Budd-Chiari综合征患者肝内皮细胞JAK2V617F突变的研究

真性红细胞增多症（PV）是一种费城染色体阴性的骨髓增生性疾病（MPD），与胞浆酪氨酸激酶的突变有关，JAK2号机组.^1,2 获得功能突变(JAK2V617F系列)在90%以上的PV患者中存在。^1,2 PV和腹内血栓有关。^三 据报道，一些血细胞计数正常的人出现内脏静脉血栓形成，包括布-加综合征（BCS）和门静脉血栓形成JAK2V617F系列-造血阳性，表明这种血栓性倾向可能先于MPD的发展。^4,5 

在哺乳动物早期发育过程中，已经确定了造血和内皮细胞（EC）元素的共同来源细胞。^6-8 这种所谓的成血管细胞在成人中具有特征性，但其在正常造血或MPD发病机制中的作用尚不明确。^9,10 自1997年以来，有人提出产后血管生成涉及循环内皮祖细胞的层次。¹¹ 其中一些内皮祖细胞起源于髓系，而其他内皮祖细胞具有更强大的增殖潜能，且仅起源于EC。^12,13 内皮祖细胞的参与JAK2V617F系列已经有几个小组进行了研究。^12,14,15 血管内皮为循环中性粒细胞和血小板提供了一个非粘附表面，同时有助于防止血液凝结。一些研究小组假设，EC功能障碍可能通过协调血细胞元素向损伤部位的募集或通过损害一氧化氮的释放调节血管张力，导致PV相关的高凝状态。^16-18 

为了进一步探讨MPD中内皮细胞的起源，我们检测了非造血器官中的内皮细胞是否存在JAK2V617F系列我们通过研究BCS和PV患者肝活检标本小静脉中的内皮细胞来验证这一假设，这些肝活检标本是使用激光捕获显微切割术（LCM），然后进行巢式聚合酶链反应（PCR）或逆转录（RT）-PCR。

研究了3例BCS伴PV患者和2例无PV的肝门静脉硬化症患者的肝活检标本的福尔马林固定石蜡包埋切片(表1). 肝门脉硬化症是一种非肝硬化门脉高压症和组织学门脉异常。¹⁹ 西奈山医学院机构审查委员会批准了对存档标本的访问。PV的诊断是根据世界卫生组织概述的标准进行的。²⁰ 粒细胞JAK2V617F系列仅对一名患者的等位基因负荷进行了研究。²¹ 其他患者在研究时无法进行此类测试。

在存档的福尔马林固定石蜡包埋肝活检标本切片中观察到肝末梢小静脉的内皮细胞，并在苏木精和伊红染色或用抗CD34单克隆一抗进行免疫化学染色（克隆QBEnd/10；CONFIRM，Ventana Medical Systems，Tucson，AZ），然后用共轭链霉亲和素-辣根过氧化物酶二级抗体染色。ECs通过其纺锤形核和沿肝终末小静脉内壁的位置以及抗CD34染色后的深棕色进行鉴定。肝细胞根据其形态学标准进行鉴定，包括位于中心的圆形细胞核和具有小梁排列的丰富细胞质。在染色过程的一小时内捕获细胞。使用ArcturusXT系统（加州山景城Arcturus Bioscience；加州山景镇MDS Analytical Technologies）从每个活检标本中采集至少10个EC和10个肝细胞。用LCM分离EC或肝细胞至少在同一肝活检标本的3个不同切片和每个切片的至少3个不同血管壁中重复，结果保持不变。

根据制造商的说明，对激光捕获的细胞、血细胞、肝细胞和内皮细胞进行DNA分离处理，并使用PicoPure DNA提取试剂盒（Arcturus Bioscience；MDS Analytical Technologies）提取DNA。这个杰克2v617f如前所述，使用嵌套等位基因特异PCR检测突变。²² 

使用PicroPure RNA分离试剂盒（Arcturus Bioscience）从激光捕获的细胞中提取总RNA。根据制造商的说明，用SuperScript III逆转录酶（加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen）从总RNA合成第一链互补DNA（cDNA）。之前已经描述了用于VE-cadherin、VEGFR-2、VWF、CD45、CD14、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和白蛋白扩增和循环条件的引物序列。^12,23-26 使用ABI Prism 7900序列检测系统（加利福尼亚州福斯特市Applied Biosystems）进行实时RT-PCR分析，并使用SYBR green I技术（QuantiTect SYBR green PCR Kit；加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN）检测PCR产物。PCR扩增总体积为20μL；每个反应包含2×SyberGreen混合物、200 nM引物和cDNA。所有分析均重复进行，所有分析均包括阳性对照、阴性对照和无模板对照。为了评估EC或造血细胞mRNA的表达，使用软件实时检测报告染料发出的高于基线信号的荧光，记录并表示为周期阈值（CT）。CT值用于确定样本中是否存在PCR产物。检测GAPDH的CT值可以证明有足够数量的RNA可用。在存在GAPDH信号的情况下，感兴趣基因的CT值缺失表示感兴趣基因为负信号，而在存在GAPD的情况下感兴趣基因CT值的存在表示正信号。实际CT值见图1C、。

