蛋白质网络预测与拓扑分析大型利什曼原虫作为药物靶点选择的工具

摘要

背景

利什曼病是一种致命的寄生虫感染，造成全球疾病负担。大多数治疗都有毒副作用，由于耐药菌株的出现，疗效有所下降。由于缺乏治疗这种疾病的有希望的药物靶点，前景更加恶化。我们采用了一种计算方法来检测新的药物靶点，这可能成为发现治疗这种热带疾病的新药的有效策略。

结果

我们预测了大型利什曼原虫使用三种经验证的方法：PSIMAP、PEIMAP和iPfam。结合这些方法的结果，我们计算了一个具有1366个节点和33861个交互的高置信网络（置信度>0.70）。通过对检测到的簇进行富集分析，我们能够预测263个相互作用蛋白的生物过程。利用连通性和介数中心性等指标分析网络拓扑结构，在与人类蛋白质组进行同源性过滤后，我们检测到142个潜在的药物靶点。可以做进一步的实验来验证这些目标。

结论

我们构建了第一个蛋白质相互作用网络大型利什曼原虫通过使用计算方法寄生。蛋白质网络的拓扑分析使我们能够识别出一组候选蛋白质，这些蛋白质可能（1）对寄生虫生存至关重要，（2）没有人类同源基因。这些潜在目标有望进行进一步的实验验证。这一战略如果得到验证，可能会以相对较低的额外时间和资源投资，增强针对这种疾病以及可能的其他热带疾病的既定药物发现方法。

背景

利什曼病是一种复杂的传染病，由多种利什曼原虫属，影响全球88个国家的200多万人。除了流行国家外，由于旅游业的发展，非流行国家的病例数量也在增加[1–5]. 这种寄生虫由该属的雌性昆虫传播到人类或动物的水库Lutzomyia Lutzomyia Lutzomyia Lutzomyia Lutzomyia Lutzomyia Lutzomyia Lutzomyia Lutzomyia Lutzomyia Lutzomyia Lutzomyia Lutzomyia Lutzomyia Lutzomyia在新世界和静脉瘤在旧世界[1]. 利什曼病有三种主要临床表现：皮肤、粘膜皮肤和内脏。内脏形态主要影响儿童，如果不及时提供适当的治疗，儿童可能会死亡。皮肤和粘膜皮肤形式可导致成年人严重残疾，影响农村地区的生产力。目前，尽管进行了多项研究，但仍没有这种疾病的可用疫苗[6]. 控制该病的主要措施依赖于化疗和病媒控制，这两者紧密相关，因为人类可能在某些流行地区充当寄生虫的蓄水池（人畜共患传播）。尽管采取了这些措施，但在许多流行国家，如哥伦比亚，病例数量仍在继续增加[7].

目前的抗利什曼原虫治疗因毒性、不同的敏感性而不成功利什曼原虫物种、宿主免疫反应的多样性以及所用药物的不同药代动力学。对所有形式的利什曼病的经典治疗方法是五价锑，其形式为锑葡糖酸钠（Pentostam，Glaxo-Smith Kline）或锑酸葡糖胺（Glucantime，Rhone Polenc）。这些化合物有严重的副作用，包括死亡[8,9]，目前在许多流行国家，对锑的耐药性不断增加是一个主要问题[2,10]. 一些药物，如戊脒和两性霉素B，也被用于治疗利什曼病。然而，副作用的存在、给药途径（注射而非药丸）、高昂的成本以及对不同临床形式疾病的疗效差异限制了它们作为首选药物的广泛使用。最近，一种最初作为抗肿瘤化合物开发的口服药物弥尔顿福星已成功用于治疗内脏和皮肤利什曼病[11,12]，但在中美洲和南美洲疗效不同[13]. 此外，在印度进行的一项IV期试验表明，米尔曲辛的复发率增加，表明耐药性可能迅速发展[14,15]. 由于所有这些原因，迫切需要新的、安全的、廉价的抗利什曼原虫化合物。

通过公私合作伙伴关系，针对发展中国家主要原虫寄生虫病——疟疾、利什曼病和锥虫病——的药物研发工作，重新激发了人们对开发新药物和疫苗的兴趣，这些药物和疫苗可供受影响的主要是穷人使用[16]. 药物发现过程始于寻找在感染性疾病情况下必须满足两个主要要求的药物靶点；（1） 对寄生虫的生存至关重要；（2）具有特异性，因为靶标在人类宿主中不应具有可能引起毒性作用的对应物。然而，对于重要性的最佳生物指标，还没有达成共识。表达水平和亚细胞定位等指标已被用于将蛋白质归类为可用药蛋白质。然而，这些假设往往不能解释这些蛋白质之间相互作用的潜在生物网络的复杂性[17].

