上调Notch配体Delta-like 4抑制VEGF诱导的内皮细胞功能

Notch信号在发育和出生后各种细胞类型的细胞命运决定中起着关键作用。^1-5 哺乳动物中已鉴定出四种Notch受体，即Notch1、，⁶ 槽口2，⁷ 槽口3，⁸ 和槽口4，⁹ 和5个配体，Jagged1¹⁰ 和Jagged2¹¹ 属于Serrate家族和Delta1，¹² 增量3，¹³ 和Delta-like 4（Dll4）^14-16 属于Delta家族。与Notch受体结合的配体触发Notch胞内结构域的蛋白水解释放，该结构域转移到细胞核中，与转录因子RBP-J（也称为CSL和CBF1/Su（H）/Lag-1）形成核复合体，并激活下游靶基因的转录。¹⁷ 在哺乳动物中，Notch-interacellular domain/RBP-J复合物的主要靶基因包括HES公司（毛茸茸的/美甲）^18,19 和嘿（HES与YRPW基序相关，也称为HERP，HES相关阻遏蛋白）^20-23 作为转录因子的基因家族。

大量观察表明，Notch信号通路在血管发育和体内平衡中起着关键作用。^24-26 特别是槽口1和槽口4基因在胚胎血管系统的内皮细胞中表达，^9,27-29 而仅靶向缺失Notch1或Notch1加Notch4的小鼠在胚胎血管重塑方面表现出严重缺陷，突变胚胎大约在妊娠第E9.5天（胚胎第9.5天）死亡。³⁰ 在发育中的小鼠血管系统中表达激活的Notch4也会导致异常的血管结构和模式，导致胚胎在大约E10.5天时死亡。³¹ 此外，人类真皮微血管内皮细胞中活性Notch4的表达抑制了内皮细胞在胶原上的发芽。³² 

Dll4是最近发现的Notch配体^14-16,33 并被发现与Notch1和Notch4相互作用。^14,34 原位杂交和免疫细胞化学研究表明，Dll4的主要表达部位是血管系统，尤其是发育过程中的动脉、小动脉和毛细血管，^14,16,35 以及成年小鼠的小动脉、微血管和肿瘤血管。³⁵ 这种选择性在Notch配体中是独一无二的。³⁰ 最近，有针对性地删除Dll4号机组基因被生成，显示出与之前在Notch1突变体和Notch1和Notch4双突变体小鼠中观察到的类似的特征性血管重构缺陷。^30,35-37 引人注目的是，具有杂合缺失的小鼠Dll4号机组该基因也未能重塑卵黄囊中的初级血管丛，并在胚胎期死亡，这为Dll4表达水平在血管发育中的关键重要性提供了证据。^30,35-37 这个血管内皮生长因子基因是唯一一个已知的单一等位基因失活导致小鼠显著血管缺陷和胚胎死亡的例子。^38,39 在体外，缺氧可诱导内皮细胞中血管内皮生长因子（VEGF）和Dll4的表达。^16,35,40,41 

利用逆转录病毒转导，我们在原代人内皮细胞中表达了Dll4，以描述Dll4在这些细胞中的功能。我们发现Dll4抑制VEGF受体-2（VEGFR2）和神经纤维蛋白-1（NRP1）共受体的表达，并通过这种机制可能调节VEGF-A诱导的内皮细胞功能。

人类全长Dll4（GenBank no。AF253468型)以hDL4B sense，5′-GGATCCCCATATGGCGCAGCGTCCGGCGCCTC-3′和hDL4E反义，5′-GAATTCTACCGCCGGCAATGACACATTC-3′为引物从胎盘cDNA中克隆，然后TA克隆到pGEM-T easy载体（英国南安普敦普罗米加）。通过DNA测序验证克隆准确性。使用以下方法从pGEM-T easy载体上切下全长Dll4巴姆HI和生态RI限制性内切酶并连接到逆转录病毒质粒LZRSpBMN-linker-IRES-EGFP。对连接部位进行测序，并验证插入的准确性。

