铁从内体直接在细胞器间转移到线粒体

尽管几十年来，人们已经认识到铁在几乎所有已知生物体中的生命需求，但铁（Fe）的一些最基本的细胞生物过程仍然没有被现代科学所认识。哺乳动物的生理学需要恒定的生物可利用铁来源，铁是血液蛋白、含铁硫簇的蛋白质和其他铁蛋白的功能成分。然而，其还原形式（Fe²⁺)，铁通过芬顿化学催化产生有毒的羟基自由基，而铁版本（Fe³⁺)在生理pH值下几乎不溶。^{1，——三} 然而，成年人体含有大约4克铁，其中80%以上是血红蛋白（Hb）。⁴ 在正常情况下，每秒约产生200万红细胞。因此，红细胞生成每天需要大约25毫克的铁，所有这些都是通过输送的通过转铁蛋白（Tf）。血浆中含有约3μM二价Tf，其铁以血红蛋白的形式集中在成熟的红细胞组织中，相当于20 mM铁。这种对潜在有毒金属的异常快速利用需要严格的调控机制，以便高效生产血红蛋白，同时保护发育中的红细胞和其他组织免受铁的有害特性的影响。⁵ 

几乎每个组织都是通过受体介导的Tf内吞作用获得铁的（有关综述，请参阅Richardson和Ponka⁶ 和Hentze等人⁷ )：二铁Tf与细胞表面的同源受体结合；这种结合是通过受体-甘氨酸复合体的内化来实现的。通过v-ATP酶质子泵的活性降低囊泡的pH值，在内体内实现铁从Tf中的释放。在酸化的内体中，铁从Tf中释放出来后，必须被还原（可能是通过最近发现的Steap3⁸ )然后通过二价金属转运体（DMT1）穿过囊泡膜。^9，——11 

铁从内体出口后的直接命运基本上是未知的。通过某种机制，金属必须从囊泡出口，经过线粒体膜，转移到基质，在基质中插入铁的酶²⁺铁螯合酶（FC）存在于原卟啉IX（PPIX）环中。^7，12，13 迄今为止，线粒体内铁运动的唯一可能参与者是线粒体内膜蛋白，该蛋白最初被鉴定为酵母中的细胞器铁输入蛋白（Mrs3/4）¹⁴ 后来在小鼠中得到证实（丝裂原）。¹⁵ 有趣的是，血红素生物合成抑制剂（异烟酸酰肼、琥珀酰丙酮）^{16，，，——20} 或血红素生物合成酶5-氨基乙酰丙酸合成酶突变（即X连锁铁粒细胞性贫血患者）^21，22 导致铁在血红蛋白生成细胞的线粒体中积聚（后一示例中产生环状铁粒细胞），表明输送到这些细胞的铁是专门针对线粒体的。

铁从含转铁蛋白内体转移的公认模型提出，内吞铁被输出到胞浆中，并与一些低分子量载体复合，形成通常所称的不稳定铁池（LIP）。^23，24 然而，这种备受追捧的铁络合物从未被发现。此外，DMT1的底物亚铁在发育中的红系细胞的富氧胞质溶胶中具有相当大的毒性。²⁵ 重要的是，我们实验室以前的结果表明，在没有代谢活性的网织红细胞中几乎没有螯合铁，这与公认的LIP特征相冲突。²⁶ 在本研究中，我们使用网织红细胞来检测铁从内吞囊泡向线粒体的传递，网织红血球为血红蛋白合成获取大量铁。

除非另有说明，否则所有化学品均从Sigma-Aldrich（安大略州奥克维尔）采购。除非另有说明，否则使用补充有1%牛血清白蛋白（BSA）、25 mM HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸）和10 mM碳酸氢钠（pH 7.4）（以下简称“培养基”）的最低必需培养基（MEM）与网织红细胞进行所有37°C培养。⁵⁹铁₂-Tf和⁵⁹铁水杨醛异烟酸酰腙(⁵⁹铁-二氧化硅₂)是由⁵⁹氯化铁（Perkin Elmer，Woodbridge，ON）和标记apo-Tf，如前所述。^27–29使用Cobra IIγ计数器（Packard Instruments，Meriden，CT）进行放射性测量。Kostas Pantopoulos博士（加拿大蒙特雷亚尔麦吉尔大学）慷慨提供了Huh7细胞（类肝细胞系）的汇合培养皿。B-[（2,2′-联吡啶-4-基）氨基羰基]苄基酯（RDA）是德国杜伊斯堡大学R.Sustmann博士慷慨赠送的礼物。