已经开展了新的研究活动，以收集不同生物体的基因组序列以及高通量表达和蛋白质组数据。这是一个重要的生物信息来源，可以有效地用于为大量人类和兽医疾病寻找新药。生物信息学工具使研究人员能够提取和操作这些生物信息，以了解蛋白质功能。不幸的是，对天然形式蛋白质的功能的了解还没有为我们提供对细胞行为复杂性的理解，因此对重要性还没有一个明确的定义。细胞内的蛋白质通常不单独在其自然状态下发挥作用，而是通过与其他蛋白质协同作用，产生具有复杂结构的高维网络。由于蛋白质功能的网络性质，对蛋白质网络的拓扑分析可能有助于识别可能成为药物或疫苗靶点的基本蛋白质。用实验性蛋白质相互作用网络进行的最新研究蜡状酵母和秀丽隐杆线虫, [18,19]证实了拓扑度量在预测蛋白质重要性方面的有效性，并证明了与敲除和敲除数据的强相关性。这些研究还扩展到具有医学重要性的生物体，如原生动物寄生虫恶性疟原虫[20]为了发现新的药物和疫苗靶点。该数据可通过PlasmoID系统获得[21]. 拓扑分析在检测重要蛋白质方面也很有用，即使使用基于同源性的方法预测了蛋白质网络，例如人类相互作用组[22].

在这项工作中，我们预测了大型利什曼原虫通过三种方法使用蛋白质序列，即iPfam、PSIMAP和PEIMAP。我们使用连接性和中间性中心度指标分析预测的蛋白质网络，以识别基本蛋白质。分析蛋白质相互作用数据，以检测富含GO的簇，确定检测到的靶标的可能途径，并推断功能描述未知的蛋白质所执行的生物过程。假定的蛋白质靶点列表是实验验证的起点在体外检测和进一步发现新的抗利什曼病药物。

方法

利用PSIMAP、iPfam和PEIMAP预测蛋白质网络

使用先前设计并应用于米黄色单胞菌[23]使用三种不同的方法：PSIMAP、iPfam和PEIMAP。

PSIMAP公司

PSIMAP公司http://psimap.com/[24]通过使用已知PDB（蛋白质数据库）结构的相互作用域对推断蛋白质之间的相互作用。我们提取了大型利什曼原虫从GeneDB数据库ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/databases/L.major_sequences/DATASETS/LmjFwholegenome_20070731_V5.2.pep。我们使用PSI-BLAST对这些序列进行了比对[25]针对SCOP 1.71数据库[26]E值截止值为0.0001，如前所述[23]. 我们通过应用PSIMAP预测了3184个蛋白质的总共158984个相互作用[27]域对到域分配。该数据库中交互作用的最初定义基于蛋白质复合物结构域之间的原子距离。

iPfam公司

我们使用Pfam 18.0版本中的域分配分析了iPfam的交互[28]使用E值截止值为0.01的工具hmmpfam。通过将其与iPfam的Pfam域交互对集成[29]，共从2336个蛋白质构建了50398个预测的蛋白质相互作用利什曼原虫蛋白质。

PEIMAP公司

我们结盟了利什曼原虫PEIMAP数据库中的蛋白质http://peimap.kobic.re.kr使用BLASTP[25]具有40%的序列一致性和70%的长度覆盖率的最小截止值。PEIMAP数据库包括来自六个源数据库的蛋白质相互作用（PPI）信息：DIP、[30]绑定[31]国际法案[32]薄荷[33]HPRD、[34]和BioGrid[35]. 共提取14839个相互作用，涉及718个利什曼原虫蛋白质。

