HeLa细胞线粒体ABCB7转运体RNA沉默导致铁缺乏表型和线粒体铁超载

铁在所有真核生物的各种重要功能中都是必不可少的，包括呼吸、基因调节、DNA复制和修复。然而，铁也具有潜在毒性，其体内平衡失调可能导致各种血液学、代谢和神经退行性疾病。¹ 线粒体在铁代谢中起着核心作用，因为线粒体是合成血红素和铁硫（Fe/S）蛋白质的场所，² 线粒体铁的失调与某些疾病有关。^三 其中包括Friedreich共济失调，这是由缺乏frataxin（一种参与线粒体铁转运的蛋白质）引起的⁴ ; 与红细胞特异性ALAS2缺乏相关的X连锁铁粒细胞性贫血（XLSA）⁵ ; 和XLSA/A，X连锁铁粒细胞性贫血伴共济失调，与ABC转运体ABCB7缺陷相关。⁶ 我们对线粒体铁转运的大多数理解来自于对S酿酒这表明细胞器是合成Fe/S簇合物的唯一场所，并且这种活性对细胞至关重要。^2,7 这种生化途径需要10多种不同的成分，包括半胱氨酸脱硫酶Nfs1p；支架蛋白Isu1p/Isu2p；监护人；以及氧化还原酶Arh1p、Yah1p和戊二氧还蛋白-5。² Fe/S生物合成的功能对于线粒体外Fe/S酶的组装也至关重要，包括Leu1p和Rli1p，后者参与核糖体的生物生成^8,9 ; 但生物合成需要一组辅助蛋白质，包括名为Atm1p的ABC转运体、线粒体膜间空间的巯基氧化酶Erv1p、谷胱甘肽、细胞溶质P-loop NTPase Cfd1p/Nbp35p和细胞溶质铁氢化酶样Nar1p。¹⁰ 线粒体在细胞铁稳态中的中心地位也由酵母铁调节子依赖于Fe/S生物发生的证据表明。^11,12 线粒体Fe/S生物合成的任何蛋白质失活都会导致大量线粒体铁沉积，高达正常值的30倍；线粒体Fe/S酶如顺乌头酸酶和琥珀酸脱氢酶（SDH）的改变或抑制；非发酵培养基上缺乏生长；以及氧化损伤的迹象。¹³ 相反，Fe/S输出蛋白质的失活，如Atm1p，会导致线粒体铁积累，而不会对线粒体酶产生重大影响。⁷ 这些蛋白质中的大多数在哺乳动物细胞中具有同源物，但除frataxin外，对这些细胞中Fe/S生物发生的研究相对较少。¹⁴ 最近，研究表明，Fe/S途径的一些关键酶，半胱氨酸脱硫酶ISCS，以及支架蛋白ISCU和NFSU表现出选择性剪接，产生细胞溶质和线粒体蛋白。^15-17 细胞溶质形式已被分离并发现具有功能，并且证明细胞溶质ISCU蛋白参与细胞溶质Fe/S蛋白的合成，如IRP1/c-乌头糖。^15,16 然而，其他报告显示，线粒体Nfs1的缺失抑制了哺乳动物细胞中细胞溶质Fe/S蛋白的形成，^18,19 半胱氨酸脱硫酶的胞浆形式的表达并不能修复缺陷。¹⁸ 

ABCB7是Atm1p的人类同源基因，它在酵母中的表达弥补了Atm1p缺乏的缺陷。²⁰ ABCB7的三种不同突变与铁粒细胞性贫血伴共济失调和小脑发育不全（XLSA/A，OMIM301310). 它们由蛋白质跨膜结构域边界处的错义突变（I400M、E433K和V411L）组成，被发现只能部分修复Atm1p缺陷酵母的缺陷。⁶ 一项对红系细胞的研究表明，ABCB7的表达通过与铁螯合酶的C末端结合来提高铁螯合蛋白酶的活性。²¹ 最近对缺乏ABCB7的小鼠的研究表明，该蛋白在妊娠早期至关重要。除肝脏和内皮细胞外，包括CNS和骨髓在内的大多数器官中ABCB7的系统性和组织特异性缺失是致命的。²² 肝特异性ABCB7缺失导致门脉周围肝细胞铁沉积，具有特征性的圆形结构，其起源尚不清楚；TfR1表达的强烈上调，与IRP1的激活一致；以及铁蛋白的轻微增加。²² 令人惊讶的是，没有观察到线粒体铁超载，含铁/硫复合物的线粒体酶（如铁螯合酶、间乌头酸酶和琥珀酸脱氢酶）的活性仅受到轻微影响，而胞浆酶（如c-乌头酸酶或黄嘌呤氧化酶）的活性则显著降低。²² 这些结果证实了转运体在细胞铁稳态中起主要作用，但并没有阐明为什么ABCB7缺乏可能导致铁粒细胞贫血和运动障碍。我们使用了一种更简单的方法来分析培养的HeLa细胞中ABCB7缺乏的影响。我们描述了使用siRNAs沉默蛋白质的条件，我们发现ABCB7抑制导致细胞增殖强烈减少，细胞内铁缺乏伴随线粒体铁蛋白无法获得的大量铁沉积。原卟啉的积累和线粒体铁可用性的降低可能部分解释了贫血的发生。

