化疗后趋化因子Mig的活化表达有助于化疗诱导的骨髓抑制和致死毒性

血液来源于骨髓（BM），造血干细胞（HSC）和造血祖细胞（HPCs）位于骨髓中。造血过程受到几个正负信号的严密调控。^1,2 在不同类型的血细胞中，白细胞特别容易受到插入剂的影响，并且由于其增殖活性和不断更新，它们的寿命相当有限。它们必须不断从造血细胞中补充，由于治疗性细胞毒素直接攻击这些细胞，骨髓对化疗非常敏感。^三,4 如果化疗药物对BM细胞的直接细胞毒性是BM抑制的唯一原因，那么不伴随BM毒性的化疗是不可能的。相反，如果不仅骨髓毒性本身，而且骨髓基因表达中化疗相关的变化都有助于骨髓抑制，那么骨髓可以通过抑制表达的抑制性骨髓基因来挽救。

化疗诱导的骨髓抑制和再生具有几个标准特征。在正常小鼠中，有限剂量范围的5-氟尿嘧啶（5-FU）会导致骨髓细胞减少，大约在给药后第7天达到最小值，并在5-FU治疗2周后恢复到预处理水平。^5,6 正如预期的那样，骨髓细胞数与5-FU剂量呈负相关：剂量越高，骨髓细胞率越低。然而，骨髓细胞达到最小值和恢复所需的时间相当恒定，且与剂量无关。这表明化疗后的骨髓抑制可能不仅仅基于直接的细胞毒性，还可能受到其他因素的影响，如抑制成分的表达。

越来越多的证据表明，趋化因子不仅对白细胞的迁移和增殖很重要，而且还参与组织修复、肿瘤进展和造血。迄今为止，已有20多种趋化因子对HPC的增殖表现出抑制作用。⁷ 其中一种趋化因子，巨噬细胞炎性蛋白1α（MIP-1α），已被证明通过加速接受化疗药物治疗的小鼠中性粒细胞的恢复而具有化学保护作用，但它并没有保护HPC或提高克隆形成能力。⁸ 这可能归因于HPC的成熟阶段，因为MIP-1α最好靶向相当成熟的HPC，而不是最原始的HPC。⁹ 此外，MIP-1α试验的临床结果并不令人满意。¹⁰ 化疗诱导了哪些趋化因子，以及它们的表达如何调节骨髓对抗癌药物的反应，目前尚不清楚。

基于对接受5-FU化疗的小鼠BM细胞的转录组分析，我们发现Mig及其受体CXCR3的表达极度上调。Mig是一种CXC-趋化因子（CXCL9），与IP-10（IFN-γ-诱导蛋白，也称为CXCL10）和I-TAC（IFN-β-诱导T细胞α趋化剂，也称为CX311）共享受体CXCR3。^11,12 近年来，人们主要研究了米格在自身免疫性疾病、血管抑制和免疫调节中的作用。^13-15 小鼠Mig（MuMig）和人类Mig（HuMig）的一级蛋白序列高度保守，序列同源性为74%。¹⁶ 受体CXCR3的序列同源性也很高，同源性为86%。^17,18 重组HuMig降低了体外已承诺和原始人类HPC的数量，以及体内小鼠HPC的绝对数量和循环状态。¹⁹ 有趣的是，Mig基因敲除小鼠的外周血白细胞和差异计数正常，²⁰ 并且CXCR3敲除小鼠在外观和生长方面都是正常的。²¹ 与其他具有骨髓抑制特性的趋化因子相比，Mig在稳定和应激状态下调节造血的生理和病理作用尚不清楚。在此，我们进行了一系列体外和体内实验，以证明Mig调节HPC增殖的直接和间接方式，并概述了抗Mig抗体在减轻或改善化疗诱导的BM细胞毒性方面的潜在应用。

