primer-Blast设计选定GPCR和酶的引物(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast网站). 在引物设计中使用小鼠基因作为模板，并使用小鼠或人类基因组筛选非特异性靶点。以这种方式确定合适的引物并进行商业生产（爱荷华州科拉维尔综合DNA技术公司）。将AtT20、BV-2、HEK293和N18细胞系生长在10 cm培养皿上，直至每个单层融合50-95%。按照制造商的方案（Cat#AM1710；Ambion Inc.Austin，Texas），使用逆转录试剂盒制备总RNA并进行逆转录。对每个品系的两微克总RNA进行逆转录，稀释样品，并使用Stratagene Mx3000P热循环器和Sybr Green/Low-Rox聚合酶混合物（马里兰州盖瑟斯堡Quanta Biosciences，分类号95056-100）进行qPCR。在N18的情况下，“无RT”对照显示出显著的基因组DNA污染。为了弥补这一点，用DNase 1处理此样品的总RNA 1小时，并在RT之前再次纯化。使用戊二醛-3-磷酸脱氢酶（GADPH）引物对每个细胞系进行内部控制，阈值周期设置为16。一旦设定了标准临界阈值（Ct），就可以确定每个细胞系内基因的相对表达水平。

数据库信息

所有数据均符合MIAME标准，并已存放在GEO（注册号GSE25901）中。

统计分析

对于微阵列数据的统计分析，我们首先将微阵列中的值转换为log2格式，以便于比较和数据表示[76]. 然后，我们获得了10-11种不太可能在这些细胞系中表达的精子蛋白的值。人源性HEK293细胞为：PYY2、PSP94、SPATA3、SPATA4、SPATA5、SPATA13、SPATS1、SPESP1、SPERT、ODF1和SPAM1。对于我们选择的三种小鼠细胞系：Svs2、Svs3、Svs5、Svs6、Svs7、Sva、Svp2、Sval1、Sval2、Sval3。我们平均了四个平板中每个蛋白的表达水平，以确定其表达的平均值和标准偏差。我们取这些平均值来表示零表达式。为了确定具有统计意义的表达，我们将每个培养皿中这些精液蛋白表达水平的平均值加上两个标准差。然后，我们从获得信号的每个受体和蛋白质的值中减去这个值。平均值加上两个标准偏差被视为我们感兴趣的蛋白质的基线，因为在此水平或更高的任何值都将被视为具有统计意义（95%的置信度，即精液蛋白表达的真实平均值将落在平均值加两个标准差的范围内）。因此，任何保留阳性表达值的蛋白质都被视为显著表达[76]. 所有图形和统计分析均使用GraphPad Prism 4.0软件（Hearne Scientific software，伊利诺伊州芝加哥）生成。