人脐静脉内皮细胞（HUVECs）⁴² 在第3至7段中使用。凤凰双嗜性病毒包装细胞系（加利福尼亚州圣地亚哥奥比根）在DMEM培养基（纽约州格兰德岛Gibco-Invitrogen）中生长，补充10%热灭活胎牛血清（FBS；马里兰州罗克维尔生物流体公司）和1.6 mM我-谷氨酰胺（西格玛化学公司，密苏里州圣路易斯）。重组人Dll4来自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州）。γ-分泌酶抑制剂L-685458（日本大阪西格玛化学或肽研究所）溶于二甲基亚砜（DMSO；西格玛化学品）中，以0.1至7.5μM的最终浓度使用。

使用FuGENE6（印第安纳波利斯罗氏分子生物化学公司）或Lipofectamine 2000（加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen公司）转染在10厘米培养皿上生长至50%融合的凤凰细胞，转染逆转录病毒构建物24小时。添加含有2μg/mL嘌呤霉素（西格玛化学）的新鲜HUVEC培养基。在达到汇合点后（24-48小时），将细胞清洗并在Opti-MEM I（Gibco，Invitrogen）中培养36-48小时。将含有病毒的培养上清液过滤（0.4μm），并在第2代时将Polybrene（4 ng/mL；Sigma Chemical）添加到50%融合的HUVEC中。在37°C下培养3小时后，将细胞在HUVEC培养基中再培养24小时，然后清洗细胞。随后，将细胞维持在标准条件下。

提取总RNA（Absolutely RNA Microprep Kit；Stratagene，La Jolla，CA）。如上所述，用SYBR Green PCR主混合物（Applied Biosystem，Foster City，CA）进行定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）（一步RT-PCR试剂盒；Qiagen，Valencia，CA）。⁴³ 反应在Abi Prism 7900HT序列检测系统（Applied Biosystems）中进行。所用引物包括GAPDH正义（5′-GCCACGAAGACTGTGGGATGGC）和反义（5’-CATGAGCGATGGTCCACAC）、Dll4正义（5'-GACACTTTCGGCACTATGT）和反意义（5'-CCTTGTCCACTTCTTCTCGC）、HEY1正义（5A′-AACTGTGGTGGCCTGCGCGCGCGC）和反义（5'-AATTCTTGTGTGTGTGGCGCAC）、HEY2正义（5-TTCAAGGCTCTCTCTCTGAACT）和反义（5′-GAGCATTTTACTCTCCCAAT）、肾上腺素B2（5′-GAAAATACCTCCTCAACT）和反义，VEGFR2正（5′-GGAAAATCATTAGTTAGTAGGCACCG）和反（5′-CCTTGGATACCTTCGCGATG）、FGFR1正（5’-GGAGGAGCGATCACTGTGG）和反义（5′-CGGAGAAGTAGGTGTCAC）、VEGF-A正（5'-CCTTGCTACCTCAC CTTTGAAGCC），Notch2正（5′-CCCAATGGGCAGAGATA）和反义（5′-CACAATGTGGTGGTGTGGATA）、Notch3正（5’-TCTGCTGCTGGTCATCTC-3′）和反义（5′-TGCCTCATTCTCTTCAGTTG-3′），以及Notch4正（5'-CACTGAGCAGAGCATAGAC）和反意义（5′-ATCCCCCACACACTCG）。RT-PCR反应在50°C下进行30分钟、94°C下进行15分钟、94°C下进行1分钟、60°C（Notch3为58°C，Notch1、Notch2和Notch4为55°C）下进行1分钟、72°C下进行1分钟和72°C下进行10分钟的35个循环，然后在95°C下进行15分钟、60°C下进行15分钟和95°C下进行15分钟的解离步骤。