Affymetrix开发的基因芯片方法用于监测单次注射5-FU诱导的小鼠骨髓再生过程中的全局基因表达。总共，从5-FU治疗后第0、3、7、11和14天收集的BM细胞中提取了5个RNA样本。每个时间点使用5到20只小鼠，以获得足够数量的细胞用于RNA提取。使用来自每个样品的等量poly（A）RNA合成双链cDNA。使用等量的cDNA通过体外转录制备五个cRNA样品。这些样品用于在含有34 323个证实良好的小鼠基因的小鼠基因组表达寡核苷酸阵列（GeneChip mouse expression Set 430；Affymetrix）中进行杂交。杂交强度信息由基因芯片扫描仪3000收集，并使用Affymetrix微阵列套件5.1版进行分析。对所有进行的阵列使用全局缩放策略，将阵列的平均信号强度设置为目标信号500。使用第0天BM阵列作为基线，计算每个时间点的表达数据的比较分析。

使用商业重组Mig（PeproTech）进行体外实验。在体内实验中，rMuMig是内部生产的。rMuMig在大肠杆菌表达系统，然后使用前面描述的LAL方法（厦门后世纪）纯化至纯度大于99%，内毒素小于1 EU/μg。²² 

用rMuMig免疫Wistar大鼠（SLACCAS）产生抗-Mig多克隆抗体。简言之，将300μg rMuMig与等量的弗氏完全佐剂（Bio-Basic）混合。将混合物皮下注射到3只大鼠体内。首次注射后21天，通过每周重新给药一次混合物来增强大鼠的力量，持续3周。最后一次增强后2周，从动物身上采集抗-Mig血清。使用相同的方案从用PBS免疫的大鼠中收集对照血清。抗rMuMig多克隆抗体在1:1000至1:10000的稀释度下与rMuMik特异有效地相互作用（补充图1，可在血液网站；请参阅在线文章顶部的补充材料链接）。

如前所述，CXCR3 KO小鼠系由C57BL/6小鼠通过基因靶向培养而成，²¹ 由Bao Lu博士（马萨诸塞州波士顿哈佛医学院）提供。CXCR3^–/–和C57BL/6背景野生型（WT）小鼠（SLACACAS）在通风笼式系统中保持在无致病条件下。经上海交通大学药学院动物护理与使用委员会授权，在8-10周龄小鼠上进行动物实验。小鼠皮下注射50μL的rMuMig。皮下注射1微升对照大鼠血清或稀释在10μL PBS中的抗Mig大鼠血清。静脉注射5-FU（尾静脉）。

通过逆行穿刺获得小鼠外周血（PB）样本。在1000下离心10分钟后等分血浆克.将等分样品立即在−20°C下冷冻。ELISA按照制造商的说明进行（定量因子免疫分析；研发系统）。

用含2%FCS的10 mL PBS冲洗每只小鼠股骨和胫骨的骨髓细胞。1000离心后克将细胞颗粒重新悬浮在5 mL PBS中10分钟。用3%乙酸在PBS溶液中以1:10的稀释度溶解红细胞（RBC）后，用血细胞仪计数BM有核细胞的总数。使用自动血液分析仪MEK-6318K（Nihon Kohden）确认骨髓数。

对于集落分析，用Ficoll从骨髓中分离出有核细胞，并将适当数量的有核细胞接种到1.2%甲基纤维素培养基中，该培养基补充有30%胎牛血清和细胞因子（10 ng/mL人[h]EPO，取自麒麟坤鹏；10 ng/mL小鼠[m]SCF，mIL-3，mIL-6，取自PeproTech；20 ng/mL hG-CSF，取自3SBio）。细胞在37°C的加湿条件下培养7天。如前所述，使用倒置显微镜对由50多个细胞组成的菌落进行评分。²³ 

