人血清庚肽的免疫测定

Hepcidin是调节细胞外铁浓度动态平衡的主要铁调节激素。^1，2 虽然肽最初合成为84-氨基酸前肽，但它在肝细胞中由信号肽酶和前激素转化酶furin进行处理^三 血浆中循环的一种25氨基酸肽的生物活性形式^4，5 并通过尿液排泄。⁵ 肝素通过调节参与铁储存或运输的组织（吸收膳食铁的十二指肠肠上皮细胞、储存铁的肝细胞和从衰老红细胞中回收铁的巨噬细胞）的铁流入血浆来发挥作用。在分子水平上，hepcidin与唯一已知的细胞铁流出通道铁转运蛋白结合，并诱导其内化和溶酶体降解⁶ 通过类似于使其他更传统的膜受体失活的机制。血浆中可检测到庚西啶的N-末端截断击穿产物⁷ 和尿液^5，8 但显示铁蛋白内化能力受损。⁹ 

血浆铁浓度升高会在生理上促进肝素合成，^10，11 红细胞生成活性降低，¹² 炎症引起的病理性加重。^10，13 肝素过多在炎症性贫血中起主要作用^14-16 以及抗铁性缺铁性贫血。^17至20 相反，hepcidin缺乏是大多数遗传性血色素沉着症中铁超载的原因²¹ 并导致β地中海贫血和其他缺铁性贫血的铁超载。²² 

尽管庚西啶对系统铁稳态和铁相关病理学具有重要意义，但测量生理相关庚西汀浓度的方法十分繁琐，其在临床研究界的可用性非常有限。大多数关于人类体内庚西啶的研究都依赖于人类尿液中庚西汀的测定，²³ 基于阳离子交换色谱法从尿液中选择性提取庚肽，并通过抗庚肽抗体和化学发光法以免疫斑点形式检测庚肽。为了解释尿样的可变稀释度，将庚啶浓度标准化为尿肌酐。这项检测很费力，其实用性取决于正常化尿庚肽水平和血浆庚肽浓度之间预期但尚未验证的关系。最近，基于质谱技术的庚西啶分析^{7，8，24，25} 已经引入，但大多数是半定量的，并且依赖于昂贵的设备，而这些设备并不普遍可用。一种检测人前庚肽的免疫分析方法²⁶ 不能反映预期的生理或病理变化²⁷ 成熟的hepcidin浓度与其他hepcidine检测结果一致。我们现在描述了竞争性酶联免疫测定法（C-ELISA）对人铁调素的性能。该检测准确且重复性好，可检测血清或尿液中庚啶水平的生理和病理变化，并且可以以高通量的形式轻松进行。

如前所述，制备了人庚肽抗体¹³ 并根据制造商的方案在葡萄球菌蛋白A柱上纯化（伊利诺伊州罗克福德的赛默飞世尔科学公司）；96-well板上涂有抗体，并与100μL（标准样品）或200μL（极低浓度庚啶的样品）的1:20稀释血清或1:10稀释尿液在含有0.05%吐温-20（TBS-Tween 20）的Tris-缓冲盐水中孵育，以及10 ng/mL生物素化庚烯-25（加州La Jolla，Intrinsic LifeSciences）添加为跟踪程序。标准曲线是在含有示踪剂的TBS-Tween 20缓冲液中，通过将合成的庚西啶（Bachem Biosciences，King of Prussia，PA）4000 ng/mL连续稀释2倍制备的。合成的庚西啶和生物素化庚西汀的完整性和生物活性通过质谱法和表达铁蛋白绿色荧光蛋白的HEK-293细胞的生物测定进行了验证。⁹ 洗涤后，用链霉亲和素过氧化物酶和四甲基联苯胺建立检测方法。用硫酸停止酶反应，并在DTX 880微孔板阅读器（加利福尼亚州富勒顿市贝克曼·库尔特）上在450 nm处读取板。使用GraphPad Prism软件（加州圣地亚哥GraphPad-software）对标准曲线进行12点拟合。然后使用拟合曲线将样品吸光度读数转换为庚啶浓度。使用肌酐参数测定法（明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems）通过Jaffe反应测量尿肌酐浓度。

根据相关机构审查委员会批准的方案收集所有样本，并根据《赫尔辛基宣言》获得知情同意。血清和尿液样本在−80°C下冷冻保存。

在意大利维罗纳和犹他州盐湖城采集健康志愿者的血清，并根据健康史和血红蛋白、血清铁/总铁结合能力、铁蛋白、血清转铁蛋白受体和C反应蛋白（CRP）的正常实验室值（根据当地标准）纳入本研究。遗传性铁紊乱患者由美国、加拿大、意大利、希腊和法国的合作医生招募。根据家族史、基因检测和适当的生化异常情况确定具体诊断。缺铁或炎症患者的血清样本是从加州大学洛杉矶分校临床实验室（UCLA Clinical Laboratory）获得的，作为含铁蛋白低于10 ng/mL或CRP高于10 mg/dL的血清的丢弃物。多发性骨髓瘤患者的血清来自退伍军人管理局骨髓瘤研究组。在加州大学洛杉矶分校获得慢性肾脏疾病患者的血清，选择没有任何已知潜在炎症疾病的患者。