为了通过体外转录产生双链siRNA，我们遵循了Donze和Picard中描述的程序。²³ 简言之，我们产生了脱氧寡核苷酸，其中22个正或反义序列的核苷酸（nts）位于TATAGTAGTCGTATTA序列的3′端，与T7启动子互补。序列如下：ABCB7-871（起始密码子871nt处），GTGCCCAGTTGCTTTGGTAAC；ABCB7-792（距起始密码子792 nt处），CTGAGTGCTTTGGTATTTAATC；和ABCB7-1663（起始密码子1663 nt处），ATGCTGTCCTTCCATAATAC。所有序列均以T 7聚合酶活性所必需的G和C终止。将寡核苷酸与T7聚合酶的引物退火，并加入酶。对2个互补转录物进行退火、聚丙烯酰胺电泳分析，并用于转染。在大多数实验中，我们使用合成的双链ABCB7-792 siRNA，它和扰乱的siRNA一样，是由Qiagen Xeragon（Germantown，MD）生产的。

HeLa细胞在RPMI培养基（Life Technologies，Invitrogen，Bethesda，MD）、10%胎牛血清（Clontech，Palo Alto，CA）、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素和1 mM我-谷氨酰胺。使用体外转录的siRNA，10⁵将细胞/孔接种在12孔板中，第二天使用寡粪胺（英国佩斯利Invitrogen）转染100 pmol ds-siRNAs，按照制造商的指示，培养72小时，然后收获并分析。使用合成siRNA（ABCB7-792），HeLa细胞在第1天和第4天接受2轮转染，并在第7天收获。为了验证转染效率，在与对照相同的条件下转染HeLa细胞，用罗丹明（Qiagen-Xeragon）标记非沉默ds-siRNA，荧光显微镜下检查显示90%以上的细胞被标记。

为了评估细胞活力，对转染后第7天的HeLa细胞进行计数，并培养3天。然后对所有细胞进行计数和台盼蓝排除评估。或者，在转染后第6天，2×10⁴将细胞接种在96周的平板中，并在37°C的0.1 mL培养基中再培养24小时，然后添加10μL甲基噻唑四氮唑溶液，5 mg/mL磷酸盐缓冲液（MTT；Sigma，St Louis，MO），并培养3小时，在570 nm处读取显色。H的细胞毒性₂哦₂如前所述进行了研究。²⁴ 简言之，转染后第6天，2×10⁴每个孔的细胞接种在96个培养皿中，生长18小时，然后用不同浓度的H清洗和处理₂哦₂在无血清培养基中培养2小时。将平板清洗两次，用MTT孵育3小时后测量细胞活力，如上文所述“HeLa细胞转染”

转染后第7天用2μCi/mL（0.074 MBq）培养HeLa细胞3小时(⁵⁵铁）柠檬酸铁铵（FAC），如前所述。²⁵ 将细胞清洗，在0.2 mL裂解缓冲液中裂解，并离心，将5μL可溶性部分与1 mL安全液体闪烁鸡尾酒（Beckman，Hialeah，FL）混合，并在闪烁计数器中计数5分钟。如前所述，为了分离线粒体和线粒体后组分，用0.01%洋地黄素处理细胞，然后进行2次差速离心。²⁶ 可溶性蛋白在7%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上进行，干燥的凝胶暴露于放射自显影。在线性范围内，通过密度测定法定量铁蛋白亚基带的强度。