如前所述，对小鼠骨髓有核细胞（BMNCs）的细胞表面标记进行流式细胞术分析。²⁴ 简而言之，BMNCs从小鼠股骨冲洗到缓冲液A（PBS和2%胎牛血清）中。然后通过在500下离心用缓冲液A洗涤细胞克持续5分钟。将细胞与Fc阻断剂孵育后，将彩色标记抗体抗CXCR3、c-Kit、Sca-1、血统标记物（CD5、CD11b、CD45R、Gr-1和TER119）或其同型抗体添加到细胞悬浮液中。染色细胞被清洗两次，并使用FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences）进行分析。如前所述，对细胞周期进行流式细胞术分析。²² 

通过Till和McCulloch的脾集落（CFU-S）分析测定造血干细胞。²⁵ 用225 mg/kg 5-FU治疗后第9天处死供体小鼠，并从胫骨和股骨冲洗BM细胞。血统阴性（lin^负极)使用EasySep小鼠造血祖细胞富集试剂盒（StemCell Technologies）从BM细胞中分离出细胞，并留作CFU-S分析中的供体细胞。供体细胞在IMDM加20%FBS和细胞因子（10ng/mL mSCF、mIL-3、mIL-6和20ng/mL hG-CSF）中培养，有或没有rMuMig。孵育4小时后，1-β-d日-将阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶（Ara-C）直接添加到细胞培养物中，以达到最终浓度1mM。培养1小时后，将细胞清洗两次，并重新悬浮在盐水中。

每组15只受体小鼠接受来自Cs的790 cGy（81 cGy/min）照射¹³⁷来源。照射后3小时内静脉注射供体细胞。11天后，切除脾脏，用Tellesniczky溶液固定，并在显微镜下计数可见的脾脏结节。移植林的数量^负极将每个脾脏的细胞数调整为10至20个菌落。在只接受生理盐水而不接受供体细胞的对照小鼠中，排除了内源性菌落的形成。

这项实验得到了柏林慈善大学伦理审查委员会的批准。在母亲知情同意的情况下，从足月分娩中采集脐血样本。CD34型⁺用磁性微球（Miltenyi）分离细胞，然后在干细胞培养基（添加20%FBS的IMDM，2mM）中培养我-谷氨酰胺、50μg/mL庆大霉素和7.3×10⁻⁵M巯基乙醇）。^23,26 用于扩展，CD34⁺细胞在96周的培养皿中培养，每周两次。每周使用血细胞仪和台盼蓝排除法测定细胞数量，并计算膨胀率。在配有数码相机（MicroPublisher 3.3；Weiss Imaging）的倒置显微镜（Axiover 200 M；卡尔蔡司）下，在室温下拍摄井底的细胞颗粒图像；图像采集采用QCapture Pro 6.0软件。

隔离后，10⁵人CD34⁺HPC与hSCF（20 ng/mL）孵育4小时，并与Mig（10 ng/mL）或PBS作为对照。然后用300mM Ara-C培养细胞1小时。然后清洗培养细胞并在干细胞培养基中培养72小时。根据制造商的说明，使用Annexin-V凋亡检测试剂盒（BD Biosciences Pharmingen），使用流式细胞术评估凋亡细胞。测定早期和晚期细胞凋亡的百分比。

获得知情同意后，从骨髓标本中培养MSCs，并用添加12.5%FBS、2mM的α-MEM培养MSCs我-谷氨酰胺和100 U/mL青霉素/链霉素。骨髓间充质干细胞的特征是其脊柱形态和间充质表面标记物（CD34和CD45阴性；CD44、CD90、CD105、CD146和CD166阳性；均购自BD Biosciences Pharmingen）。^27,28 MSC（5×10⁵)第3代至第4代的种子播种于25cm²烧瓶培养1-2天。当细胞达到80%以上的融合时，在新鲜培养基中用20 ng/mL的Mig刺激细胞，并加入或不加入2μg/mL的抗CXCR3单克隆抗体（R&D系统）。40小时后收集上清液，并在1+1的温度下与干细胞培养基混合，最终浓度为10 ng/mL Mig或1μg/mL抗体。CD34型⁺用这种上清液培养基混合物的条件培养基培养细胞，1周后通过流式细胞术分析CD34-CD45的表达。