提取网织细胞通过CD-1雌性小鼠心脏穿刺，连续3天接受50 mg/kg苯肼（腹腔注射）治疗，并允许恢复2或3天（即小鼠在首次注射后第6或7天出血）。这种方法允许我们采集含有30%-50%网织红细胞的血液（通过新亚甲基蓝染色验证）；我们将这些样品称为“网织红细胞”。细胞在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤，并在含有1 mM膜无色形式脱铁胺（HES-DFO；Biomedical Frontiers，Inc.，明尼苏达州明尼阿波利斯）或异硫氰酸荧光素-dextran共轭物（10 000 kDa；FITC-右旋糖酐）。根据Scott等人的方法进行溶解和重新密封。³⁰ 简言之，通过将细胞装入透析管（直径约为11 mm的500μL/15 cm，分子量为3500的截止管）中，并在4°C下用5 mm磷酸钾缓冲液（pH 7.4）透析20分钟，即可完成溶解。立即将试管置于等渗溶液（5 mM磷酸钾缓冲液，含0.9%氯化钠和0.1%葡萄糖）中，将其预热至37°C，并在此温度下培养30分钟。在重新密封步骤后，将细胞在冰冷的PBS中清洗，直到上清液变清。

对于所有培养步骤，使用10%至20%的网织红细胞悬浮液的红细胞压积。对于重新密封的细胞：将清洗后的重新密封细胞在37°C的培养基中培养60分钟。因为我们已经观察到，重新密封后，细胞内小泡内存在一些HES-DFO，所以这种培养可以通过胞吐作用去除小泡内积聚的HES-DFO。随后用1μM⁵⁹铁₂-Tf或⁵⁹铁-二氧化硅₂在37°C下持续2.5小时。在冰镇PBS中清洗细胞后，血红素和非血红素⁵⁹通过前面描述的酸分解/三氯乙酸沉淀法分离铁。^16，26 

对于非密封网织红细胞的实验，将清洗后的细胞在4°C的温度下在1μM的浓度下培养60分钟⁵⁹铁₂-温度。一群⁵⁹通过添加巴非霉素A，在这些细胞中生成铁标记的内体₁（60 nM；负责内体酸化的v-ATP酶抑制剂^26，31 )培养最后30分钟，然后将细胞加热至37°C 30分钟。未绑定⁵⁹铁₂-通过在PBS中清洗细胞来去除Tf和巴非霉素，并通过在4°C和10μM下120分钟处理来去除表面结合放射性⁵⁶铁₂-温度。接下来用指定浓度的N-（6-氨基己基）-5-氯-1-萘磺酰胺（W-7；特异性钙调蛋白抑制剂^32，33 )在4°C下保持30分钟。成立⁵⁹通过将样品在37°C下孵育指定的时间间隔，在PBS中洗涤，并如上所述测定血红素和非血红素的放射性来监测血红素中的铁。用W-7进行显微镜实验的处理也类似（即在4°C下30分钟，并在荧光Tf摄取期间留在培养基中）。

对于非Tf-Fe吸收实验：⁵⁹天门冬氨酸铁(⁵⁹FeAsc）是通过结合⁵⁹氯化铁_三用抗坏血酸钠溶液生成1:44的摩尔比（铁与抗坏血酸钠）。⁵⁹FeAsc或⁵⁹铁-Tf₂然后立即添加到网织红细胞中，以达到指示的最终浓度，并将细胞培养30分钟。然后在冰冷的PBS中清洗细胞，并用1 mg/mL的蛋白酶处理30分钟，以去除细胞表面与蛋白质结合的任何放射性。

