Necdin是一个p53靶基因，调节造血干/祖细胞的静止和对基因毒性应激的反应

造血干细胞（HSC）可以保持静止或进入细胞周期并自我更新或分化。¹ 造血干细胞很少分裂，长期以来人们认为整个造血干细胞池每隔几周就会翻转一次，造血干细胞定期进入和退出细胞周期。^1,2 这一范式受到了挑战，因为独立的研究小组已经确定了两个功能不同的HSC群体，即休眠HSC和激活HSC。^三,4 

HSC静止可能由HSC内在机制和BM微环境因素共同控制，这一过程涉及多个基因和信号通路。⁵ 细胞周期机制的几个调节器已被证明在造血干/祖细胞（HSPC）增殖中发挥关键调节作用，包括p21、p57、p18、D型细胞周期蛋白及其催化伙伴Cdk4和Cdk6。^6–10 HSC细胞的饮食决定也受多种转录因子（如Gfi-1、MEF/ELF4、Pbx-1、C-myc和N-myc）的调节。^11–14 有趣的是，最近的研究表明，肿瘤抑制基因，包括PTEN、pRb、PML、APC和Fbw7，也可能在维持HSC处于静止状态方面发挥关键作用。^15–19 除HSC内在机制外，HSC功能还受配体-受体相互作用调节，包括血管生成素和Tie-2、血小板生成素和c-Mpl、SCF和c-Kit、基质衍生因子1（也称为Cxcl12）和Cxcr4。^20–23 

最近，我们定义了p53在调节HSC静止中的关键作用，并确定necdin是一个p53靶基因，其启动子与p53结合并被p53反式激活。^24,25 Nectin是一种生长抑制蛋白，首次在有丝分裂后神经元中发现，²⁶ 编码necdin的基因是Prader-Willi综合征患者中缺失的几个基因之一。^27,28 与视网膜母细胞瘤蛋白一样，necdin与多种细胞周期促进蛋白相互作用，如猴病毒40大T抗原、腺病毒E1A和转录因子E2F1。^29,30 其功能作用通常是抑制这些蛋白质触发的细胞周期进程。

我们和其他人已经证明necdin在长期重建的HSC（LT-HSCs）中高度表达^24,31 虽然其在造血中的作用基本上是未知的，但我们已经证明，下调nectin可以减少HSC静止，上调nectin则可以增加HSC静止。²⁴ 为了更全面地定义necdin在造血中的作用，在本研究中，我们广泛分析了一种necdin-null小鼠的造血室，该小鼠在围产期死亡，具有与人类Prader-Willi综合征相似的特征。³² 我们发现，尽管necdin对胎儿造血是可有可无的，但它调节成年骨髓细胞中HSC的静止和对γ射线照射和化疗的敏感性。尽管necdin是p53的靶点，但它似乎既模仿又拮抗p53的功能。因此，necdin的功能与p53类似，在稳定状态下维持HSC的静止，但在基因毒性应激条件下，它反对p53依赖的凋亡。

之前已经描述过necdin-null小鼠（C57BL/6，CD45.2）的产生。³² 野生型C57BL/6（CD45.2）、B6.SJL（CD45.1）小鼠和p53-null小鼠（C57BL/6、CD45.2。将Necdin-null小鼠与p53缺失小鼠杂交，产生Necdin/p53双缺失小鼠；然而，没有观察到活的necdin/p53双缺失幼崽。因此，分离出野生型、necdin-null、p53-null和necdin/p53双空胎肝细胞用于移植。根据机构动物护理和使用委员会批准的协议，所有小鼠都被饲养在纪念斯隆-凯特琳癌症中心的动物设施中，并用过滤过的无菌空气保存在托伦斯顿单位。

从尾静脉采集外周血，并在自动血液计数器（HEMAVET HV950FS；Drew Scientific）上进行分析。

使用上述技术从胚胎第14.5天的胚胎中分离出胎肝细胞。胎儿肝细胞（1×10⁶)从野生型和necdin-null小鼠（CD45.2）移植到致死性辐射（9.5Gy）B6.SJL小鼠（CD44.1）。移植16周后，从重组小鼠中收获骨髓细胞并进行分析。对于系列重新填充分析，2×10⁶将BM细胞移植到致命照射的B6.SJL小鼠（CD45.1）中。该程序重复了两次。对于竞争性供体再填充分析，1×10⁶从野生型或非完整胚胎中分离的胎肝细胞（CD45.2）被移植到致死性照射的B6.SJL受体小鼠（CD45.1）中，数量相同（1×10⁶)或0.5×10⁶竞争对手胎肝细胞（CD45.1）。