Milliplex Map多通道信号磷蛋白试剂盒用于检测CD34中Mig-CXCR3相互作用的下游信号⁺HPC和MSC。用于细胞刺激，150 000个新分离的CD34⁺细胞在37°C的PBS/0.02%人白蛋白中加入或不加入20 ng/mL Mig培养30分钟。对于MSCs，细胞培养到汇合处，在接受相同的刺激程序之前，将血清饥饿4小时。收集细胞裂解物并测定总蛋白量。根据制造商手册，使用Luminex 200系统（Millipore）检测Erk（Erk/MAP激酶1/2，苏氨酸185/酪氨酸187）、STAT3（丝氨酸727）、JNK（Thr183/Tyr185）、p70 S6激酶（Thr412）、IκB-α（Ser32）、STAT5A/B（Tyr694/Tyr69）和p38（Thr180/Tyr182）的磷酸化信号；对平均荧光强度进行了分析。

结果以平均值±SEM表示。同一治疗组或不同治疗组在单个时间点随时间的统计显著性差异通过单因素方差分析（ANOVA）和双尾学生（Student）确定t吨测试（Excel 2003；Microsoft）。生存实验的结果采用log-rank检验进行分析，并表示为Kaplan-Meier生存曲线。假设统计显著性P（P）值小于0.05。

根据5-FU诱导骨髓抑制和再生的时间跨度(图1A） 编码CXCR3及其配体Mig的基因表达在注射5-FU后第3天被高度诱导，第7天达到最大值，第11天下降，第14天恢复到预处理水平。相反，与基线相比，编码CXCR3、IP-10和I-TAC其他2个配体的基因没有显著改变(图1B左）。

我们还检测了CXCR3及其配体在蛋白质水平上的表达。通过ELISA检测3种配体的血浆浓度，第7天米格浓度显著增加29.8倍(P（P）< .05;图1B右）。IP-10和I-TAC无明显变化。CXCR3的人口⁺BM细胞在第3、7和11天显著升高，在5-FU治疗后第14天恢复到基线水平(图1B右）。显然，受体和配体的临时蛋白表达谱符合其相应的基因表达模式。此外，CXCR3在lin的HPC中的表达^负极和LSK（lin^负极Sca-1型⁺c-套件⁺)细胞，尤其是LSK细胞，在BM再生期间高度上调(图1C） 。

阐明米格对细胞周期、BMNC和lin的影响^负极在给药后24小时内比较WT C57小鼠的HPC。外源性Mig抑制了BMNC和HPC循环，使BMNC的S期从18.97%±1.07%减少到15.30%±0.87%，而lin的S期则从14.98%±1.98%减少到11.37%±1.66%^负极单元格(P（P）< .01;图2A-B）。

因为CXCR3是小鼠体内唯一已知的Mig受体，我们使用与WT小鼠相同的方案将Mig注射到CXCR3基因敲除（KO）小鼠体内，然后检查BMNC的细胞周期状态。将这些CXCR3 KO小鼠回交至C57BL/6菌株至少6代。²¹ 接受Mig的KO小鼠与PBS对照组之间无差异（32.09%±2.70%vs 30.12%±2.32%；P（P）= .31;图2C） ●●●●。CXCR3 KO小鼠的S期百分比基线高于WT小鼠（32.09%±2.70%vs 18.97%±1.07%，P（P）< .001;图2A、 C）。