在由M199（Gibco-Invitrogen）和2.5%FBS（Biofuids）、25μg/mL猪肝素（Sigma Chemical）或指数增长的HUVEC组成的“饥饿培养基”中同步24小时对HUVECs进行细胞周期分析。细胞在补充有50 ng/mL VEGF-A（研发系统）的饥饿培养基中培养。如前所述，在收获前通过培养1小时，用10μM 5′-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU；Sigma Chemical）对细胞进行脉冲处理。每隔一段时间（0-72小时），用0.05%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）（Gibco，Invitrogen）分离细胞，清洗后，悬浮在PBS中0.5至1 mL冷70%乙醇中。清洗后，在室温下用2 M HCl/Triton X-100培养30分钟，中和并悬浮在含有0.5%吐温-20和1%BSA的PBS中，用FITC-标记的小鼠单克隆抗BrdU抗体（Becton Dickinson Immunocytometry Systems，加州圣何塞）培养细胞。对于碘化丙啶（PI）掺入，用50μg/mL PI（Sigma Chemical）和100 U/mL核糖核酸酶A（RNase；Sigma Chemical）将细胞悬浮在PBS中，在37°C下培养30分钟，然后用PBS冲洗。获得了至少10000个事件，并用CellQuest（新泽西州富兰克林Lakes的Becton Dickinson）和MODFIT分析结果书信电报软件（Topsham，ME），如所述。⁴⁴ 为了对增强的绿色荧光蛋白（EGFP）表达进行流式细胞术分析，将HUVEC悬浮在0.5 mL PBS中并进行检测。⁴³ 如前所述，对表面抗原进行流式细胞术分析。⁴² 对于VEGFR2染色，我们使用小鼠单克隆抗VEGFR2（ab9530；Abcam，Cambridge，MA）和Alexa594标记的山羊抗鼠抗体（Molecular Probes，Eugene，OR）。对照组用小鼠IgG1和Alexa594标记的山羊抗鼠抗体染色。对于神经素-1染色，我们使用了PE标记的小鼠单克隆抗BDCA-4（人类神经素-1）抗体（AD5-17F6克隆；Miltenyi Biotec GmbK，Bergisch Gladbach，Germany），并对PE标记的鼠单克隆抗人CD31抗体（Pharmingen，BD Biosciences，San Diego，CA）进行CD31染色。使用荧光激活细胞分选（FACS）Calibur流式细胞仪（Becton Dickinson）收集数据，并使用CELLQuest软件（Becton-Dickinson）进行分析。

通过免疫产生的重组Dll4胞内结构域，产生兔抗人Dll4免疫血清（命名为R3）大肠杆菌使用引物：sense 5′-GGATCCCCATATGCGTCAG-CTGCGTTTCGTCGTGTCCGG-3′和hDl4E反义，将人Dll4细胞内结构域克隆到表达载体pET-28C-D4ICD中。将PCR产物克隆到pGEM-T easy载体中，制备pGEM-T-D4ICD质粒。然后用酶消化质粒Nde公司我和生态RI限制性内切酶，并将片段插入pET-28C中以产生pET-28-D4ICD表达载体。将载体转化为BL21密码子⁺表达重组蛋白的活性细胞（MX3H6×10.D4ICD）。从包涵体中纯化Dll4胞内结构域并用于兔免疫。HUVEC的细胞自旋制剂（10-20 000个细胞/片，38.2克6分钟）用丙酮在室温下固定10分钟，用PBS洗涤20分钟以上，用10%胎牛血清在PBS中封闭，用R3兔抗体孵育（在含有3%FBS的PBS中稀释1:300，37°C下1小时），在PBS内洗涤20分钟，然后在37°C下与标记有辣根过氧化物酶（DAKO，Carpindia，CA）的山羊抗兔抗体孵育30分钟。清洗后，在室温下将载玻片在3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）底物中培养30分钟（21 mL 0.1 M醋酸钠79 mL+0.1 M醋酸+6 mL AEC，100μL 30%H₂O（运行）₂)并用Meyer苏木精复染5至10分钟。