按照制造商的说明（伊利诺伊州雅培公园雅培实验室），采用商业血清铁蛋白测定法测定L-铁蛋白水平。通过基于特异性单克隆抗体和重组H铁蛋白的酶联免疫吸附试验（ELISA）评估H铁蛋白水平。²⁷ 在免疫印迹实验中，在12%的SDS-PAGE上加载30μg可溶性蛋白。转移后，将硝化纤维过滤器与特定抗体孵育16小时，然后清洗，再与二级过氧化物酶标记抗体孵养1小时（丹麦格洛斯特鲁普达科）。结合活性通过高级增强化学发光（ECL）试剂盒（瑞典乌普萨拉阿默沙姆）显示，并使用KODAK Image Station 440CF（纽约州罗切斯特柯达）检测。使用的主要抗体为小鼠抗TfR1抗体（1:1000；Zymed，加利福尼亚州南旧金山）、兔抗聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（抗PARP）p85片段（1:700；Promega，麦迪逊，威斯康星州）、兔抗凝素抗体（1:100；Sigma）、兔反铁蛋白抗体（1:2000；Sigma-）、鼠抗MtF抗体、，兔抗MnSOD抗体（1:4000；Upstate，Billerica，MA）和兔抗凝血素抗体（1:2000）。²⁸ 

用于确定ATP水平，1×10⁴将细胞接种在96周的培养黑板（Corning，Corning，NY）中，并用相同体积的CellTiter-Glo-Luminescent Cell Viability Assay（Promega）进行裂解，并对发光进行分析。为了测定乌头糖、柠檬酸合成酶、琥珀酸脱氢酶和超氧化物歧化酶的活性，我们采用了前面描述的方法。^29-32 根据制造商的说明，使用ANNEXIN V:FITC检测试剂盒（Serotec，Martinsried/慕尼黑，德国）通过流式细胞术测量细胞凋亡。使用红色荧光染料JC-1（Invitrogen–Molecular Probes，Eugene，OR）测量线粒体膜电位（ΔΨ）。通过流式细胞术评估原卟啉含量，如Luksiene等人。³³ 

根据制造商的说明，使用硫氰酸胍-苯酚-氯仿法从细胞中纯化RNA（RNAwiz；Ambion，Austin，TX）。DNase处理的总RNA（1μg）用于用ImProm II逆转录系统（Promega）合成第一链cDNA，使用寡核苷酸。为了进行实时PCR分析，根据制造商的说明，使用了Applied Biosystems（加利福尼亚州福斯特市）的Assays-on-Demand产品（20×）和TaqMan Master Mix（2×），并在ABI PRISM 7700序列检测系统（Applied生物系统）上进行反应，最终体积为25μL，持续40个周期。我们分析了ABCB7和frataxin的表达水平，并将结果归一化为每个样本中的GAPDH水平。

Student对模拟细胞和转染细胞的值进行了比较t吨测试未配对数据。差异被定义为对P（P）值小于0.05。

我们最初通过体外转录产生用于ABCB7沉默的3 ds-siRNAs，并为其在HeLa细胞中的转染建立了条件。siRNAs靶向从nts 792、871和1663开始的mRNA序列。ABCB7转录物的实时RT-PCR分析表明，转染48小时后抑制水平达到最高，并且在100 pmol/well浓度下使用的3个siRNAs有效，剩余转录物水平低于对照和模拟转染细胞的30%(图1A） ●●●●。其中最强大的是792，它是通过化学合成和优化使用而产生的。在100 pmol/孔的浓度下，它对ABCB7的抑制率高达90%，通过进行2次连续转染，抑制可维持长达7天(图1B） ●●●●。这些条件意味着在第1天和第4天转染siRNA-792，并在第7天采集细胞，这些条件已用于以下研究。