利用从WT或KO小鼠股骨收集的BMNC进行集落分析，以评估Mig对体外集落免疫HPC的影响。结果显示为与对照组菌落数相比的百分比。在WT小鼠中，Mig显著抑制体外HPC的集落形成（每10000个BMNCs的集落数：Mig组为93.6±5.0，而对照组为138.7±14.1；P（P）< .05;图2D） 而CXCR3 KO小鼠失去了这种能力（每10000个BMNCs的克隆数：Mig组为59.2±0.3，而对照组为53.3±6.5；P（P）= .91;图2E） 。这些数据表明，米格可能通过其受体CXCR3阻碍体外BM扩张。

为了阐明米格对培养的祖细胞的影响，林^负极在添加药物Ara-C之前，将HPC与Mig或PBS分离培养并作为对照，Ara-C与5-FU属于同一类细胞周期特异性化疗药物，但在细胞实验中应用更广泛。将培养的细胞注射到受体小鼠中。一组只接受生理盐水但未接受供体HPCs的小鼠作为“阴性对照”，一组接受HPCs但未接受Ara-C治疗的小鼠作为”阳性对照”。移植后第11天，处死存活小鼠，并计算CFU-S数。阴性对照组仅发现0.14±0.38个CFU-S，表明几乎没有受体衍生CFU-S。阳性对照组小鼠的CFU-S平均值为39.2±15.3，从1×10⁴供体HPC，表明供体HPCs移植成功。在Ara-C处理的细胞中，Mig-pretrated HPCs诱导的CFU-S数量显著高于PBS预处理的HPCs（12.1±2.6 vs 7.8±2.7，两者均为1×10⁴供体HPC；P（P）= .002;图3A） ●●●●。这表明Mig组中有更多的HPC受到Ara-C和移植后重建造血的保护。我们还分析了小鼠的存活率，发现Mig组的存活率高于PBS组(P（P）= .039;图3B） ●●●●。

在证明化疗后内源性Mig表达的激活与BM抑制相关后，我们进一步假设Mig也可能导致5-FU依赖性BM抑制的急性致死毒性。接受90%致死剂量5-FU的小鼠用Mig或PBS作为对照进行处理(图4A顶部）。接受米格的小鼠的存活率明显低于对照组。米格组和对照组的中位生存时间分别为5.8天和7.3天(P（P）= .048;图4A底部）。因此，BM抑制诱导的Mig表达似乎有助于5-FU的急性致死毒性。

为了验证我们的假设，即Mig和CXCR3的激活表达与化疗后BM的病理变化有关，我们应用抗体中和策略来研究抗Mig抗体的血液学效应。接受90%致死剂量5-FU的小鼠接受抗Mig免疫或对照血清治疗(图4B顶部）。我们观察到，与对照血清相比，抗Mig血清显著提高了小鼠的生存率(P（P）= .005;图4B底部）。抗Mig组和对照组的中位生存时间分别为10.7天和8.4天。在另一个实验中，小鼠在第0天一次性注射5-FU，然后从第1天到第10天每天服用抗Mig免疫血清或对照血清。虽然BM细胞的最低水平保持不变，但我们观察到抗-Mig显著改善了BM细胞数量的恢复(图4C） 和克隆祖先(图4D） ●●●●。

我们进一步在CXCR3 KO小鼠模型及其衍生的C57/BL6 WT对应物中研究了阻断Mig-CXCR3对化疗后血液再生的影响。KO和WT小鼠在第0天注射225 mg/kg 5-FU。在第0天、第7天、第9天和第11天，对BM和培养的BM单核细胞进行计数以进行集落分析。如所示图5观察到，KO小鼠在第9天和第11天的BM数量和第7、9和11天的CFU数量恢复明显更好，这支持了阻断CXCR3-Mig相互作用可以促进5-FU治疗后的骨髓再生的观点。

在我们的研究中，米格保护小鼠HPC免受细胞周期毒剂Ara-C的影响。因此，我们将Ara-C应用于人类HPC，以评估米格对化疗诱导的凋亡的影响。Ara-C治疗显著上调CD34细胞凋亡百分比⁺细胞（所有Ara-C处理组，P（P）<.01，与非Ara-C对照组相比），但Mig显著降低了这一百分比（SCF+Mig组为26.37%±1.12%，而单用SCF组为35.52%±1.21%；P（P）< .001). 抗CXCR3单克隆抗体逆转了Mig对细胞凋亡的抑制作用（SCF+Mig+CXCR3组与SCF组相比为34.26%±1.22%；P（P）=.27）。