按照说明进行免疫印迹。⁴⁵ 为了识别Dll4，我们使用了兔R3抗人Dll4抗体（稀释度1:250）和亲和纯化的、过氧化物酶连接的驴IgG抗兔抗体（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）；具有过氧化物酶连接的驴IgG抗小鼠抗体的小鼠单克隆抗人/小鼠Dll4（MAB1389，1:500稀释；R&D Systems）；或亲和纯化的山羊抗Dll4肽抗体（C-20，1:500稀释；加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）与过氧化物酶连接的驴抗羊IgG抗体（圣克鲁斯生技公司）。为了鉴定β-肌动蛋白，我们使用山羊IgG抗肌动蛋白抗体（C11，1:1000稀释；Santa Cruz Biotechnology）和驴抗羊IgG HRP结合物（Santa Cru z Biotechnology。抗体检测采用化学发光增强法（ECL；Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ）。VEGF-A通过酶联免疫吸附试验（ELISA；R&D系统；检测下限约为3 pg/mL）测定。

如前所述测量HUVEC增殖。⁴² 将HUVECs一式三份接种在96孔板中（2-4×10^三细胞/孔置于0.2 mL RPMI 1640培养基中，该培养基补充有18%的热灭活FBS（Biosource，Camarillo，CA）和18 U/mL猪肝素，含或不含人VEGF-A₁₆₅（3-24 ng/mL；研发系统）或人类bFGF（3-28 ng/mL，研发系统），并培养3天。HUVEC也被培养到96个微孔板上，用50μL重组人Dll4（1μg/mL PBS或明胶；R&D Systems）在4°C下预培养18小时。当使用L-685458时，每24小时用抑制剂或二甲基亚砜对照物补充培养基。扩散的测量方法是^三在培养的最后18到22小时内，H-胸腺嘧啶脱氧核糖的摄取（0.5μCi[0.0185 MBq]/孔，25 Ci/mmol[925 GBq/mmol]；马萨诸塞州波士顿新英格兰核电厂）。结果表示为平均值（±SEM）cpm/培养物。

体外基质凝胶试验基本上按照所述进行。⁴⁵ 将HUVEC（40 000-75 000个细胞）接种到24孔组织培养板上，该培养板涂有200至300μL固化基质凝胶（Englebreth-Holm-Swarm肿瘤的提取物，Collaborative；BD Pharmingen，San Diego，CA）。培养16至18小时后，在相位控制显微镜下对细胞进行拍照（Retiga 1300数码相机；奇马奇，加拿大不列颠哥伦比亚省伯纳比市）（奥林巴斯1×51，带10×0.25 NA PhL透镜；奥林巴斯光学，纽约州梅尔维尔市），并使用IPLab for Windows软件获得图像（Scanalytics，费尔法克斯，弗吉尼亚州）导入Adobe Photoshop（加利福尼亚州圣何塞市Adobe Systems）。网络形成是通过计算帘线角度/场的数量来测量的（每个场定义为通过4倍放大镜显示的区域）。每个实验条件在8个单独的实验中进行测试。

使用0.2%明胶涂层聚碳酸酯过滤器（孔径8μm）的转染孔进行内皮细胞迁移分析；Costar，马萨诸塞州剑桥市）。用空向量或Dll4（5×10）转导的HUVEC⁵/孔）放置在迁移介质（RPMI 1640，含0.5%BSA和10 mM HEPES）的上腔中。下室含有含有或不含有100 ng/mL VEGF-A或100 ng/mL bFGF的迁移介质。在37°C下孵育16至20小时后，对下室中的活细胞进行计数。

学生评估了组间差异t吨测试；P（P）小于0.05的值被认为是显著的。

我们选择逆转录病毒介导的转导方法，在来源于脐静脉的原代人内皮细胞（HUVECs）中过度表达Dll4，以实现Dll4的适度表达。在培养中，通过RT-PCR检测到HUVEC组成性表达低水平的Dll4 mRNA。⁴² 我们发现大约90%的HUVEC在感染对照逆转录病毒后第3天表达增强的绿色荧光蛋白（EGFP）(图1A). 同样比例的HUVEC（92%）在感染Dll4逆转录病毒后第3天表达EGFP(图1A). 当感染效率下降到60%以下时，细胞被FACS筛选为100%EGFP表达。感染后7至10天，EGFP阳性细胞的比例平均下降约15%。所有结果均来自8个单独的细胞群体，其中超过50%的细胞EGFP阳性。

通过实时定量PCR分析，我们发现Dll4细胞中的Dll4转录水平显著高于对照细胞。在8种不同感染的14次测定中，标准化为GAPDH的Dll4表达水平高出32±5.9倍（平均值±SEM）(P（P）<.001）在Dll4细胞中比在对照细胞中(图1B).