用BD Biosciences的Abs谱系（Lin）鸡尾酒对胎肝或BM细胞进行染色（生物素化抗小鼠抗体，针对CD3ϵ、CD45R/B220、Gr-1和Ter119）；Mac1、Sca-1、c-Kit、CD34和FcγRII/III（BD Pharmingen）；CD48（电子生物科学）；和/或带有各种荧光共轭物的CD150（BioLegend）；和链霉亲和素APC-Cy7（BD-Pharmingen）。使用FACScan（BD Biosciences）、FACSCalibur（BD生物科学）、MoFlo（Cytomation）或LSRII（BD bioscience）流式细胞仪对染色细胞进行流式细胞术分析。对于外周血分析，用抗CD45.2 FITC、抗CD45.1 PE（BD Pharmingen）和其他抗体对红细胞进行裂解，并对PBMC进行染色。使用FITC-偶联的抗人Ki67抗体（BD Pharmingen）和BD Biosciences的固定和渗透溶液对Ki67进行核染色。对于凋亡检测，在细胞表面标记物染色后，用抗膜联蛋白V FITC或PE（BD Pharmingen）对细胞进行染色，并用MoFlo（Cytomation）或LSRII（BD Biosciences）流式细胞仪用DAPI进行分析。

在甲基纤维素培养基（MethoCult GF M3434；StemCell Technologies）中使用2×10⁴胎肝细胞或骨髓单个核细胞/孔（6孔板）。在初始培养7天后对菌落进行计数，收集所有细胞并在PBS中清洗两次。然后在2×10培养基中培养细胞⁴同一介质中的每口井。每7天重复一次菌落记分和重放，共至少重复4次，或直到培养物中未观察到菌落为止。

对于长期培养起始细胞测定，5×10²林⁻Sca1类⁺Mac1电脑⁺胎肝细胞在MS5基质细胞上培养。每周半补充培养基4周后，收集细胞并将其置于甲基纤维素培养基上（MethoCult GF M3434；StemCell Technologies）。10天后用2×10测定克隆祖细胞⁴每个孔的细胞数（6孔板）。对菌落进行评分，并以每5×10个CFU的数量表示²林⁻Sca1类⁺Mac1电脑⁺细胞。

小鼠腹腔注射3 mg溴脱氧尿苷（BrdU），并将1 mg/mL的BrdU添加到饮用水中。48小时后，分离BM细胞并对其进行染色，以进行细胞表面标记表达，然后使用APC BrdU Flow Kit（BD Pharmingen）和固定和渗透溶液对BrdU进行核染色。CD48中检测到BrdU掺入⁻CD150型⁺林⁻Sca1型⁺c试剂盒⁺带有LSRII流式细胞仪（BD Biosciences）的（LSK）细胞。

分别在受照和未受照小鼠中分析野生型或未受照胎儿肝细胞的归巢和倒伏能力。野生型或非完整型胎肝（5×10⁶; 将CD45.2）细胞注射到致死性照射或未照射受体（CD45.1）小鼠体内。注射后18小时采集BM细胞，流式细胞仪检测供体来源细胞为CD45.2⁺细胞，同时识别Lin⁻Sca1类⁺Mac1电脑⁺细胞。

移植后4个月，我们对用野生型或必需的胎肝细胞重建的小鼠进行单剂量5-氟尿嘧啶（5-FU；200 mg/kg腹腔注射）或每周5-FU（初始剂量为125 mg/kg腹腔内注射，然后90 mg/kg腹腔接种）或6.5或8 Gy的照射。

如前所述进行基因表达分析，³⁰ 使用从野生型或非野生型HSPC（Lin⁻Sca1类⁺c试剂盒⁺)寡核苷酸阵列（Affymetrix）和定量PCR中的细胞。如有要求，可提供所有PCR引物对的DNA序列。Affymetrix数据使用Ingenuity Pathways Analysis程序（Ingenuiity Systems，网址：www.intenuity.com). 分析中考虑了符合<2倍变化截止值的路径，以及与灵巧路径知识库中的典型路径相关的路径。数据集和已确定的标准路径之间的关联重要性通过两种方式进行测量：（1）映射到路径的数据集中的基因数除以映射到标准路径的数据集中的基因总数的比率；和（2）Fisher精确测试，以计算P（P）决定数据集中的基因和规范途径之间的关联仅通过偶然性来解释的概率的值。所有基因表达数据均已保存在gene expression Omnibus公共数据库中，注册号为。GSE39153标准.