ABCB7沉默的第一个明显效果是细胞生长减少。在第一轮和第二轮转染后，用3种siRNA中的任何一种转染的细胞比匹配的模拟转染细胞（未显示）达到融合。台盼蓝阳性细胞占沉默细胞和对照细胞中总细胞的4%，表明siRNAs不会导致细胞死亡。因此，我们分析了第二轮转染后3天排除染料的活细胞数量。在沉默细胞中，这大约是模拟转染对照细胞在相同条件下培养和生长的50%(图2A） ●●●●。当同样数量的细胞接种并生长24小时时，沉默细胞的MTT活力仅为对照细胞的60%左右(图2B） ●●●●。用特异性抗体进行免疫印迹，未显示PARP片段，流式细胞术也未显示annexin V（未显示）的激活，这两种都是公认的凋亡迹象。此外，我们没有观察到LDH的显著释放，这是坏死过程活跃的标志（未显示）。因此，沉默细胞中细胞活力的降低似乎是由细胞增殖率的降低而不是细胞死亡的增加引起的。

细胞溶胶乌头酶/IRP1是一种Fe/S酶，因此评估其活性是否受到ABCB7沉默的抑制是很有意义的。在初步分析中，我们测量了总细胞提取物和线粒体后部分中的乌头糖活性，发现它们在沉默细胞中分别减少到约50%和40%(图3A） ●●●●。为了进行更准确的分析，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离细胞提取物，并开发乌头酶活性。¹⁷ 线粒体部分中恢复较慢且更丰富的酶带代表线粒体乌头糖酶（m-aco），而线粒体后部分中恢复较快的酶带则由细胞溶质乌头糖（c-aco）组成(图3B） ●●●●。ABCB7沉默导致约50%的m-aco和80%以上的c-aco减少(图3B） 通过Western blotting（未显示）测定，c-aco蛋白没有减少。如前所述，用铁螯合剂去铁胺（DFO，1 mM）处理细胞18小时也能获得类似的效果。¹⁷ 我们还用羰基氰化物间氯苯基腙（CCCP，30μm）处理细胞18小时，以消除线粒体膜电位并抑制细胞器中的铁吸收。⁷ 这导致m-aco和c-aco受到抑制，与ABCB7沉默所观察到的抑制类似。当用CCCP或DFO处理沉默细胞时，m-aco的活性被进一步抑制80%以上，而c-aco的活力几乎无法检测到。DFO和CCCP处理增加了从平板上脱落的不活细胞的比例（分别约为20%和50%）。我们只分析了活细胞，SDS-PAGE显示出一种蛋白模式，与对照的未处理细胞（未显示）无法区分。这一发现表明，ABCB7缺乏通过减少铁通过线粒体的转运来抑制c-aco中Fe/S的形成。

沉默细胞中c-aco活性的降低是细胞铁饥饿的一个指标。H和L铁蛋白是铁状态的其他可靠指标，ELISA测定的它们在沉默细胞中的水平与对照组相比不足三分之一(图4A） ●●●●。铁蛋白水平的降低在使用L-铁蛋白特异性抗体的免疫印迹中更加明显(图4B） ●●●●。印迹法还显示，沉默细胞中转铁蛋白受体1（TfR1）的水平增加了2倍(图4C） ●●●●。因此，所有指标都表明ABCB7沉默导致铁缺乏表型。为了更直接地分析细胞铁稳态，将细胞与放射性柠檬酸铁铵孵育3小时，⁵⁵Fe-FAC，然后进行分析。沉默细胞中的总铁掺入量比对照细胞低20%左右，但亚细胞分布存在主要差异。⁵⁵铁主要积聚在对照细胞的胞质部分，而在ABCB7沉默细胞的胞液和线粒体部分中，铁的分布相似。例如⁵⁵对照组线粒体后和线粒体部分的Fe浓度高于7:1，沉默细胞中的Fe浓度约为0.7:1(图5A） 这表明铁主要从胞浆转移到线粒体。接下来，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上对匀浆进行分馏并进行放射自显影。这显示了与胞质铁蛋白相对应的单一条带，其密度在对照中比沉默细胞中高约2倍，无论是在总匀浆中还是在线粒体后部分中(图5B） ●●●●。线粒体部分仅显示一条与细胞溶质铁蛋白（可能是一种污染物）相对应的小条带，而线粒体铁蛋白则无法检测到(图5B） ●●●●。因此，HeLa细胞中ABCB7的沉默导致胞浆中铁蛋白结合铁的减少，以及与任何特定蛋白质不牢固结合的线粒体铁的大量增加，而不会诱导线粒体铁蛋白的表达（未显示）。

为了验证ABCB7沉默和线粒体铁沉积是否影响抗氧化损伤的抵抗力，将细胞与不同浓度的H孵育2小时₂哦₂，然后用MTT法分析细胞活性。由此获得的2个曲线图在统计上存在差异(P（P）=0.009），ABCB7沉默的细胞比模拟转染的对照细胞更陡峭。对照组50%的抑制值约为500μM，小于200μM H₂哦₂对于沉默的细胞(图5C） ●●●●。因此，ABCB7缺乏导致对H的敏感性显著增加₂哦₂.