将洗净的网织红细胞重新悬浮在培养基中，并在37°C下用500 nM MitoTracker CMXRos（分子探针，尤金，OR）处理20分钟。用冰镇PBS清洗样品，去除多余的探针。将样品重新悬浮在Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）中，并转移到玻璃盖片底部培养皿（MatTek，Ashland，MA）中，放置在蔡司LSM 510 meta（Carl Zeiss，Toronto，on）台上共聚焦倒置显微镜，配有加热台（37°C）和数值孔径为1.4的平面彩色100倍油物镜。在图像采集之前，添加500μL预热（37°C）Alexa Green 488转铁蛋白（AG-Tf；500 nM；Invitrogen，Carlsbad，CA）。使用多通道协议每50毫秒扫描一次样本中的每个荧光色素，生成帧速率为20/sec的显微图像。使用MetaMorph™Version 7（Universal Imaging，Molecular Devices，Sunnyvale，CA）跟踪水泡运动。

为了进行质膜标记，在补充有10%胎牛血清的IMDM中，网织红细胞或Huh7细胞分别与N-（3-三乙基氨丙基）-4-（4-（二丁基氨基）苯乙烯基）二溴吡啶（FM 1-43；分子探针）2.5μg/mL或0.5μg/mL孵育在室温下，在盖玻片底皿中放置10分钟，并使用63x物镜（NA 1.4）进行共焦显微镜检查。如有指示，在质膜标记的同时加入500 nM Alexa Green 488 Tf。

用罗丹明B-[（2,2′-联吡啶-4-基）氨基羰基]苄酯（RDA；定位于线粒体的可铁淬荧光团）装载线粒体，如前面对化学类似试剂RPA（罗丹明B 4-[（1,10-菲咯啉-5-基）氨羰基]苯酯）所述。³⁴ 简单地说，网织红细胞在37°C下在300 nM RDA中孵育25分钟，用PBS洗涤，并在37℃下重新培养20分钟。细胞在PBS中清洗，在IMDM中重新悬浮，并装载到盖好的底部培养皿中。

在Olympus IX81 TIRF（全内反射荧光）显微镜上以100X（1.45 NA）进行现场广域成像（加利福尼亚州中央山谷奥林巴斯）。电池保持在30°C（新罕布什尔州纳舒亚市光学分析公司气象站）。将488 nm（200 mW氩）或543 nm（1 mW氦氖）激光线转动，使其穿过样品，使用z488/543rpc二向色性和488/543双发射滤光片（弗吉尼亚州罗金汉姆市Chroma Technology Corp.）进行宽场激发。激光器通过光纤电缆连接到显微镜，并由AOTF（声光可调谐滤波器；威斯康星州麦迪逊市Prairie Technologies）控制。使用2台Cascade 512B相机（Photometrics，Tuscon，AZ）和配备EGFP/RFP滤波器组的双摄像头（Optical Insights，Tucson，AZ。MetaMorph软件（Molecular Devices，Sunnyvale，CA）控制着仪器。

网织红细胞在37°C下用1μM HRP-Tf（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove）培养10分钟，在冰镇PBS中洗涤3次，并用2.5%戊二醛固定。HRP是通过将固定细胞悬浮在PBS中的1 mg/mL二氨基联苯胺（DAB）溶液中，添加H₂哦₂（BioShop，Burlington，ON）至0.01%，并在室温下孵育30分钟。用PBS冲洗细胞，停止细胞生长，然后用2.5%戊二醛重新悬浮细胞，并按照前面所述的EM处理：渗透、脱水、用epon渗透和超薄切片。³⁵ 

通过视频显微照片的目视检查确定内体/线粒体接触事件。通过使用MetaMorph软件计算的多幅图像的平均投影或最大投影来确定感兴趣线粒体的强度测量区域。对52个单独的内体/线粒体接触和40多个未显示内体接触的对照线粒体，计算了随时间变化的确定感兴趣区域的强度。使用设置为0.10的负指数滤波器，在Sigma Plot软件（伊利诺伊州芝加哥SPSS Inc.）中对数据进行平均和平滑处理。图中所示图6E是所有测量曲线的平均值；误差条代表标准误差。