使用Amaxa小鼠巨噬细胞核因子试剂盒（Lonza）对来自BM细胞的LSK细胞进行核感染，程序为Y-01和100 pmol siRNA。然后在无血清培养基（X-VIVO 15；Lonza）中培养细胞，并加入细胞因子（SCF，100 ng/mL；血小板生成素，100 ng/mL；Flt 3配体，100 ng/mL）。细胞核感染后24小时，用流式细胞仪对细胞进行分析。siRNA库购自Dharmacon。

将编码Gas2L3（开放生物系统）的cDNA亚克隆到MigR1逆转录病毒载体的BglII和HpaI位点。BM细胞中的LSK细胞经棘球感染3天并用于分析。

表达针对Gas2L3的shRNA或克隆到pGIPZ载体中的对照shRNA的慢病毒从Open Biosystems购买。通过转染293T细胞产生慢病毒载体。在含有10 ng/mL IL-3、10 ng/mL IL-6和100 ng/mL SCF（PeproTech）的X-VIVO 15培养基中培养24小时后，来自野生型或neckin-null小鼠（CD45.2）的胎肝细胞被含有8μg/mL聚brene（Sigma-Aldrich）的高滴度慢病毒浓缩悬浮液感染。72小时后，使用LSRII流式细胞仪（BD Biosciences）对绿色荧光蛋白阳性细胞进行分类，并用作转导细胞。用9.5 Gy对B6.SJL（CD45.1）受体小鼠进行致死性照射，并将转导的胎肝细胞用5×10⁵辅助细胞（CD45.2）。在确认供体完全再生后，对这些小鼠进行分析，以评估移植后10-12周的成年造血。

学生分析了统计显著性t吨测试（2组）和单因素方差分析，以Tukey多重比较测试作为后测（2组以上）。

我们最近通过几种体外干细胞实验证明necdin是HSC静止的调节器。²⁴ 为了进一步明确necdin在造血中的作用，在本研究中，我们分析了necdin-null小鼠的造血室。Nectin是一种母体印记基因，因此仅由父系等位基因表达。尽管遗传了突变的母体等位基因的杂合小鼠与野生型同卵小鼠难以区分，但携带父系遗传基因的小鼠却被删除了钕等位基因显示出生后早期死亡。³² 因此，我们首先研究了necdin在胎儿造血中的作用，从胚胎第14.5天的胚胎中分离胎儿肝脏并检测其造血细胞含量。

我们发现，与野生型胎肝相比，非完整胎肝的细胞数没有变化（补充图1A，见血液网站；参见在线文章顶部的补充材料链接），并使用SLAM家族受体CD150和CD48来表征免疫表型HSC，³³ 我们在非完整型和野生型胎儿肝脏中发现了相似数量的HSC(图1A） ●●●●。尽管数量相等，但必需的胎儿肝HSC（定义为Lin⁻Sca1类⁺Mac1电脑⁺CD48型⁻CD150型⁺细胞）在甲基纤维素检测中显示出增加的连续替换，并且在基于基质的长期培养起始细胞检测中保持干细胞比野生型胎儿肝HSC更好(图1B-C）。然后，我们使用增殖标记Ki67和Hoechst 33342 DNA染色检查了无necdin HSC的细胞周期状态，发现野生型和无necdin的胎肝HSC都具有高度增殖性，两者都显示约15%的静止细胞(图1D） 。尽管necdin已被证明能抑制p53介导的U2OS细胞凋亡，²⁹ 我们还发现正常数量的凋亡细胞（膜联蛋白V⁺/DAPI公司⁻)稳定状态下正常胎儿肝脏中的HSC(图1E） ●●●●。

当我们检查非完整HSC的分化能力时，根据体内CFU脾脏分析，我们发现正常的髓系分化(图1F） 以及普通髓系祖细胞、粒细胞-单核细胞祖细胞和巨核细胞-红细胞祖细胞的可比频率（补充图1B）。因此，尽管necdin的丢失会影响胎儿肝HSC体外自我更新，但似乎不会影响体内HSC频率或其分化、增殖或存活。