原卟啉IX增加是XLSA/A的特征，因此我们评估这是否发生在沉默的细胞中。利用分子的荧光特性，通过流式细胞术评估原卟啉水平。³³ 对照细胞中的基础荧光水平较低，与HeLa细胞中卟啉合成水平较低一致，但在沉默的细胞中增加。在4个不同的实验中，我们发现信号平均增加了1.33倍；P（P）= .008 (图6D） ●●●●。在沉默细胞中，线粒体Fe/S酶琥珀酸脱氢酶的活性降低了约20%，但差异无统计学意义。柠檬酸合成酶是一种线粒体无铁酶，其活性不受ABCB7沉默的影响(图6A） ●●●●。JC-1染色未显示线粒体膜电位的明显改变（未显示），而沉默细胞中的总ATP含量高于对照细胞（约1.5倍）(图6B） ●●●●。这些数据表明线粒体功能没有因ABCB7缺乏而受损。据报道，在酵母中，Atm1的抑制导致了frataxin在mRNA和蛋白质水平的下调，³⁴ 我们评估了我们的系统中是否也发生了同样的情况。定量实时RT-PCR未显示frataxin和铁螯合酶mRNA水平的显著改变（数据未显示）。然而，用抗共济蛋白抗体进行的印迹显示，ABCB7沉默导致蛋白质成熟形式的显著减少，同时伴随着较轻的降解产物的相对增加(图6C） ●●●●。这表明frataxin减少，可能是因为降解速度加快。

此前研究表明，线粒体铁蛋白在HeLa细胞中的表达会导致铁从胞浆转移到线粒体，^25,35,36 与ABCB7沉默引起的情况类似。因此，比较这两种细胞模型很有意义。为此，我们在亲本HeLa细胞和表达MtF的HeLa克隆（MtF克隆）中并行沉默ABCB7。将细胞与⁵⁵Fe和2个克隆中的总铁掺入量没有显著差异（未显示）。对匀浆进行分级，分析线粒体和线粒体后部分的铁含量，并将数据绘制为线粒体占细胞总铁的百分比。这在对照HeLa细胞中约占10%，在ABCB7沉默后增加到45%。线粒体铁在MtF克隆中约占40%，且不受ABCB7沉默的影响(图7A） 可能是因为线粒体铁掺入机制饱和。沉默导致与胞浆铁蛋白结合的铁减少(图7B） 和H-铁蛋白(图7B） 类似于在HeLa细胞中观察到的情况(图5B） ●●●●。令人惊讶的是，在ABCB7沉默的细胞中，总细胞匀浆和线粒体部分中MtF结合铁的条带强度显著降低(图7B） ，MtF蛋白没有显著下降(图7C） ●●●●。这表明铁蛋白没有多余的铁。我们分析了细胞中的超氧化物歧化酶活性，因为研究表明线粒体Mn-SOD（SOD2）的活性受酵母中线粒体铁负荷的影响。³⁷ ABCB7沉默不会改变细胞溶质SOD1，而SOD2在亲本HeLa细胞中受到强烈抑制，但在MtF克隆中仅略微减少。用特异性抗体印迹表明SOD2蛋白水平不受影响，因此ABCB7沉默导致SOD2活性的抑制(图7D） ●●●●。因此，当它发生在酵母中时，ABCB7沉默引起的铁过量可能与锰竞争结合SOD2。