通过免疫印迹法，我们发现我们针对Dll4胞内结构域所制备的抗体R3在Dll4转导细胞的细胞提取物中发现了一条在约70kDa处迁移的带，但在对照细胞的细胞提取液中没有发现(图1C). 全长Dll4的预测分子量计算为75 kDa。这种差异不能归因于不均匀的负荷，正如用针对肌动蛋白的抗体进行膜重切所证明的那样(图1C). 显示Dll4蛋白在Dll4细胞中表达的类似结果是通过膜重切获得的，膜重切使用纯化的鼠抗重组Dll4单克隆抗体（R&D Systems）和亲和纯化的羊抗Dll4 C末端肽多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology）（未显示）。我们得出的结论是，Dll4转导的HUVECs表达Dll4蛋白，而对照HUVECs表达的Dll4蛋白量不足，无法通过蛋白质印迹检测。

胞浆制剂的免疫细胞化学染色证实了转导的HUVEC中Dll4蛋白的上调。R3抗体免疫染色时，感染Dll4逆转录病毒的HUVEC为Dll4阳性（棕色染色）(图1F). 相比之下，HUVEC感染了野生型载体(图1D)基本上是负面的。此外，免疫前兔血清（来自产生R3的同一只兔子）未对用Dll4转导的HUVEC进行免疫染色(图1E). 因此，这些结果表明，原代人内皮细胞可以被转导以过度表达Dll4。

我们检测了Dll4过度表达对HUVEC生长的影响，以响应促血管生成因子血管内皮生长因子（VEGF）-A和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。为了更好地评估Dll4过度表达而非克隆变异的影响，我们选择了功能性实验的HUVEC培养物，在感染对照和Dll4逆转录病毒后，细胞比例相似的细胞呈EGFP阳性，反映了有效和可比较的转导水平。当在VEGF-A（25 ng/mL）存在下刺激3天时，Dll4-转导的HUVEC持续增殖到显著较低的程度(P（P）<.001）比控制单元(图2A).

在广泛的VEGF-a浓度范围内观察到这种差异(图2B; 代表性实验）。与Dll4-过度表达的HUVEC的增殖能力降低相一致，与对照HUVECs（未显示）相比，补充VEGF-A（25 ng/mL）的Dll4-转导的HUVECs培养物中的细胞数量显著减少。在一个有代表性的实验（共进行了4次）中，有115×10^三与216×10相比，Dll4-转导的活HUVEC^三培养3天后控制HUVEC。与它们对VEGF-A的增殖反应降低相反，Dll4转导和对照的HUVEC对不同浓度的bFGF的增殖反应相似(图2C; 代表性实验）。因此，Dll4在原代人内皮细胞中的过度表达与VEGF-A引起的增殖减少有关。

为了描述Dll4过度表达的HUVEC对VEGF-A的反应，其增殖能力降低的特征，我们检测了VEGF-A刺激期间的细胞周期分布。首先，在饥饿条件下通过培养使细胞同步化24小时（培养基中的血清浓度降低2.5%；省略抗坏血酸和ECGS），然后在饥饿培养基中用VEGF-A（50 ng/mL）刺激细胞。最初（0时间点），对照组和Dll4 HUVECs在细胞周期不同阶段的细胞分布相似，反映出在存在内皮细胞生长补充剂（含有bFGF和酸性FGF，用于培养维持）的情况下，这些细胞的增殖能力相似(图3A进行了4个代表性实验）。然而，在随后的时间点（24小时和48小时），发现对照细胞和Dll4-过度表达的HUVEC之间的细胞周期进展存在明显差异。在对照培养物（载体）中₀/G公司₁在有VEGF-A存在的情况下，饥饿48小时后，细胞周期从84%（时间0）下降到53%，而细胞周期S期的细胞百分比相应地从6.7%增加到36%。在相同的培养条件和测试条件下，转导Dll4的HUVEC（Dll4）在G₀/G公司₁细胞周期的时相在83%到90%之间波动，S期细胞的百分比仅在5%到6%之间波动(图3A). 这些实验提供了证据，表明在用VEGF-A刺激后，与对照细胞相比，过表达Dll4的HUVEC进入S期的能力降低。