为了确定necdin在成人造血中的作用，我们将necdin-null胎肝细胞移植到致死性照射的受体小鼠中。在长期重建后，我们在体内检测了成人HSC的功能，从而使用BM微环境由遗传正常细胞组成的模型。尽管非完整胎肝干细胞在体外表现出更强的连续移植能力，并在长期基质培养中改善了“干细胞”的维持，但非完整胎肝脏干细胞在胎肝细胞移植后对受到致命照射的受体小鼠进行再繁殖的能力是正常的(图2A） 基于长期多谱系重建的相似程度和供体来源CD48的正常频率⁻CD150型⁺LSK细胞、普通髓系祖细胞、粒细胞-单核细胞祖细胞和巨核细胞-红细胞祖细胞(图2B-D）。因此，重新植入非完整胎肝细胞的野生型小鼠具有正常、成年、稳态（非完整）造血功能。

为了进一步研究necdin的缺乏如何影响成人HSC行为，我们进行了体外（连续再植）和体内（连续骨髓移植和竞争性再植）功能测定。在CFU分析中，缺乏necdin的成人原始造血祖细胞的连续替换增加(图3A） 这与我们之前的发现一致。²⁴ 

necdin的缺失在体外保持了干细胞或祖细胞室中的干性。为了更正式地研究necdin在调节成人HSC自我更新中的作用，我们使用来自野生型或necdin-null胎肝细胞的成人BM细胞进行了系列移植分析。在无限制的一次、二次或三次移植试验中，我们观察到非完整BM细胞对致命照射受体小鼠的再繁殖能力没有差异(图3B） ●●●●。我们还进行了竞争性再种群分析，移植1×10⁶从野生型或非完整胚胎中分离出的胎肝细胞进入致命照射的B6.SJL受体小鼠，数量相同（1×10⁶)竞争性胎肝细胞，并观察到使用野生型或necdin-null细胞的供体再填充没有差异(图3C） 。

我们还检测了BM环境中必需的成年HSC的凋亡和归巢（或倒伏），发现凋亡百分比（膜联蛋白V⁺/DAPI公司⁻)用非完整或野生型胎肝细胞重新填充受体小鼠的HSC(图3D） 。我们也没有观察到缺乏necdin对热休克蛋白细胞分别归巢或倒伏到受照和未受照宿主骨髓中的影响(图3E-F）。因此，必要的成年HSC在移植应激下保持正常的自我更新潜能。

下调野生型小鼠BM HSPC中necdin的表达（使用RNAi）导致静息期减少，这表明necdin可能在调节成年HSC静息期中发挥重要作用。²⁴ 因此，我们将野生型或非完整胎肝细胞移植到受致命辐射的受体小鼠中，并在移植16周后检查供体衍生HSC的细胞周期状态。我们对necdin缺失的HSC进行增殖标记物Ki67染色，检测到Ki67阴性的HSC和LSK细胞比正常细胞少得多，表明静止的HSC较少；72.9%的野生型CD48⁻CD150型⁺LSK细胞位于G₀而非完整CD48的48.6%⁻CD150型⁺LSK细胞(P（P）= .0025,图4A和补充图2A）。此外，为了确定体内非完整HSC的增殖率，我们给小鼠口服BrdU 48小时，并分离CD48⁻CD150型⁺来自BM的LSK细胞；必需完整CD48的38.9%⁻CD150型⁺LSK细胞变成BrdU⁺与野生型CD48的14.8%相比⁻CD150型⁺LSK细胞(P（P）= .0007,图4B） 表明necdin促进HSC静止，如果没有necdin，HSC更容易进入细胞周期。

鉴于necdin对p53功能的已知影响以及p53在HSC自我更新和静止中的作用，我们将necdin-null小鼠与p53-null鼠杂交，然后分离出野生型、necdin-null、p53-nulel和necdin/p53双空胎肝细胞，以移植到致死性照射受者体内。我们分析了这些小鼠HSC的细胞周期状态，发现necdin独立于p53调节HSC的静止，因为用necdin-null或necdin/p53双失活胎肝细胞重建的小鼠HSC显示出类似的静止减少(图4C） ●●●●。因此，尽管necdin在p53下游发挥作用，但在p53缺失的情况下可以观察到其在静止中的作用，这表明它在HSC生物学中具有独特的作用。