所有呈现的生化结果都代表了至少4个重复实验。除了图6E、 误差线代表标准偏差。

我们利用了一种以前仅用于红细胞的技术，用膜不渗透螯合剂HES-DFO装载网织红细胞的胞浆（见“材料和方法”）。为了验证网织红细胞膜与红细胞膜一样易于短暂低渗溶解和再密封，我们用异硫氰酸荧光素-提取物装载了从苯肼处理过的小鼠中采集的血细胞。为了区分红细胞和网织红细胞，随后用MitoTracker Red CMXRos标记细胞。如中所示图1A、 网织红细胞吸收了大量的荧光共轭物，同时保持了良好的形态。

在确认网织红细胞可以用高分子量化合物重新密封后，我们用HES-DFO装载这些细胞。含有细胞质HES-DFO的网织红细胞含有等量的放射性铁⁵⁹铁₂-与对照组相比，Tf转化为血红素(图1B） 表明Tf携带⁵⁹螯合剂不能截留铁。为了确认螯合剂被细胞吸收并且可以结合细胞溶质铁，将重新密封的细胞在⁵⁹铁-二氧化硅₂，一种膜透性复合物，能够为血红素生物合成提供铁。^29，36 事实上⁵⁹在含有HES-DFO的细胞中，铁转化为血红素，当我们使用这种形式的铁时，会受到影响。总之，这些数据表明，从含Tf的小泡中提取的铁可以在线粒体内膜上到达铁螯合酶，而不会进入可螯合的细胞质池。

使用巴非霉素（一种v-ATP酶质子泵抑制剂），我们建立了一组⁵⁹铁₂-网织红细胞内充满Tf的小泡。因为在水泡pH值低于5.5之前，铁不会从Tf中释放出来，当用巴非霉素处理的网织红细胞在⁵⁹铁₂-Tf，铁进入内胚体室，但仍留在其中。清除抑制剂后，放射性铁可用于血红素生物合成(图2, 60′). 用该抑制剂处理过的网织红细胞，随后用Alexa Green 488-Tf（AG-Tf）孵育，共聚焦显微镜观察到视频微间隙，其质量与在缺乏巴非霉素的情况下获得的视频微间隙相同（下文“含转铁蛋白的小泡接触线粒体”部分）。

当在添加AG-Tf之前添加到网织红细胞中时，特异性钙调素抑制剂W-7完全阻断了内吞作用（视频S1）。如果我们在AG-Tf存在下短暂37°C孵育后添加W-7，已经形成的囊泡将完全固定（视频S2）。为了研究抑制小泡运动对铁向FC传递的影响，我们首先用巴非霉素处理网织红细胞，在有铁的情况下加热细胞⁵⁹铁₂-Tf，清洗抑制剂并解开⁵⁹铁₂-来自细胞的Tf。样品在10μM的冰块上放置2小时⁵⁶铁₂-Tf取代任何表面结合的放射性铁转铁蛋白。如上所述，当这些网织红细胞被加热到37°C时⁵⁹装载囊泡中的铁被并入血红素中；然而，当在升温之前（和升温期间）将W-7添加到细胞中时，水泡的利用⁵⁹铁被堵塞(图2). 为了确保W-7不会直接抑制血红素合成，我们将网织红细胞线粒体加载到⁵⁹铁，如前所述使用琥珀酰丙酮，^18，20 洗去抑制剂，用W-7处理细胞，并在37°C下培养细胞一小时。与未处理的对照组相比，用W-7处理的细胞在血红素中的Fe掺入没有显示出任何显著的减少(图S1A、 在上可用血液网站；请参阅在线文章顶部的补充资料链接）。在另一个对照实验中，30μM W-7的存在仅对⁵⁹铁以亚铁血红素形式供应时⁵⁹铁-二氧化硅₂，一种绕过Tf受体途径的形式(图S1B） ●●●●。总的来说，这些数据表明，游离的囊泡铁不仅仅是从囊泡中输出的；细胞器的运动是将金属正确靶向线粒体所必需的。