选择可靠的预测蛋白质相互作用

我们使用了“综合得分”方法，应用于[23]也用于STRING数据库[36]. 该方法考虑了每种方法（PEIMAP、PSIMAP和iPfam）的可靠性，假设它们之间独立。分数根据以下公式计算：

$$\mathrm{<trans\; data-src="s">秒</trans>}\mathrm{<trans\; data-src="c">c（c）</trans>}\mathrm{<trans\; data-src="o">o个</trans>}\mathrm{<trans\; data-src="r">第页</trans>}\mathrm{<trans\; data-src="e">e（电子）</trans>}<trans\; data-src="=">=</trans>\mathrm{<trans\; data-src="1">1</trans>}<trans\; data-src="-">-</trans>{\displaystyle \underset{\mathrm{<trans\; data-src="i">我</trans>}<trans\; data-src="\in ">\in </trans>\mathrm{<trans\; data-src="E">E类</trans>}}{<trans\; data-src="\prod ">\prod </trans>}{<trans\; data-src="(">(</trans>\mathrm{<trans\; data-src="1">1</trans>}<trans\; data-src="-">-</trans>{\mathrm{<trans\; data-src="R">R（右）</trans>}}_{\mathrm{<trans\; data-src="i">我</trans>}}<trans\; data-src=")">)</trans>}^{\mathrm{<trans\; data-src="n">n个</trans>}}}$$

在哪里？分数是信心得分，E类是一组正在分析的方法（PEIMAP、PSIMAP、iPfam）；R（右） _我 是方法的可靠性i、 n个是方法预测的交互次数我PEIMAP的可靠性得分来自以前报告的数据[37]这考虑了检测蛋白质相互作用的每种实验方法的可靠性。iPfam的可靠性得分是从iPfam数据库中两个Pfam域之间的得分中提取出来的。最后，PSIMAP的可靠性得分使用计算出的相互作用结构域之间的距离（SCOP）。

结合所有得分，最终得分进一步标准化为0.0-1.0。我们选择了1366利什曼原虫参与33861个高置信PPI的蛋白质，（置信度得分>0.7），结合使用的三种方法的结果（附加文件1利什曼原虫相互作用组的细胞景观网络）。为了评估度量结果的可信度，将聚类系数和平均最短路径与Cytoscape中使用随机网络插件生成的1000个随机网络进行了比较[38]，并计算经验p值。

拓扑计量法检测人体必需蛋白质及其与人类蛋白质组的同源性过滤

使用network Analyzer v.2.6.1计算蛋白质网络的幂律拟合[39]. 使用Hubba服务器，使用网络拓扑度量，如中间中心性、连接性和双重评分方案（DSS）来检测关键基因http://hub.iis.sinica.edu.tw/Hubba。此方法考虑加权边缘（置信度得分）。计算是在网络的最大组成部分上进行的，置信区间为0.7。选择此截止点是为了更好地将数据与网络的幂律分布拟合。通过丢弃来过滤检测到的目标利什曼原虫与人类蛋白质的同源物。

聚类和GO富集分析

我们对网络中最大的成分进行聚类分析，以检测蛋白质复合物和通路。我们使用了马尔可夫聚类（MCL）算法[40,41]，已被证明是检测蛋白质网络中簇的一种健壮且快速的算法[42]，使用NeAT工具中的实现[43]. 用于GeneDB数据库中功能未知的蛋白质http://www.genedb.org/主页/Lmajor，我们通过使用Cytoscape的BinGO插件评估GO富集分析的结果，预测了它们可能的生物学作用。