鉴于静止状态对细胞对基因毒性应激的敏感性的已知影响，我们假设非完整HSC增强的增殖潜力可能使细胞对化疗敏感。事实上，使用重新填充了非完整HSC的小鼠，我们发现每周给药5-FU的敏感性显著增强(图5A） ：只有20%的necdin-null小鼠存活4周5-FU给药，而70%的野生型小鼠存活。我们还跟踪了单剂量5-FU后的外周血计数，发现用必需的HSC重建的小鼠比野生型HSC的骨髓抑制时间更长(图5B） ●●●●。虽然预处理的BM相似，但“necdin-null”小鼠的BM显示出造血细胞缺乏，野生型BM在5-FU给药后第14天显示出造血恢复的迹象(图5C） ●●●●。与这些数据一致，单剂量5-FU在necdin-null HSC中引发更大的细胞凋亡（CD48⁻CD150型⁺LSK细胞）比正常HSC(图5D） ●●●●。

即使在5-FU给药4天后，必需的全部HSC与野生型HSC合并了相同数量的BrdU，但5-FU治疗后的恢复延迟(图5E） ，这意味着5-FU给药后，野生型和necdin-null HSC区室中的循环细胞数量增加，循环的野生型HSC增加更多（因为它们在稳态下更静止），或者在5-FU给药后，necdin-null HSPCs在稳态下的静止减少得到了挽救。同样，necdin-null小鼠有相同数量的HSC（CD48⁻CD150型⁺LSK细胞）在5-FU给药4天后作为野生型小鼠（补充图3）。因此，5-FU给药后，necdin-null小鼠的延迟恢复似乎是由于化疗敏感性增加，而不是增殖缺陷。

用必需的完整HSC重建的小鼠对6.5和8 Gy剂量的单次亚致死剂量全身照射也表现出更高的敏感性(图6A-B）。利用组蛋白H2AX（γ-H2AX）磷酸化作为DNA损伤的指标，³⁴ 我们观察到γ-H2AX的数量没有差异⁺照射后的野生型或necdin-null HSC（6.5Gy；补充图4A）。尽管如此，我们发现辐射诱导的nectin-null HSC（CD48）凋亡增加了2倍⁻CD150型⁺LSK细胞）比野生型HSC(图6C） 表明其对辐照的敏感性增强。为了确定这种敏感性在多大程度上反映了静止状态的降低，我们用G-CSF（每天200μG/kg，连续5天）治疗小鼠，使HSC（CD48）的频率相等⁻CD150型⁺LSK细胞）和静止HSC在野生型和非完整BM隔间(图6D和补充图4B）。然而，当我们照射这些小鼠时，我们仍然发现在非完整HSC（CD48）中细胞凋亡增强⁻CD150型⁺LSK细胞）(图6E） ●●●●。因此，necdin通过细胞周期依赖性和细胞周期非依赖性机制影响HSC对细胞毒性应激的反应。

necdin对p53功能的影响似乎与细胞环境有关；nectin已被证明抑制p53诱导的U2OS细胞凋亡，但促进p53依赖性G₁SAOS-2细胞中的阻滞。^29,30 我们假设，基因毒性应激后非完整HSC的凋亡增强是p53依赖性的。用野生型、necdin-null、p53-null或necdin/p53双失活胎肝细胞重组小鼠进行照射后，我们发现necdin-null HSC（CD48⁻CD150型⁺LSK细胞），p53阴性HSC中的凋亡减少。necdin/p53双阴性HSC显示中等水平的凋亡，这意味着necdin抑制辐射诱导的HSC凋亡的一些能力依赖于p53(图6F） ●●●●。这可能反映了p53调节HSC静止的necdin非依赖性能力(图4C和6F） ●●●●。

为了研究necdin如何调节HSC对基因毒性应激的反应，我们检测了几个凋亡相关HSPC基因的表达，包括bcl-1型,bcl-xL公司、和mcl-1型^35,36 ; 这些基因在照射后野生型和非完整型HSPC中的表达相似，除了彪马，一个促凋亡的p53靶基因，³⁷ 这实际上在辐照的非完整HSPC中更低（数据未显示）。因此，为了确定可解释necdin-null HSC放射敏感性增强的necdin靶基因，我们对亚致死剂量（6.5 Gy）照射后用野生型或necdin-null胎肝细胞重建的小鼠分离的LSK细胞进行了基因表达谱分析（使用微阵列和定量PCR分析）。我们在非完整HSPC中发现了几种解除调控的信号通路，包括G₂/M DNA损伤和G₁/S检查点（补充图5）。necdin-null细胞与野生型细胞中差异表达的假定necdin靶基因(图7A） ，一个基因，气体2L3，引起了我们的注意。