根据我们提出的模型，^12，20，26 目前的研究进一步证实，铁向线粒体的有效转移是通过含有高浓度铁的内体与线粒体之间的短暂相互作用实现的。因此，我们预测细胞溶质中“游离”亚铁用于血红素合成的效率相对较低。因为DMT1在内吞前存在于细胞表面³⁷ 在pH值7.4时也能发挥作用，³⁸ 我们有可能通过在有⁵⁹铁（II）-抗坏血酸。令人惊讶的是，在pH 7.4时，抗坏血酸亚铁的吸收效率高于铁₂Tf（传递函数）(图3)，在较高浓度下，表明DMT1在Fe中没有限制₂Tf铁吸收。重要的是，即使细胞摄取量增加了2倍以上（以每个细胞为基础）⁵⁹当⁵⁹使用铁（II）-抗坏血酸与⁵⁹铁₂Tf；在2μM下，两种形式的吸收量大致相等，但Tf样品的血红素中铁的百分比约为92%，而抗坏血酸亚铁样品的百分比仅约为24%。出乎意料的是，浓度依赖性实验(图3A） 表明Tf铁吸收饱和（在低微摩尔范围内），而相对较高水平的铁天门冬氨酸没有饱和非Tf吸收系统。我们假设这反映了网织红细胞内非血红素形式铁的积累。此外，铁掺入血红素的时间依赖性通常在使用时观察到⁵⁹当我们使用⁵⁹铁（II）-抗坏血酸(图3B） ●●●●。这些发现强调了Tf-Tf受体途径在铁高效用于血红素合成中的关键作用。

为了观察内体小泡相对于线粒体的运动，我们使用共焦显微镜检查双重荧光标记的细胞。将带有MitoTracker红CMXRos染色线粒体的网织红细胞培养在500 nM AG-Tf的加热（37°C）共聚焦显微镜台上。以每秒20帧的速度采集图像，以便实时评估含转铁蛋白内体的X-Y位置；将细胞加入Tf溶液后20分钟内，记录所有视频显微照片。AG-Tf的结合和内化立即发生。至少3个含有荧光绿色标记的细胞器群可以被区分(图4A；视频S3）：（1）小，活动性极强，（2）大，活动性中等，（3）大，主要是不动的小泡。在20秒的视频捕获中，可以看到前两种动物暂时与一个或多个线粒体相邻。较大的细胞器和线粒体之间的相互作用通常比较小的小泡的作用短暂。此外，我们在X-Y平面上定量追踪了最具运动性的囊泡，发现它们的平均速度为2.77（±0.43μm/s）。这些视频清楚地表明₂-含Tf的小泡大量渗入网织红细胞胞浆，反复靠近或接触线粒体。

使用TEM，我们证实了含有Tf的内体确实接触到这些细胞中的线粒体。通过HRP-Tf染色鉴定的囊泡要么作为内体网络的一部分出现(图，4B-C）或孤立囊泡(图4D） 。Stoorvogel等人之前观察到类似于我们在这里记录的网状内体³⁹ 我们观察到的单个结构很可能只是网络的横截面。重要的是，这两种结构似乎都与线粒体密切相关(图4B-D）。通过DAB处理，HRP标记的细胞隔室的发展使我们能够可视化含有Tf的细胞隔室内。在没有应用结合蛋白的细胞中，我们无法可视化内体网络。我们推测，单靠渗透作用不足以标记网织红细胞中的这些细胞器，因为高浓度的血红蛋白减弱了样品的对比度。

为了研究在我们的实时成像系统中，含Tf的内体与囊泡和其他一些货物相比是否特异或更频繁地“接触”线粒体，我们用AG-Tf和FM 1-43标记网织红细胞，这是一种靶向膜磷脂的荧光探针。有趣的是，当这些双标记网织红细胞在全培养基（含10%胎牛血清）中孵育时，所有内吞囊泡都含有转铁蛋白(图5A） ●●●●。这些数据表明，网织红细胞的绝大多数内吞机制被Tf占据，Tf存在于所有观察到的囊泡中，与FM 1-43共定位。作为阳性对照，我们对Huh7（肝细胞系）进行了类似标记，并显示膜磷脂内吞到缺乏荧光转铁蛋白的囊泡中(图5B） ●●●●。此外，我们无法在网织红细胞中观察到荧光胰岛素的任何摄取，而它很容易在Huh7细胞中被内吞（数据未显示）。