出乎意料的是，米格并未直接抑制CD34的扩张⁺体外细胞培养中的HPC（数据未显示），这与我们之前的体内观察相反。我们假设Mig可能通过其他细胞类型（可能是MSC）抑制骨髓。骨髓间充质干细胞存在于骨髓生态位中，是构成造血干细胞自我更新和分化微环境的关键组成部分。当与HSC共移植时，MSCs可显著改善骨髓移植，并因其分泌的细胞因子种类繁多而支持HPC扩增。^29,30 在基于MSC条件培养基（CM）的成熟培养体系中，我们评估了Mig对MSC诱导的HPC扩增的影响。²³ 当将米格直接添加到培养物中时，它没有任何作用，但当在采集上清液之前用米格刺激MSCs时，我们观察到对HPC扩增的显著抑制(表1, †P（P）Mig CM组和CM组之间<.01）。靶向CXCR3-A氨基末端1至95个氨基酸的中和性抗CXCR3单抗IC6的应用逆转了Mig对CD45的抑制作用⁺单元格(表1，†P（P）抗CXCR3-Mig CM组和Mig CM组间的差异<0.01），但仅部分抑制CD34⁺高性能混凝土。

为了证明Mig-CXCR3结合引起的细胞内活动，我们寻找了细胞裂解物中信号蛋白磷酸化的证据。事实上，我们成功地观察到MSCs和CD34中不同的磷酸化特征⁺HPCs:Mig显著刺激MSCs中磷酸化p70 S6K和-Erk(P（P）=.006和P（P）=.014，与对照MSCs相比），但它降低了CD34中磷酸化-STAT5的水平⁺高性能混凝土(P（P）与对照HPC相比为.022）。

因为STAT5在GM-CSF的功能中至关重要，导致CD34的分化⁺细胞转化为CD34⁺CD45型⁺HPC和促进CD45的扩增⁺谱系细胞，³¹ Mig抑制磷酸化STAT5从理论上可以降低GM-CSF的作用。在与GM-CSF孵育1周后，我们观察到CD45的高度扩增⁺电池（3.28±0.15×10⁴仅在GM-CSF中vs 0.97±0.08×10⁴无GM-CSF控制；P（P）= 7.52 × 10⁻¹⁴)，而GM-CSF依赖性扩张被Mig显著抑制（2.36±0.15×10⁴GM-CSF+Mig vs GM-CSF单独使用；P（P）= 3.42 × 10⁻⁶)抗CXCR3单克隆抗体IC6（2.89±0.12×10⁴GM-CSF+Mig+抗CXCR3 vs GM-CSF+Mig，P（P）= 2.95 × 10⁻⁴；图6C） 。

据报道，在一些与应激相关但非造血的情况下，包括感染、炎症疾病、恶性肿瘤和移植物抗宿主病（GVHD），Mig表达激活。^32-36 第一次，通过转录组分析，我们能够证明小鼠Mig及其受体CXCR3的表达在化疗后在骨髓中短暂激活，表明它们具有调节化疗诱导的骨髓抑制的潜力。

之前的一项研究包括对30多个或多或少随机选择的趋化因子进行测试，并确定19个具有骨髓抑制性质。⁷ 在这些趋化因子中，有9种通过诱导体内祖细胞的细胞周期阻滞来抑制造血。¹⁹ 研究报告称，注射米格可能会削弱HPC形成集落的能力，从而在正常小鼠中诱导骨髓抑制，如果与CCL2或CCL20联合使用，情况会恶化。¹⁹ 其中一种化学因子MIP-1α的基因工程形式在化疗前使用时，通过保护髓系祖细胞，显著减轻了中性粒细胞减少症。⁸ 在该研究中，在一个体内模型中使用了3种不同的化疗药物。然而，根本的行动模式并未阐明。