Gas2L3是Gas2的同源物，Gas2是一种caspase-3底物，在细胞凋亡过程中调节微丝和细胞形状变化。^38,39 研究表明，p53依赖性凋亡的敏感性与Gas2蛋白水平的增加有关，这可能是因为p53稳定性和转录活性的增强。^38,40 对Gas2L3的生物功能知之甚少，⁴¹ 因此，我们首先通过定量PCR分析证实其在非完整HSPC中辐射诱导上调(图7B） ●●●●。我们假设，受照necdin-null HSC中Gas2L3的上调可能是其辐射敏感性增强的原因，事实上，我们发现有效下调Gas2L3表达可降低necdin-null LSK细胞的辐射敏感性(图7C） ●●●●。我们还在野生型LSK细胞中过度表达Gas2L3，并发现它增加了细胞凋亡(图7D） ●●●●。

我们进一步分析了Gas2L3击倒HSC的体内辐射敏感性。表达2个shRNAs的慢病毒气体2L3或对照shRNA被转导到野生型或非完整胎肝细胞。我们验证了这些转导细胞中Gas2L3表达水平约为正常值的30%（补充图6）。随后，将转导的胎肝细胞分选并与辅助细胞一起移植到致命照射的受体中。移植后10至12周，我们证实这些受体的供体完全重新繁殖，并分析了绿色荧光蛋白阳性HSC（CD48）中辐射诱导的凋亡⁻CD150型⁺全身照射6.5 Gy后12小时的LSK人群(图7E） ●●●●。与体外细胞凋亡检测类似，Gas2L3敲低的HSC在照射后凋亡较少。此外，敲低necdin-null HSC中的Gas2L3对照射后细胞凋亡的影响与正常HSC中的作用相同。因此，Gas2L3在受照非完整HSC中的上调可能是其辐射敏感性增强的原因。

由于Gas2L3表达增加会增强HSPC的辐射敏感性，这表明necdin通过下调Gas2L4表达来调节HSPC的放射敏感性。此外，尽管Gas2L3在CD48中高度表达⁻CD150型⁺LSK和CD34⁺LSK野生型细胞处于稳定状态，照射后Gas2L3表达降低(图7F） 这表明细胞可能会降低Gas2L3的表达以生存γ射线照射的影响。

此前已确定necdin是HSC静止的潜在调节器，²⁴ 在本研究中，我们使用缺乏necdin表达的转基因小鼠来证实necdin在稳定状态下控制HSC静止。necdin对HSC静止的影响大于p53的影响，事实上，necdin对于静止的影响并不依赖于p53。这表明，不涉及p53或p21的其他途径集中于HSC的这一关键特性。尽管对静止有这种影响，但我们没有发现HSC和髓系祖细胞的数量或频率发生变化(图2以及未显示的数据），表明可能发生了一些补偿，以防止necdin的缺乏影响其他HSC功能。

在本研究中，我们发现necdin在HSC对基因毒性应激的反应中具有深刻的细胞周期无关效应，并确定了necdin对细胞周期的影响与其对放射和化疗诱导的凋亡的影响的不同介体。necdin的缺失似乎不会影响胎儿肝HSC的频率或分化潜力。虽然我们确实看到体外自我更新能力增加，但necdin显然对胎儿造血是不必要的，正如Kubota等人最近使用的另一种无围产期致死能力的necdin-null小鼠所示。⁴² 鉴于necdin-null小鼠的围产期致死性，为了研究necdin在成人造血中的作用，我们必须将necdin-null胎儿肝细胞移植到致死性照射的野生型受体小鼠中。在移植试验中，坏死-完整的胎肝造血干细胞可以正常地重新繁殖致死性照射的受体小鼠，这表明即使在移植应激下，Necdin对成年造血干细胞的正常自我更新也是不必要的。通过检查用非完整胎肝HSC重建的小鼠，我们观察到，与p53类似，非完整胎肝脏HSC有助于促进成年HSC在稳定状态下的静止。尽管HSC静止有助于保持自我更新能力，⁴³ 我们对necdin/p53双失活HSC的分析表明，necdin对HSC静止的影响是通过一种独特的途径介导的。