此外，我们通过测量基于BrdU和PI掺入的细胞周期S期细胞的比例，证实了这一观察结果。在含有2.5%血清和50 ng/mL VEGF的培养基中培养指数生长的非同步HUVEC 72小时。在这些限制性培养条件下，尽管存在VEGF-A，但在72小时内，对照组和转导Dll4的HUVEC中细胞周期S期BrdU阳性细胞的比例都降低了，但与对照组相比，Dll4过度表达细胞的减少更大(图3B).

这些结果提供了证据，证明Dll4-过度表达的内皮细胞在对VEGF-A的反应中复制能力有缺陷。我们检查了这种缺陷是否局限于VEGF-A-诱导的增殖或扩展到VEGF-A的其他非原发性功能。在迁移分析中，VEGF-A（100 ng/mL）和bFGF（100 ng/mL）促进了控制HUVEC的显著响应(图4A). 然而，VEGF-A仅诱导Dll4-过度表达的HUVEC适度迁移(P（P）=0.021）与控制HUVEC相比减少。这种差异与细胞迁移中更广泛的缺陷无关，因为Dll4-过度表达的HUVECs和对照HUVEC迁移的程度相似(P（P）=.74）针对bFGF(图4A).

在对VEGF-A非致瘤活性的额外分析中，我们检测了内皮细胞进行形态改变以形成心形结构的能力。当在细胞外基质上培养时，如胶原蛋白、纤维蛋白或基质凝胶（细胞外基质蛋白层粘连蛋白、IV型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和凝集素巢蛋白的混合物），初级内皮细胞可以形成一个特征性的心形结构网络。^43,45 对于HUVEC，基质诱导的脐带形成需要6到16小时的孵育，不需要细胞分裂，并且严重依赖内源性VEGF-A和其他因素。^45-49 如典型实验所示(图4B)对照组HUVECs形成了有序分支线状结构的特征网络，Dll4-过表达的HUVEC形成的这种结构更少，因此网络往往是不完整的。通过测量脐带分支角度对8个独立实验中的网络形成进行定量分析，结果显示Dll4过度表达的HUVEC显著(P（P）=0.031）与控制单元相比，它们形成网络的能力有缺陷(图4C).

我们研究了Dll4过度表达细胞组装成心形结构的能力降低是否可归因于内源性VEGF的表达降低，而内源性VEGF是这一形态发生过程所必需的。通过定量RT-PCR分析，我们发现VEGF mRNA的水平相似(P（P）=.82）在控制和Dll4-转导的HUVEC中(图5A). 此外，来自对照细胞和Dll4过表达细胞的培养上清液在基质凝胶上孵育20小时后含有相似水平的VEGF（分别为52和61pg/mL）。这为Dll4不调节HUVEC中VEGF的表达提供了证据，并表明VEGF-A表达减少并不是Dll4过度表达HUVECs形成有缺陷的基质依赖性网络的原因。

在观察到Dll4过度表达与选择性降低内皮细胞对VEGF-A的反应相关的基础上，我们检测了Dll4过量表达的HUVEC中VEGFR2的表达。众所周知，VEGFR2是VEGF-A诱导内皮细胞增殖、迁移、存活和血管生成的主要信号受体。⁵⁰ 通过定量RT-PCR分析，我们一致（5次测定）发现VEGFR2 mRNA水平显著高于(P（P）与对照组HUVEC相比，Dll4-过度表达的HUVECs减少，而VEGFR1和FGFR1 mRNA水平相似(P（P）> .1;图5A). 此外，我们一致（7次测定）发现，NRP1的RNA水平，即增强VEGF-a与VEGFR2结合的VEGF-a-共受体，⁵¹ 显著(P（P）=0.003）与对照细胞相比，Dll4-转导细胞中的含量减少(图5A). 通过流式细胞术，与对照HUVEC相比，过表达Dll4的HUVEC中表面VEGFR2和NRP1的表达水平显著降低，而表面CD31的水平相似(图5B).