结果和讨论

我们结合PEIMAP、iPfam和PSIMAP生成的结果构建了一个蛋白质相互作用（PPI）图。尽管缺乏蛋白质相互作用数据大型利什曼原虫事实上，来自单个生物体的蛋白质相互作用数据可能包含一些误报，从而使结果产生偏差，使用来自不同物种的相互作用数据有助于减少预测网络中的噪声[44]. 与随机网络进行比较，并利用实验证据证实一些预测目标的重要性，这是验证计算的PPI图的间接方法。其他研究已经成功地将这种方法应用于使用计算方法来预测蛋白质网络（例如稻瘟病菌，结核分枝杆菌、和智人[45–47]. 预测的大型利什曼原虫interactiome可以作为未来实验PPI图的起点利什曼原虫尤其是考虑到许多相互作用可能需要在酵母中不发生的翻译后修饰[48]因此，很难在该生物体中进行酵母双杂交分析。整个预测网络包括3991个节点和190708个交互（包括自循环和重复边）。覆盖率的降低可能是由于在利什曼原虫只有18.0%的利什曼原虫蛋白质组在物种间是保守的（如CluSTr数据库中的定义：http://www.ebi.ac.uk/integr8/ClustrAnalysPageOnly.do？orgProteomeID（http://www.ebi.ac.uk/integr8/ClustrAnalysPageOnly.do？orgProteomeID）= 21780). 这是基于同源性的蛋白质网络预测方法的一个常见局限性。

有人提出生物网络遵循幂律分布，对应于无标度拓扑[49]. 这是生物网络的一个全局特性，当使用连通性和中间性中心性度量时，这对于可靠预测重要性非常重要。我们使用最小二乘法将节点度分布拟合到幂律，以确定我们的预测网络是否与无标度拓扑一致。这导致指数为-0.867（R²=0.556）。然而，计算出的置信网络0.70的分布显示R显著增加²系数为0.758，指数为-1.199。这个结果与幂律分布没有很好的相关性，可能是因为与整个交互组相比，子网络的分布程度不同。此外，还指出几何模型比幂律分布更适合[50,51]. 尽管有这些限制，我们还是选择了0.70置信区间，因为应用该区间生成的网络更适合无标度拓扑。这也使我们能够更有信心地宣称，检测到的集线器和瓶颈节点可能对网络至关重要。

确定假定药物靶点

一旦幂律分布得到部分确认，其他拓扑特征就可能具有生物学意义。考虑到这一点，我们进行了局部拓扑分析，以确定可能成为潜在药物靶点的中枢和瓶颈。我们计算了具有33861个交互作用的1366节点网络的连通性和中间中心性（>0.70置信度）。对于所有这些计算，我们使用了最大的分量，并从更大的原始网络中排除了孤立的分量，主要是因为计算通过特定节点的最短路径数的中间中心性可能会从孤立节点生成无限多的最短路径，这可能会使人困惑，并使解释更加困难。将网络的聚类系数和平均最短路径与1000个随机网络进行比较（表1). 我们发现，当将蛋白质网络的聚类系数与随机生成的网络的聚类系数值进行比较时，我们的蛋白质网络的连接程度更高。这些结果表明，我们的网络与其他生物网络一样具有模块化结构。这使我们更加确信这些簇可能与生物途径相关。平均最短路径也与随机网络有显著不同。

表1预测网络与随机网络的拓扑度量比较。

已经证明，连通性的度量[52]和介数中心性[53]改进蛋白质网络中基本蛋白质的识别[54]. 与连接性相比，中间性中心性与重要性更密切相关，暴露出通常属于支架蛋白或参与信号通路（称为瓶颈). 这一指标在网络药理学的新范式中也被提出，作为研究潜在药物靶点的一个良好特征[55]. 在利什曼原虫主要网络，我们选择连接排名前10%为轮毂节点和20%的中间中心性排序瓶颈，根据之前选择此类截止点的方法[54,56]. 此外，最近开发的工具HUBBA[57]提供了一种通过结合两个指标预测基本节点的替代方法：DMNC（最大邻域分量密度）和MNC（最大邻分量）。它们统称为双重评分方案（DSS）。我们将DSS系统应用于我们的高置信网络，目的是扩大潜在药物靶点的范围。我们选择了该工具确定的前10个蛋白质的截止值，因为该截止值确定了最有可能成为必需的组（接近100%）。然而，我们发现该组与检测到的集线器组重叠。