众所周知，HSC静止状态的改变会转化为化疗耐药和放疗耐药的相互变化，^13,24 事实上，我们发现HSC中缺乏necdin会使其对遗传毒性应激敏感（5-FU和亚致死剂量的γ射线照射）。然而，necdin具有静息依赖性效应，调节HSC对辐射的反应；尽管G-CSF刺激使非完整HSC的细胞周期正常化，但这些HSC在照射后仍表现出更强的凋亡(图6D-E）。necdin抑制p53依赖性辐射诱导的LT-HSCs凋亡的能力令人想起鼻塞，另一个可以拮抗p53介导的造血祖细胞凋亡的p53靶基因。³⁷ 

Gas2L3是一种683氨基酸蛋白，具有钙调素同源性和Gas2同源结构域，其功能最近才有报道：Gas2L4是正常胞质分裂和维持基因组稳定性所必需的。⁴¹ 我们在此表明，HSC中Gas2L3水平的变化在necdin调控凋亡中起着重要作用(图7C-E）。因此，necdin似乎以依赖于Gas2L3的方式调节HSC辐射敏感性。necdin的缺失如何导致受照但非稳态HSC中Gas2L3表达增强尚不清楚。然而，许多基因或信号通路的表达变化可能解释了非完整HSC对基因毒性应激的增强反应。

我们在本文中确定的necdin在成人造血中的作用与Kubota等人最近报道的不同。⁴² 这些研究人员发现necdin缺乏对HSC（定义为CD34）没有影响^−/低LSK细胞）静止或自我更新，其necdin-null小鼠对每周5-FU治疗具有耐药性，并且necdin-null LSK细胞在骨髓抑制后更具增殖性。⁴² 在我们的研究中，我们主要将HSC定义为CD48⁻CD150型⁺LSK细胞，比LSK细胞或CD34更纯的LT-HSC群体^−/低LSK细胞，^44,45 用于分析静止和对遗传毒性应激的反应。因此，我们的结果可以提供对necdin HSC内在功能的理解。此外，在我们的研究中，necdin-null HSC位于其他正常宿主中，消除了缺乏necdin的任何微环境影响。小鼠遗传背景的差异也可以解释所观察到的一些差异。Kubota等人研究的necdin-null小鼠（Ndn tm1Ky）在ICR背景下回交到C57BL6背景下5代。这些差异显然很重要，因为他们研究的非完整小鼠没有显示出生后的致死性，因此可以对非完整小鼠的骨髓细胞进行分析。我们分析的小鼠更接近人类Prader-Willi综合征，表现出类似的呼吸困难。⁴⁶ 我们目前的研究发现，necdin对HSC静止的影响清楚地表明了其干细胞固有的功能。这是相关的，因为BM微环境中视网膜母细胞瘤蛋白的失活会导致严重的骨髓增生，而骨髓增生不是HSC固有的，而是HSC和干细胞生态位之间视网膜母细胞癌蛋白依赖性相互作用的结果。⁴⁷ 

由于necdin-null HSC的静止性低于野生型HSC，并且用necdin-null HSC重新填充的野生型小鼠对化疗和辐射的敏感性增强，靶向necdin可能提供一种消除静止白血病起始细胞的治疗方法。

作者感谢斯隆-凯特琳纪念癌症中心流式细胞术、小鼠基因分型、分子细胞学和基因组学核心设施的工作人员的支持；Nimer实验室成员提供有用的意见；和Erica Chuang女士帮助准备手稿。

这项工作由美国国立卫生研究院（RO1向S.D.N.拨款DK52208）和白血病与淋巴瘤学会（专门研究中心[SCOR]向S.D.N拨款）资助。

美国国立卫生研究院

贡献：T.A.、Y.L和S.D.N.设计了这项研究；T.A.、Y.L.、S.D.G.、N.B.、D.N.-L.、A.D.和S.M.进行了研究；Y.A.和B.R.进行了生物信息学分析；R.W.提供了动物模型；T.A.和Y.L.分析了数据；T.A.、Y.L.和S.D.N.撰写了手稿。

利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。

通讯员：史蒂芬·D·尼默，迈阿密大学米勒医学院西尔维斯特综合癌症中心，地址：1550 NW 10th Ave，Fox 200，Miami，FL 33136；电子邮件：snimer@med.miami.edu.