BCS和肝门静脉硬化症患者存档肝活检组织标本切片中显示的肝终末静脉内皮细胞(表1)苏木精和伊红染色后的位置和形态以及抗CD34抗体免疫化学染色后的特征棕色很容易识别(图1A） ●●●●。每个患者的肝细胞都只含有野生型JAK2号机组2名患有PV的BCS患者的EC为纯合子JAK2V617F系列第三名BCS和PV患者以及2名无PV的肝门静脉硬化患者的EC均含有野生型JAK2号机组(图1B） ●●●●。两名PV患者表现为JAK2V617F系列-肝活检标本血管腔内血细胞LCM检测呈阳性(表1). 另一名BCS患者被证明患有JAK2V617F系列外周血粒细胞等位基因负荷50%。

LCM捕获并表达野生型的细胞的EC身份JAK2号机组或JAK2V617F系列通过与内皮细胞相关的转录物VE-cadherin、VEGF-R2和VWF的存在以及与造血细胞（CD45和CD14）相关转录物的缺失证实了突变。LCM捕获的肝细胞的性质通过白蛋白的存在以及EC和造血细胞标记物的缺失得到证实(图1C） ●●●●。

一些研究小组已经探讨了内皮细胞参与血液恶性肿瘤恶性过程的可能性，^24,27-30 但MPD患者血管内内皮细胞的参与情况之前尚未进行过检查。在本报告中，用LCM从3例患有PV的BCS患者的终末肝小静脉中分离出内皮细胞，并对其进行分析JAK2V617F系列每个患者的肝细胞都含有野生型JAK2号机组而3名患有PV的BCS患者中有2名的EC是纯合子JAK2V617F系列.含有JAK2V617F系列ECs而非造血细胞转录本特征的表达证实了突变。

血管壁是一个复杂的结构，其中至少存在3种不同的细胞类型：内皮细胞、周细胞和血管壁内的祖细胞，即CD34⁺蔬菜2⁺轮胎2⁺CD31型^负极CD45型⁺.^31,32 这些细胞位于血管壁的一个独特区域，该区域位于成人血管壁的平滑肌和外膜层下方，称为血管生成区。这些细胞有可能分化为成熟的内皮细胞、造血细胞和局部免疫细胞，如巨噬细胞。因为在BCS患者的肝脏中分析的细胞定位于血管壁的内膜，而不是血管壁的血管生成区，并且CD45呈阴性(图1A、 C），这些细胞是否被血管壁常驻祖细胞污染值得怀疑。

MPD被认为起源于原始造血祖细胞或干细胞水平。尽管胚胎发生期间描述了内皮细胞和造血细胞的共同起源细胞，但其在出生后的存在仍然是一个备受关注的课题。突变体的存在JAK2号机组在本报告中，内皮细胞和造血细胞中的MPD可归因于这些患者的MPD来源于所谓的血管母细胞。本报告提供的数据表明，PV患者亚群中的恶性MPD涉及肝小静脉内皮细胞。欧盟参与缺乏统一性JAK2V617F系列患有PV的BCS患者的突变可能是至少两种替代解释的结果：（1）JAK2V617F系列受累范围可能局限于肝脏内的局部区域，在研究单个肝脏活检标本时可能会忽略这些区域；（2）并非所有患有PV的BCS患者JAK2V617F系列-EC阳性，表明该患者群体存在异质性。

由于本报告中研究的患者数量受到造血外组织的限制，因此不可能估计PV恶性过程中此类参与的频率或程度。此外，恶性过程中EC的参与与MPD血栓形成之间的关系需要进一步仔细评估。

这项研究得到了骨髓增生性疾病基金会（R.H.）、国家癌症研究所（1P01CA108671 to R.H）和国防部的资助。

美国国立卫生研究院

贡献：S.S设计并执行了研究和分析数据；M.I.F收集并分析了数据，并修订了手稿；T.S.收集数据，分析数据，并修改手稿；J.M.收集了数据；M.X.修改了手稿；R.H设计了研究，解释了数据，并撰写了论文。

利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。

通信：Ronald Hoffman，Tisch癌症研究所血液学/肿瘤学分部，西奈山医学院医学部，One Gustave L.Levy Pl，Box 1079，New York，NY 10029；电子邮件：罗纳尔德·霍夫曼@mssm.edu.