在第一次检测中，结合了连通性、中间中心性和DSS的结果，我们确定了384个潜在目标，如附加文件所示2：表S1。一旦检测到靶点，就需要在人类蛋白质组中检查其同源性，因为一些结合保守位点的药物会干扰相应的人类蛋白质，从而产生可能的毒性后果。利用列表利什曼原虫我们从TDR数据库中筛选出与人类蛋白质同源的靶点列表，删除那些与人类蛋白质具有同源性的靶点。TDR数据库中的正交对数检测是使用OrthoMCL算法进行的，与其他方法相比，该算法显示出高灵敏度[58]特征，这对于识别所有可能的人类直系亲属至关重要利什曼原虫蛋白质。一旦利什曼原虫-人类同源蛋白被排除在外，潜在靶蛋白的总数减少到142个（附加文件三：表S2）。目标的网络可视化如图所示1.

图1

细胞景观网络 大型利什曼原虫 相互作用组。用红色突出显示的节点是预测的基本节点，没有人类直系图

基因本体富集分析与功能预测

研究表明，检测生物网络中的模块化结构可以深入了解活生物体中细胞过程的功能组织[59]. 此外，人们已经认识到，聚类检测与功能富集分析相结合可以预测与聚类相关的蛋白质的生物功能[60]. 我们应用MCL算法在网络中生成簇，将膨胀值设置为1.8，并在计算中考虑边缘权重（置信度）。使用BinGO进行功能富集，导入大型利什曼原虫基因本体（GO）注释网址：http://geneontology.org。我们为网络生成了63个簇。对于每个簇，我们分配了最重要的GO生物过程。这些结果显示在附加文件中4：表S3。

蛋白质相互作用网络中的近邻经常参与类似的过程，研究表明，一个簇中70-80%的蛋白质至少共享一种功能。这意味着任何未分类的蛋白质都可以暂时指定其相邻的功能[60,61]. 我们发现GeneDB数据库中没有功能描述的263个蛋白质与定义明确的簇有关。我们根据特定GO富集簇的成员概率为这些蛋白质指定了一个生物过程。通过这种方法，我们预测了大型利什曼原虫使用当前注释过程之前未知的（附加文件5：表S4）。

最大的簇包含网络中15%的蛋白质。它们主要参与蛋白质氨基酸磷酸化（GO:0006468）（p值<0.000001）。在没有人类对应物的检测目标组中，我们发现64%的目标也在蛋白质氨基酸磷酸化过程中富集（图2，其他文件6：表S5），其次是参与核小体组装的蛋白质（GO:0006334）8%，核酸代谢过程（GO:00006139）4%，电子传递（GO:006118）4%，转运（GO:0008810）4%，蛋白质-氨基酸烷基化（GO:0006139）2%。其余蛋白质分布在各个过程中，每个过程中有一个蛋白质，并被分类为“其他”；这些蛋白质占靶蛋白的14%。该分析表明磷酸蛋白是表征和探索药物靶点的主要基团。参与核酸代谢的蛋白质也应作为可能的药物靶点进行研究，因为利什曼原虫没有酶机制来合成嘌呤从头开始[62]. 有趣的是，与核小体组装相关的蛋白质似乎是另一种选择。

图2

拓扑分析和通量平衡分析之间的对应关系。利什曼原虫主要交互组的部分表现。红色节点代表利什曼原虫代谢网络的双敲除预测。节点LmjF36.1360存在于双敲除对中，并且在蛋白质网络中也被预测为必需的。中间中心性允许检查冗余。

预测目标重要性的实验证据

如上所述，在必需基因组中有很大比例的磷酸蛋白。考虑到这些蛋白质是许多真核生物分化和细胞增殖的重要调节器，这是合理的。然而，有人指出利什曼原虫kinome与其他真核生物的kinome有特殊的区别（有关详细综述，请参阅参考文献[63]). 我们鉴定出91种激酶，这些激酶被预测为网络中的基本蛋白，与人类激酶组没有同源性。这是一组有趣的新的潜在靶点，用于在这种生物体中进行未来的药物筛选，可能是通过使用我们小组开发的方法学中的转染寄生虫[64]. 在这组激酶中，实验证明LMPK[GeneDB:LmjF36.6470]在墨西哥利什曼原虫[65]包含正交曲线亚马逊乳杆菌,L.少校,热带乳杆菌,埃及乳杆菌,donovani乳杆菌，婴儿乳杆菌、和巴西乳杆菌[66]. 鉴于这种蛋白在无鞭毛虫阶段的寄生虫增殖中的重要性，人们对其作为药物和疫苗候选物的兴趣日益浓厚。