我们寻找HUVEC中Notch表达的证据。通过RT-PCR，我们确定当前实验中使用的载体转导的HUVECs表达Notch受体Notch1、Notch2和Notch4的mRNA，但仅表达低水平的Notch3mRNA(图6A). 通过定量RT-PCR分析，我们发现HEY2 mRNA水平一致且显著(P（P）=0.013）与对照组相比，Dll4-转导的HUVEC增加，而HEY1 mRNA水平相似(P（P）= .2;图6B). 此外，我们发现ephrinB2 mRNA水平显著升高(P（P）=0.019）在Dll4-过度表达的HUVEC中高于对照HUVECs，这与之前的观察结果一致，即HEY1/HEY2-缺陷小鼠不表达ephrinB2。⁵² 因此，HUVECs中Dll4的过度表达与HEY2和ephrinB2的显著增强表达有关，这与这些细胞中Notch信号的增强一致。

为了更直接地评估Notch信号对Dll4转导的HUVEC表型的贡献，并将其与Dll4细胞内结构域的反向信号的潜在贡献区分开来，我们使用了缺乏细胞内和跨膜结构域的重组人Dll4（rhDLL4）。我们发现固定在培养孔上的rhDLL4减少了HUVEC对VEGF-A的增殖(图6C). 此外，我们发现，与在稀释涂层板上培养的HUVEC相比，在涂有rhDLL4的平板上培养的细胞表面VEGFR2表达降低(图6D). 这些结果表明，Dll4的胞外结构域足以抑制内皮细胞对VEGF-A的增殖反应，并降低表面VEGFR2的表达。这些效应与全长Dll4诱导的效应相似，表明Dll4的细胞内和跨膜结构域在当前系统中不需要活动，Dll4可能通过Notch而不是Dll4信号发挥作用。

γ-分泌酶对Notch的蛋白水解是受体活化后的重要步骤。¹⁷ 因此，γ-分泌酶抑制剂阻断Notch通路的激活。为了进一步证实细胞外Dll4通过Notch抑制VEGF-A诱导的HUVEC增殖，我们使用γ-分泌酶抑制剂L-685458。⁵³ 如所示图6E，L-685458特异性和剂量依赖性重组VEGF-A诱导的HUVEC增殖被rhDLL4抑制。这些结果与通过Notch受体的Dll4信号一致。

我们还测试了γ-分泌酶抑制剂L-685458对对照组和Dll4-过度表达HUVEC中VEGFR2表达的影响(图6F). 当Dll4转导的HUVEC中VEGFR2 mRNA水平比载体转导的FUVEC降低至少5倍时，L-685458（2μM，72小时孵育）显著降低(P（P）=0.041）与载体转导的HUVEC相比，Dll4-过度表达的HUveC中重建的VEGFR2 mRNA水平。与rhDLL4诱导的HUVECs相比，在Dll4-过度表达的HUVECs中，VEGFR2表达的重建更依赖于确定的实验条件，这可能反映了逆转录病毒表达系统的复杂性。总之，这些结果提供了证据，证明Notch信号通路有助于减少Dll4转导的原代内皮细胞中VEGFR2的表达和VEGF-A的增殖。

在本研究中，我们通过逆转录病毒基因转导在原代人内皮细胞中表达了Dll4，并确定Dll4是内皮细胞对VEGF-a反应的负调节因子。我们发现Dll4下调内皮细胞VEGFR2的表达，VEGF-A的促迁移和血管生成活性。⁵⁰ 我们还发现，Dll4下调NRP1的内皮细胞表达，NRP1是VEGF-a家族成员的共同受体，增强VEGFR2活性。⁵¹ 我们和其他人已经表明，Dll4-RNA是由内皮细胞中的缺氧或VEGF-A诱导的。^16,35,41 我们目前的工作扩展了这些观察结果，以证明Dll4通过减少其主要信号受体和辅受体的表达，抑制内皮细胞对VEGF-A的反应。