在本研究中，CFU-S分析显示，在Ara-C体外治疗前与Mig孵育可保护lin^负极HPC和提高受照受者移植后CFU-S的存活率和数量。根据我们的研究结果，化疗后注射米格可减少BMNC的数量，降低HPC体外的集落形成能力，并保留G₀/G公司₁HPC体内的阶段，这解释了Mig在lin中的Ara-C保护作用^负极细胞。或者，在小鼠骨髓抑制和骨髓再生模型中，米格降低了S期骨髓基质细胞的数量，从而加剧骨髓抑制。²² 当小鼠在5-FU治疗后接受额外的Mig注射时，5-FU处理后Mig血浆水平立即升高，这与存活率降低相对应。这强调了化疗后米格的骨髓抑制作用。

迄今为止，CXCR3是唯一已知的米格受体。其他CXCR3配体IP-10和I-TAC与Mig具有相同的血管抑制和趋化功能，^37,38 但在这3种配体中，只有Mig在骨髓抑制的BM中表达上调，这表明Mig在脊髓抑制中的唯一作用。我们预计Mig的骨髓抑制性通过共同受体CXCR3传递。在不存在CXCR3的情况下，例如在CXCR3 KO小鼠中，Mig既没有在体内降低BMNC的S期百分比，也没有在体外抑制集落形成。此外，相同剂量的5-FU处理后，CXCR3 KO小鼠的骨髓再生速度快于WT小鼠。我们将其归因于Mig-CXCR3轴缺失，导致缺乏Mig依赖性骨髓抑制。当分离LSK细胞进行钙离子测定时²⁺流入实验中，我们观察到CXCR3 KO小鼠缺乏对Mig刺激的反应能力（补充图2）。

在体外实验中，米格并未直接抑制人CD34的扩增⁺我们发现这与之前在小鼠中观察到的结果相矛盾。因此，我们假设Mig诱导的骨髓抑制可能依赖于骨髓中的非造血细胞。骨髓间充质干细胞是骨髓的主要非造血成分，是造血生态位内微环境的基本组成部分，也被认为支持移植后的造血重建。^29,30 有趣的是，CXCR3在小鼠和人类的MSCs上都高表达，²⁷ 指示Mig在两种小区类型上的可能功能。这里，MSC培养上清液提高了HPC扩增，除非MSC在收获前用Mig刺激。在这种情况下，与非刺激性MSC条件培养基相比，HPC的扩张明显减少。我们的结论是，Mig-dependent BM抑制也与其对MSC的影响有关。事实上，Erk和p70 S6K的磷酸化主要与蛋白质合成有关，^39,40 骨髓间充质干细胞在Mig-刺激时显著激活。Erk还可以激活STAT1，STAT1在干扰素的信号转导中至关重要，并且对MSCs中一氧化氮（NO）的生成和诱导型一氧化氮合酶的激活至关重要。^41,42 NO是一种有效的细胞增殖抑制剂，⁴³ 这可以解释我们研究中HPC扩张受到抑制的原因。众所周知，p70 S6K是胰岛素信号传导和分泌的负调控因子。⁴⁴ 胰岛素刺激细胞循环，促进造血细胞增殖。⁴⁵ 相反，胰岛素的负调控可能具有抑制HPC增殖的作用。p70 S6K还参与间充质转化生长因子β（TGFβ）的表达，⁴⁶ 原始造血细胞的潜在抑制剂。⁴⁷ 因此，Mig可能通过促进MSCs分泌TGFβ来抑制HPC的扩张。