ABCB7是酵母Atm1的功能同源物，Atm1是一种参与细胞溶质Fe/S蛋白成熟的线粒体膜蛋白。^20,38 小鼠模型显示，除肝脏和内皮细胞外，包括CNS和骨髓在内的大多数组织中ABCB7的缺失是致命的，²² 但没有阐明其缺陷是如何影响血红素合成或产生神经元缺陷的。因此，ABCB7在铁粒细胞性贫血伴共济失调（XLSA/A）发生中的作用尚不清楚。我们通过转染不同的特异性siRNA，找到了有效抑制HeLa细胞中ABCB7的条件。我们开发的所有siRNAs都是功能性的，导致转录水平下降约为对照的10%。沉默导致细胞增殖大幅下降，从而阻碍了获得稳定克隆的可能性。为了更好地表征表型，我们通过进行连续的siRNA转染将蛋白质的抑制延长至7天。培养哺乳动物细胞中的生长缺陷已被描述为线粒体半胱氨酸脱硫酶m-Nfs1的缺失^18,19 以及frataxin，³⁸ 以及在酵母中消耗Atm1p^39,40 以及其他参与Fe/S生物生成的蛋白质。⁷ 这归因于参与蛋白质合成的胞质/细胞核Fe/S蛋白（如Rli1p）成熟的缺陷。^8,9 用0.1或1 mM FAC补铁不能逆转ABCB7缺乏引起的生长缺陷，这表明这不是由于缺铁，而是可能是由于细胞溶质Fe/S蛋白生物合成的放松调节，并可能导致模型小鼠的死亡。

ABCB7缺乏的另一个重要影响是线粒体中铁的大量积累，约为对照的6倍。这与Atm1p缺乏的酵母细胞中发现的情况类似，线粒体铁积累比对照高出30倍，⁷ 证实这2个蛋白是参与细胞器铁流出的功能同源物。³⁹ 在ABCB7被特异性灭活的小鼠肝脏中未观察到线粒体铁沉积，²² 这一发现归因于肝脏中铁代谢的独特控制或ABCB6线粒体转运体的组织特异性高表达。²² 然而，最近发现ABCB6是一种位于线粒体外膜上的卟啉转运蛋白，⁴¹ 因此，它不应促进Fe/S运输。与酵母中的情况类似⁷ 在小鼠肝脏中，²² HeLa细胞中ABCB7缺乏不会导致线粒体活性的主要缺陷，因为SDH活性、膜电位和ATP含量不低于对照细胞。然而，线粒体的大量铁负荷预计会促进HeLa细胞的氧化损伤。事实上，我们可以观察到对H的敏感性增加₂哦₂毒性，但氧化背景水平似乎正常。这与这些培养的哺乳动物细胞的低呼吸活性相一致，它们消耗很少的氧气，并产生少量的活性氧，这些活性氧会与游离铁反应生成有毒自由基。因此，我们的细胞模型中缺乏明显的氧化损伤，并不能证明线粒体铁过量在体内是无害的，尤其是在像大脑基底神经节那样具有高铁需求和呼吸活动的细胞中。⁴² HeLa细胞和小鼠肝脏中ABCB7缺乏导致细胞铁稳态发生重大改变，IRP1/c-aco的IRE-BP活性激活，TfR1上调。在HeLa细胞中，这与铁蛋白合成受到强烈抑制的明显缺铁表型相对应，部分归因于铁从胞浆向线粒体的转移，而线粒体不能被转铁蛋白铁摄取所补偿。在小鼠肝细胞中，细胞溶质铁蛋白水平略有增加，可能是由于TfR1的组成性激活导致铁内流增加，而Tf R1可以获得循环铁转运蛋白，或其他代偿机制。²² 