之前的一项研究重建了大型利什曼原虫并进行通量平衡分析以预测潜在药物靶点[62]. 然而，当我们将通过建模发现的单个预测淘汰列表与使用拓扑方法导出的列表目标进行比较时，我们没有发现任何重叠。这可能是因为代谢网络通过其催化的代谢物而非直接相互作用连接蛋白质。然而，当我们分析双基因敲除列表时，我们发现蛋白质[GeneDB:LmjF36.1360]腺苷酸激酶被预测为我们的网络中必不可少的，并且也存在于代谢网络的双基因敲除了对[GeneDB：LmjF136.1360，LmjF25.2370]中。图中以红色突出显示三这意味着代谢网络中的冗余也可以通过计算蛋白质网络中的中间中心性来检测。该蛋白的抑制导致多诺瓦尼乳杆菌前鞭毛虫[67]同源性搜索在巴西乳杆菌、婴儿乳杆菌、布鲁西乳杆菌和克鲁兹乳杆菌,. 这将有利于开发一种治疗多种热带疾病的药物。此外，DrugBankhttp://www.drugbank.ca网站研究表明，药物吉西他滨也可能对该蛋白有抑制作用，这说明了该药物除了目前用于癌症之外，还可能用于治疗热带疾病。

图3

根据GO生物过程对必需基因进行分类磷蛋白在必需基因组中过度表达。（详见正文）。

[GeneDB:LmjF35.1180和GeneDB:LmjF 35.0830]是富马酸还原酶和富马酸类还原酶蛋白，在我们的网络中被预测为必不可少的。人类同源基因也没有。一些报告表明查尔酮等化合物[68]和极光[69]对这些酶有很强的抑制作用，使它们成为未来药物开发的有趣化合物。

三辆ABC运输车利什曼原虫特定的-[GeneDB:LmjF34.0670，GeneDB:LmjF27.0470，GeneData:LmjF32.2060]也被预测为必要的。它们通过将药物挤出细胞外，赋予抗锑和戊脒的能力。一些研究小组正在研究这种转运蛋白家族的抑制剂[70]目的是将耐药表型恢复为易感表型。根据我们的分析，我们还将这些蛋白质确定为假定的药物靶点，因为它们在寄生虫细胞内环境的内稳态中起着重要作用。

最后一个用实验数据证实我们的发现的例子是检测甾醇24-c-甲基转移酶[GeneDB:LmjF36.2390，GeneDB:LmjF136.2380]，它们在我们的网络中是必需的和唯一的。这些酶参与麦角甾醇的生物合成，麦角固醇是利什曼原虫真菌具有排他性和重要性。此外，最近的一项研究确定甲基转移酶是一种很有前景的药物靶点新生隐球菌[71]. 此外，这种酶最近被测试为内脏利什曼病的有效候选疫苗[72].

最后，我们观察了Leifso等人报道的微阵列数据中排他性预测靶标的表达水平[73]在无鞭毛期，我们没有发现预测的必需基因有任何显著的过度表达。这是可以预料的，因为在前鞭毛虫和无鞭毛虫阶段，很少有基因被上调或下调。这表明，在以下情况下，重要性与基因表达无关利什曼原虫鉴于蛋白质丰度的调节可能发生在转录后水平[73].

结论

这项工作是首次尝试探索蛋白质相互作用网络大型利什曼原虫利用寄生虫生物信息学方法。我们提供了基本蛋白质的假定列表；其中一些支持文献中报道的实验证据。特别令人感兴趣的是预测的基本激酶，它们构成利什曼原虫蛋白质的一个重要组，可以作为新药靶点的来源进行探索，因为它们对寄生虫的生存很重要，但与人类的基因体没有同源性。需要进一步的实验研究来确定特定的抑制剂。这些结果将有助于未来针对这种疾病的药物发现工作，使药物开发能够更及时、更具成本效益。