在CD34的信号通路中⁺然而，Mig以不同的方式发挥作用。米格非但没有刺激它，反而降低了STAT5的磷酸化。STAT5是维持人类HSC和HPC所必需的，并且在G-CSF和GM-CSF的信号传递中起着关键作用，这些信号会启动沿白血统的分化。⁴⁸ STAT5磷酸化的抑制可能会损害CD45分化和HPCa的集落形成能力，Mig确实可以减少HPC依赖GM-CSF的扩张。这为我们的发现提供了解释，即服用米格后，WT小鼠的菌落形成减少。在CFU-S实验中，当HSC和HPC与SCF和G-CSF等血液生长因子孵育时，STAT5通常会增加，从而启动细胞循环并增加HPC对化疗的敏感性。相反，正如我们所观察到的那样，Mig诱导的STAT5下调可以相应地抑制细胞周期并保护HPC。

在小鼠中，只有一种形式的CXCR3，因此在CXCR3 KO小鼠中，Mig没有骨髓抑制特性。然而，有两种已知的人类CXCR3变体具有不同的功能：CXCR3-A促进增殖和趋化性，CXCR3-B抑制增殖。⁴⁹ CXCR3-B mRNA的N末端具有比经典CXCR3-a mRNA更长的胞外结构域，并且它们都共享第79个核苷酸的共同序列。这意味着此处使用的IC6单克隆抗体靶向CXCR3-A的N末端1至95个氨基酸，可能与CXCR3-B几乎没有亲和力。这可能解释了为什么IC6抗CXCR3单克隆抗体只能部分逆转Mig诱导的对MSC依赖性CD34扩张的抑制作用⁺HPCs，这可能意味着Mig对MSCs的作用是通过CXCR3-B传递的。尽管如此，因为两者都被IC6抗体显著逆转；CD45的抑制作用⁺细胞分化和HPC对化疗药物的保护可能通过CXCR3-A传递。

结合HPC和MSC的观察结果，我们可以了解Mig的功能作用。当预先应用米格时，可降低HPC中STAT5的磷酸化，减少下游细胞循环，并保护其免受化疗的影响。化疗后应用米格可延迟HPC和BMNC的再生，并降低小鼠的存活率。但是，Mig激活了MSCs中的p70 S6K和Erk1/2信号通路；这可以解释为什么HPC扩张受到抑制，造血细胞数量减少，从而进一步阻止化疗后的骨髓再生。

化疗后Mig的深度表达使我们怀疑Mig对BM再生的抑制作用。与以往的研究不同，^8,19 我们没有将Mig的化学保护作用分析局限于一个体内模型。相反，我们研究了它对骨髓小生境中不同靶细胞的影响，包括人类细胞，如CD34⁺高性能混凝土，林^–HPC和MSC。我们还确定了相应的信号通路，以阐明潜在的分子机制。

总之，使用抗Mig抗体缓解化疗诱导的骨髓抑制是一个全新的想法。此外，我们基于微阵列的策略定义化疗诱导骨髓抑制中的阴性和阳性调节因子，这可能为骨髓再生组学的发展开辟了一个新领域。

这项工作得到了德国学术交流服务局和中国奖学金委员会（赠款A/09/90104）、中国国家自然科学基金会（赠款30801419和30901873）、上海市科学技术委员会（赠款09540700600）的部分支持，中国科学技术部（2007AA02Z149和2009ZX09103-743）。

贡献：H.L.、S.Z.、L.Q.、D.X.、W.Z.、A.N.、Jin Gao和M.W.进行了实验，分析了结果，并组成了数字；Gao Jinming和B.L.饲养CXCR3 KO小鼠；H.L.、Y.Y.、W.H.和A.M.设计了研究并撰写了手稿。

利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。

通信地址：中国上海市东川路800号上海交通大学药学院魏翰，邮编：200240；电子邮件：weihan@sjtu.edu.cn; 或严宇，上海交通大学农业与生物技术学院，中国上海市东川路800号，200240；电子邮件：yanyu@sjtu.edu.cn.