在XLSA/A中，小细胞性贫血伴随着线粒体铁超载和红细胞原卟啉（主要是锌原卟啉）的积累。^6,43-45 因此，即使存在过量的血红素分子的2种组分，也会出现血红素合成缺陷。人们提出了不同的假设。一种是ABCB7结合铁螯合酶并增加其活性，²¹ 但这与患者的大多数红细胞原卟啉与锌、，^43,44 铁螯合酶催化的缔合物，⁴⁶ 在小鼠模型中，铁螯合酶活性没有受到抑制。²² 第二种是ABCB7缺乏导致IRP1激活，从而下调含有ALAS2的IRE，从而降低血红素合成。²² 在谷胱甘肽5缺乏的设拉子斑马鱼模型中发现了这种情况，这也显示了红细胞中线粒体铁的积累，但这伴随着原卟啉的抑制。⁴⁷ IRP1的激活似乎发生在我们沉默的细胞中，但它并不抑制原卟啉的合成。IRP2的发现表明IRP在血红素合成中的作用^−/−小鼠积累红细胞原卟啉，⁴⁸ 但这可能是由于局部缺铁所致。对贫血的一个更可能的解释是，在ABCB7缺乏症中积累的铁不能有效地用于血红素合成。与模拟转染对照细胞相比，ABCB7沉默细胞中的铁过量对线粒体铁蛋白（MtF）的利用率很低，这一发现支持了这一假设。这表明ABCB7缺乏限制了MtF和二茂铁螯合酶可用的游离Fe（II）离子库，从而导致游离原卟啉的增加。我们观察到的frataxin稳定性的降低也可能是由apo蛋白的积累引起的，apo蛋白可能不如Fe结合形式稳定。最近，通过对线粒体Mn-SOD（SOD2）的分析，证明了酵母中存在生物学上不同的线粒体铁库。³⁷ 一个被称为SOD2-reactive的池，与线粒体锰竞争使SOD2失活，在线粒体转运体和Fe/S生物合成蛋白质缺失的菌株中增加，如谷胱甘肽-5或ssq1，从而导致局部铁积累。另一个池，称为SOD2惰性，不影响SOD2活性，并且在野生型和frataxin缺陷细胞中显著。³⁷ 我们发现ABCB7沉默细胞中的线粒体铁超载抑制SOD2活性，表明哺乳动物细胞中也存在SOD2反应池。我们的研究结果提出了一种可能性，即SOD2反应池是由铁组成的，用于Fe/S合成，因此铁蛋白或铁螯合酶不可用，这一假设需要得到证实。

线粒体铁的积累在红细胞中尤为明显，在红细胞里，大多数身体铁转运用于血红蛋白合成。环形铁粒细胞（或小鼠铁粒细胞）的形成可能是由各种不同的机制引起的。在最常见的后天性铁粒细胞性贫血（SA），即环状铁粒细胞难治性贫血（RARS）中，铁粒细胞表达高水平的MtF。^49-51 由于在XLSA中也发现了ALAS2缺陷，⁴⁹ 最初认为MtF的表达在不同形式的SA中是常见的。我们的数据表明，MtF表达不仅仅是由线粒体铁积累诱导的，在RARS患者培养的骨髓红细胞中，发现MtF的表达发生在分化的早期阶段，然后出现明显的铁沉积。^50,51 因此，在这些形式的SA中，MtF可能有助于线粒体铁沉积，同时保护细胞器免受铁过量。在XLSA小鼠模型中，未观察到MtF mRNA的红系表达，⁵² 因此，除MtF表达外，其他机制也有助于这种形式的线粒体铁积累。对SA的其他遗传形式知之甚少，所有这些似乎都会影响线粒体定位的蛋白质。包括Pearson综合征的线粒体DNA缺失，⁵³ 线粒体肌病和铁粒细胞性贫血中假尿苷合酶1（PUS1）的缺陷，⁵⁴ 以及弯曲尾部小鼠线粒体转运体铁黄素1的缺陷，⁵⁵ 而对于小鼠SOD2缺陷，贫血和线粒体铁沉积则归因于氧化损伤。⁵⁶ XLSA/A的特征是红细胞原卟啉过多，这与所有其他类型的遗传SA不同，我们认为它是由一种不易用于血红素合成的铁形式的积累引起的。可能，这可能导致其他形式的SA，如RARS，也经常显示红细胞原卟啉过量。⁵⁷ ABCB7普遍存在，其缺乏可能导致大多数细胞线粒体铁沉积和对氧化损伤的敏感性，但最敏感的似乎是基底节细胞⁴² 其退化可能导致共济失调和运动障碍，类似于弗里德雷希共济失调⁴ 和Pank2病。⁵⁸ 

贡献：所有作者都参与了研究的设计和执行。P.C和P.A.写了这篇论文，所有作者都检查了论文的最终版本。

利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。

通信：Paolo Arosio，意大利布雷西亚维亚莱欧洲11号，25123布雷西亚布雷西亚大学马特诺婴儿技术生物分院；电子邮件：arosio@med.unibs.it.

这项工作得到了Consorzio Interuniversitario per le Bioteconologie和Must-Cofin-2004赠款（P.a.）的部分支持。

我们非常感谢Wing-Hang Tong博士在乌头糖凝胶分析的开发过程中提供的帮助。抗人类frataxin抗体是Franco Taroni博士慷慨赠送的礼物。