为了研究观察到的细胞器间接触是否为功能性相互作用，我们用荧光金属传感器将网织红细胞的线粒体加载，并在异铁转铁蛋白的内吞过程中监测其强度。罗丹明B-[（2,2′-联吡啶-4-基）氨基羰基]苄酯（RDA）已显示在线粒体中积聚，以膜电位依赖的方式，并被铁淬火。⁴⁰ 使用AG-Tf进行实时成像，利用488 nm（Ar）和543 nm（He-Ne）激光直接穿过物镜的扩展光束，通过宽场照明对内体（如上所述）进行专门标记。当内体似乎与线粒体接触时，一直观察到线粒体信号的快速猝灭(图6; 视频S4）。在时间序列中，通过测定包括线粒体在内的感兴趣区域内的红色荧光信号强度，来评估内吞体邻近性和RDA淬灭之间的关系。注意，当线粒体表现出这些接触事件时(图6A、 白色方框，放大图6D） 显示平均荧光强度下降(图6C、 白色方框放大图6D） ，周围线粒体的强度（由中的箭头指示图6C） 有时会随着时间的推移略有增加。对“接触”线粒体（n=52）的分析表明，铁敏染料的荧光强度平均下降10%，指数衰减半时间为0.28（±0.05 s；r²= 0.88;图6E） ●●●●。相比之下，线粒体内RDA的平均强度在一段时间内保持相当稳定，这些线粒体似乎没有与内体相互作用。

先前提出并被传统接受的铁摄取系统的一个组成部分是低分子量的细胞质结合部分。该中间体将作为伴侣，介导从内胚体囊泡到血红素生物合成位点线粒体的转移。LIP的想法最初是由格林伯格和温特罗布于1946年提出的⁴¹ 还有罗斯的作品，⁴² 同年，他们两人都使用了放射性示踪实验的数据来确定体内铁的“代谢池”可以用于红细胞生成。雅各布斯修改了这一概念，他推测红系和非红系细胞中都存在不稳定的低分子量铁中间产物。^23，24 尽管如此，在LIP概念提出40多年后，这种螯合细胞铁的性质仍未被揭示。LIP存在的唯一支持性证据来自体外实验，表明膜透性螯合剂能够结合培养细胞（包括网织红细胞）中的非血红素铁。然而，在这些研究中，这种铁的细胞内来源充其量只能模糊地确定^17，28，43 ; 螯合剂从细胞器或膜成分中剥离铁的可能性与从细胞质中剥离铁相同。因此，所谓的LIP是由实验者的螯合剂能够结合的铁的量来定义的。在本研究中，我们通过用HES-DFO重新密封网织红细胞来克服使用渗透性螯合剂的这种模糊性，从而表明泡状铁不会被运输到胞质溶胶中。

使用电子显微镜，我们证明含转铁蛋白的内体与线粒体接触，而从荧光显微镜数据中我们表明，这种接触导致可螯合线粒体铁的增加。这些瞬态接触很可能取决于分子马达和对接复合物的活性。血红蛋白缺乏症基因突变的最新发现(乙型肝炎)鼠标，^44，45 其网织红细胞显示转铁蛋白循环减少，^46，47 进一步支持内体运动是必要的这一观点，因为该基因的酵母同源物，第15l1节已知与囊泡对接有关。根据Provance等人的最新发现，我们预计肌球蛋白Vb是这一运动的主要贡献者。⁴⁸ 以前，人们可以设想一种机制，即囊泡只需形成，就可以使铁周围的微环境酸化₂-Tf络合物与金属还原成Fe²⁺前一种模型只需要很少或根本不需要移动形成的囊泡，因为游离和还原的铁随后会离开细胞器进入“LIP”。考虑到我们的结果，铁从内体转移到线粒体的最吸引人的模型是一种短暂但亲密的模型，这两个细胞器之间的关系有助于金属的直接转移，绕过任何自由的细胞溶质中介。由于内体膜和线粒体膜的独特性质，以及我们没有观察到荧光转铁蛋白向线粒体泄漏的事实，这两个隔室是否真的融合值得怀疑，相反，我们认为铁从内体蛋白传递到线粒体蛋白。