在健康志愿者中，通过从摄入铁之前24小时开始到摄入铁之后24小时结束的连续血清采样，确定对摄入一片或两片硫酸铁片剂形式的65mg或130mg铁的反应时间过程。

使用Sigmastat（Systat Software，San Jose，CA）对数据进行分析。

竞争ELISA标准曲线(图1)从6例血清铁蛋白小于10ng/mL的患者中获得的任何一份庚西啶阴性血清都不受影响，表明非庚西汀血清成分几乎没有干扰。此外，当一种抗菌肽在结构上与七肽、蛋白酶-1、，²⁸ 以16至500 ng/mL的浓度添加（数据未显示）。高于零标准2 SD的庚西啶检测下限为5.5 ng/mL。

对来自健康志愿者的11份血清样本进行重复分析（n=5-12，图S1A、 在上可用血液网站；请参阅在线文章顶部的补充材料链接），得出变异系数（CV）为5%至19%，在较低的庚西啶浓度下变异较大。

24名健康志愿者的血清样本通过3种独立的分析进行测量(图S1B） ●●●●。平均变异系数为12%，中位数变异系数为7%。范围为0%至44%，在庚西啶浓度低于30 ng/mL的血清样品中观察到较高的变化。

在−80°C下储存6个月前后，对15份健康受试者的血清和15份尿液样本进行了分析。血清中铁调素浓度的中位数（四分位间距）变化为−5%（+6%，−11%），尿液中铁调素浓度变化为−6%（+7%，−14%）。

我们使用健康志愿者（65名男性，49名女性）的样本测定了血清中庚啶的正常范围。受试者的血液学和铁参数见表1经多重比较调整后，美国和意大利站点在年龄、血红蛋白、转铁蛋白饱和度或铁蛋白方面没有显著差异，因此这两个站点的数据按性别合并。hepcidin浓度的5%至95%范围(表2)男性为29至254 ng/mL，女性为17至286 ng/mL。中位数差异显著，分别为112和65(P（P）<.001（通过Mann-Whitney秩和检验）。尽管男女血清庚西啶有随年龄增长而增加的趋势，但没有达到统计学意义(图S2). 需要更多的老年男性和女性来验证这一趋势。

肝素通过肾脏清除，出于技术原因，大多数关于肝素在铁病理生理学中作用的初步研究都使用尿液肝素分析。这是一种循环激素的间接测量，从未和生理相关的血清庚肽水平相关。我们用C-ELISA测定了24名健康志愿者的尿庚啶浓度，并将其归一化为尿肌酐。尿庚啶（ng/mg肌酐）中位数为502，范围为71至1762。与血清庚西啶一样，女性尿庚西汀浓度低于男性，平均值为394 ng/mg肌酐对861 ng/mg(P（P）=.004（通过Mann-Whitney试验）。在这组健康受试者中，标准化的尿铁调素浓度与血清铁调素浓度显示出良好的相关性(图2). 然而，当肾功能下降时，这种相关性预计会恶化。

接下来，我们询问了C-ELISA测定的血清庚肽浓度是否反映了铁储存量，与通常用于评估铁储存量的其他实验室标记物类似(图3). 事实上，健康受试者的血清庚肽浓度与血清铁蛋白密切相关（r=0.63，P（P）< 10^-13log（hepcidin）vs log（ferritin））。

为了确定检测是否检测到预期的庚西啶对铁负荷的反应，我们检查了口服铁之前和之后庚西汀的时间进程(图4). 在可检测到铁吸收的受试者中，激发后4小时的血清铁水平与对照期间的相同时间相比有所上升，这表明血清庚西啶水平相应但持续时间更长。血清铁在中午和下午显示出预期的日增长²⁹ 在控制期和铁激发后，那些没有检测到铁吸收的受试者。在控制期内，中午、下午4点和晚上8点的hepcidin平均浓度高于上午8点的值，这对于中午和晚上8点值来说达到了统计意义（1向重复测量方差分析、Holm-Sidak方法、P（P）< .05). 总的来说，早上8点禁食的庚西啶浓度似乎比一天中其他时间的浓度更一致。

测定了各种铁紊乱患者血清中的肝素浓度(图5). 与先前的尿铁调素测量结果一致，³⁰ 铁负荷过高的成年型遗传性血色素沉着症患者的血清hepcidin异常正常，而HFE基因突变导致的缺铁患者的血清hepcidin偏低。血球蛋白突变导致青少年血色素沉着症患者的血清庚西啶也较低。正如从hepcidin调节的生理学可以预期的那样，19例缺铁患者中有18例检测不到血清hepcidin.（铁蛋白<10 ng/mL）。炎症患者（CRP>10 mg/dL）、多发性骨髓瘤患者（与白细胞介素-6过度产生相关）的血清庚啶异常升高，³¹ hepcidin合成的已知刺激物，²³ 以及慢性肾脏疾病患者，无相关炎症疾病。