网织红细胞胞浆中存在一种强铁螯合物，对⁵⁹铁₂-Tf转化为血红素。可能有人认为，仍可能存在一种细胞质伴侣，它紧密结合囊泡衍生铁并将其穿梭到线粒体，从而保护其免受HES-DFO的螯合作用。然而，这不太可能，因为当Fe以Fe-SIH的形式交付时₂细胞溶质HES-DFO可有效阻止其并入血红素。人们可以预期，如果存在从囊泡中穿梭铁的“不稳定”部分，并且能够比HES-DFO更有效地结合铁（DFO对铁的亲和力为10⁻³³)，它同样能够从Fe-SIH中螯合Fe₂螯合物。此外，马丁内斯·梅德林和舒尔曼²⁷ 观察到，当用⁵⁹Fe-Tf，放射性铁仅在血红蛋白或基质结合分数中可见。此外，Schranzhofer等人最近的研究⁴⁹ 随着细胞分化，红系祖细胞中胞浆铁调节蛋白对Tf-衍生铁的敏感性降低。总之，这些结果与我们的Hb合成细胞铁传递模型一致，即金属不进入细胞溶质，而是迅速从内体穿梭到血红素合成部位。值得注意的是，我们的实验仅限于网织红细胞，因此，我们不能忽视这种途径是血红蛋白合成细胞所特有的可能性。鉴于这些细胞在铁代谢方面存在着深刻的差异，这并非不可能。¹² 

自摩根和阿普尔顿开创性地发现Tf内在化以来，20多年过去了⁵⁰ 进化成一个明确证明的内吞模型，^{51，，，——55} 铁的后内体途径仍然完全是个谜；唯一出现的模型是一个调用了神秘的“LIP”的模型，据称LIP是内吞体和线粒体之间的中介。本文报道的结果通过描述含Tf的内体将其铁原子直接让渡给线粒体的细胞内铁转运机制，对这一概念提出了挑战，这是首次证明器官间相互作用具有促进微量营养素运输的功能性后果。重要的是，这可能是细胞中铁运输的一般模式，因为有大量文献表明含Tf-TfR的内体向各种细胞内结构移动，如高尔基复合体、内质网和核周结构（在Kühn等人，⁵⁶ 蓬卡和洛克，⁵⁷ Maxfield和McGraw⁵⁸ ). 不幸的是，几乎所有这些研究都使用Tf作为标记物，而没有考虑蛋白质的实际功能。由于Tf的唯一已知功能是通过循环向细胞输送和传递铁，因此含有Tf的内体向各种细胞内结构的运动可能与向这些细胞器输送铁有关。

P.P.感谢海洋生物实验室（马萨诸塞州伍兹霍尔）、B.Speck、Quantomix（以色列Rehovot）和Universal Imaging（加利福尼亚州桑尼维尔）的协助和支持。作者感谢Biomedical Frontiers，Inc.对HES-DFO的慷慨捐赠，R.Sustmann和U.Rauen博士对RDA的慷慨和帮助，以及Jim Seams、S.Graf、E.Corson、H.Valli博士和J.Mui的技术支持。作者还感谢R.Lill博士、P.Macpherson、H.McBride、R.Johnstone、M.Vidal、P.Stahl和P.Tupper博士的建议，以及E.Cook博士在数据分析方面的协助。

P.P.的研究部分由加拿大卫生研究院（CIHR）的拨款资助。O.S.的研究由美国国立卫生研究院（NHLBI）资助。A.S.由CIHR的学生奖学金资助。

贡献：A.D.S.、A.-S.Z.、O.S.和P.P.构思了实验。A.D.S.进行了这些研究，并在P.P.、O.S.和C.B.的概念和编辑帮助下撰写了这篇论文，他们也对数据进行了分析。O.S和P.P.对这项工作的贡献相等。

利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。

通信：普伦·蓬卡，戴维斯夫人医学研究所，科特街3755号-加拿大QC H3T 1E2，Montréal，Catherine Rd.，电子邮件。prem.ponka@mcgill.ca