我们开发了一种血清C-ELISA检测人类庚肽，能够正确检测庚肽浓度的预期生理和病理变化。C-ELISA的选择性由缺铁和严重遗传性血色素沉着症患者的极低血清庚酸蛋白水平表示。与hepcidin的拟议作用机制一致，正常和病理样品中测得的血清hepcidin-浓度范围（<5 ng/mL至>4000 ng/mL，即0-1.5μM）在已知的铁输出通道铁蛋白内化范围内。⁶ 我们的C-ELISA首次揭示了血清庚肽的显著性别差异。这种差异很可能是由于女性体内铁储存量较低，也反映在血清铁蛋白浓度较低(表1;图3). 血清庚西啶浓度的日变化与血清铁浓度相似，也随着口服硫酸铁引起的血清铁的急性变化而显著增加(图4). 肝细胞对铁的反应动力学可能很复杂，因为肝细胞接触到门静脉血中的铁团以及系统血中铁浓度的变化，而肝细胞的变化通过影响肠细胞、巨噬细胞和肝细胞储存物中铁的释放，对铁浓度产生反馈作用。

铁调素和血清铁蛋白对炎症和铁储备变化的反应相似，这反映在健康志愿者中铁调素和铁蛋白之间的强烈相关性上。然而，七肽反应发生在几个小时的时间尺度上，而铁蛋白浓度的变化要慢得多。³² 在几种病理状态下，血清铁蛋白和庚西啶之间的相关性显著改变。在各种形式的遗传性血色素沉着症中，由于hepcidin调节因子或hepcidin基因本身的突变，hepcidin2缺乏。³³ 在未经治疗或部分治疗的遗传性血色素沉着症患者中，铁蛋白高，但庚西啶异常正常、低或缺乏。虽然红细胞生成活性对铁蛋白没有直接影响，但它强烈抑制了庚啶的合成。¹² β-地中海贫血患者也出现了hepcidin的病理抑制（面对血清铁蛋白的大幅增加）^22，34-37 它导致肠道铁吸收增加，并导致全身铁超载，这是这种情况下发病率和死亡率的主要原因。

假设正常血清肌酐浓度为1 mg/dL，血清庚肽为100 ng/mL，则血清庚素与血清肌酐的正常比值约为10 000 ng/mg肌酐。在我们的健康志愿者中，尿液中含有500 ng庚啶/mg肌酐。因此，95%的hepcidin保留在肾脏中，要么是因为它不能自由地通过肾小球膜过滤，要么是由于它像其他小肽一样在近端小管中被重新吸收和降解。^38，39 尽管我们发现健康献血者的尿液和血清庚西啶浓度之间存在良好的相关性，但尿液庚西汀浓度可能无法准确反映肾脏疾病患者的血清庚西汀浓度。

人类血清hepcidin的C-ELISA应该有助于我们更好地了解hepcidine在各种铁紊乱中的致病作用，并有助于制定适当的治疗干预措施。铁蛋白是铁储存的有用标志，与铁蛋白相反，庚西啶浓度的变化往往是铁紊乱的原因。因此，铁调素浓度的诊断测量应该能为铁相关疾病的病因提供更多信息。需要进行大规模的人体研究，以确定血清庚西啶测定在铁紊乱诊断和临床管理中的实用性。

作者感谢William L.Roberts博士捐献健康捐赠者的血清；P.Brissot、C.Camaschella、C.Bozzini、A.Lichtenstein、D.Swinkels、P.Goldberg、B.Young、J.Zaritsky、I.Salusky、A.Nissenson和G.Papanikolao博士的患者为本研究提供了尿液和血清样本；以及L.Wagar博士和加州大学洛杉矶分校临床实验室允许我们使用铁蛋白和C反应蛋白分析中废弃的血清。

这项工作得到了意大利Telethon（编号：GGP06213）和意大利维罗纳Cariverona基金会（D.G.）的部分资助。

贡献：T.G.设计了研究，分析了数据，并撰写了手稿；G.O.、E.N.和M.W.设计了研究，进行了实验，分析了数据，并编辑了手稿；D.G.设计了研究，分析了数据，并编辑了手稿。

利益冲突披露：T.G.、G.O.、E.N.和M.W.是Intrinsic Lifesciences LLC的高管或员工，对公司拥有所有权权益。Intrinsic Lifesciences LLC致力于本手稿中所述分析的商业开发。D.G.声明没有竞争性财务利益。

通讯地址：Tomas Ganz，37-055 CHS，加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院医学部，邮编：90095-1690；电子邮件：tganz@mednet.ucla.edu; 或Mark Westerman，Inrinsic LifeSciences LLC，505 Coast Boulevard South，Suite 102，La Jolla，CA 92037；电子邮件：mwesterman@internsiclifesciences.com。