以往的研究普遍认为，内皮细胞中Notch的激活有助于减少血管生成反应。成分活性Notch4抑制了原代人皮肤微血管内皮细胞的萌发，并减少了VEGF诱导的鸡胚绒毛尿囊膜体内血管生成，部分原因是β1-整合素的构象变化。³² 活性Notch1或Notch4的过度表达部分通过抑制p21抑制HUVEC的增殖^{Cip1号机组}表达。⁵⁴ 成分活性Notch1抑制小鼠胚胎内皮细胞的迁移。⁵⁵ 此外，组成性活性Notch1或Notch4对VEGF的反应降低了HUVEC的增殖，但对bFGF的反应不明显。⁵⁶ 与Dll4是Notch1和Notch4配体一致，^14,34 我们已经证明，Dll4过度表达的内皮细胞的表型与Notch1或Notch4活性的内皮细胞表型相似。最近，内皮细胞表达的另一种Notch配体Jagged1在HUVEC中过度表达，诱导细胞周期阻滞和细胞增殖减少，类似于相同条件下活性Notch1或Notch4的作用。⁵⁴ 这些观察结果表明，内皮细胞中至少存在Notch1和Notch4以及Jagged1和Dll4的功能冗余。

内皮细胞中Dll4的过度表达伴随着转录因子HEY2的表达显著增加，而HEY1的表达几乎没有变化。此前，活性Notch1和Notch4被证明上调内皮细胞中HEY1的表达，⁵⁶ 表明配体Dll4和活性Notch1或Notch4受体激活不同转录因子。因为据说Dll4也绑定了Notch2，¹⁵ 在HUVEC和其他内皮细胞上表达，⁵⁴ 活性Notch2可能上调HEY2。如果Notch受体可以根据配体的性质甚至激活的程度和精确条件激活不同的转录因子，这将为解释Notch系统的复杂性提供基础。Dll4细胞内结构域可能自身发挥特定的信号功能，这与之前对Dll1的假设一致。^57,58 然而，我们已经证明，通过单独使用Dll4的胞外结构域可以实现VEGFR2表达的下调和对VEGF-A增殖反应的减弱。这表明Dll4的胞内结构域对这些作用是不必要的。此外，细胞外Dll4引起的VEGF-A诱导的增殖减少可以通过添加γ-分泌酶抑制剂L-685458来克服，这为Dll4通过Notch受体发出信号提供了有力证据。此外，本文的结果支持Notch信号对Dll4-过度表达细胞表型的重要贡献，表明Notch信号抑制剂L-685458显著重建了Dll4-转导内皮细胞中VEGFR2的表达。

我们在这里发现，Dll4的过度表达与内皮细胞中VEGFR2和NRP1的表达减少有关，这种减少可能是Dll4过度表达内皮细胞中对VEGF-A异常低增殖和迁移反应的原因。此前，据报道，内皮细胞中具有组成活性的Notch1和Notch4可能通过降低VEGFR2启动子活性来下调VEGFR2的表达，⁵⁶ HEY1在这些细胞中的过度表达降低了VEGFR2 mRNA的水平。⁴⁹ 我们的结果证实了Notch信号转导和VEGFR2下调之间的联系，并扩展了这一观察结果，发现Dll4也降低了NRP1的表达。最近的实验表明，在Notch1或HEY1/HEY2靶向缺失的小鼠中发育的大动脉不表达NRP1，从而提高了NRP1表达可能受Notch信号调节的可能性。⁵² 

NRP1作为3类信号素受体的作用，3类信号蛋白介导神经元导向，^59,60 对于VEGF-A的几种亚型，增强VEGF-A的活性，⁵¹ 已经建立了良好的基础。最近，我们和其他人发现NRP1调节内皮细胞与细胞外基质和其他细胞的粘附，^43,61 表明NRP1作为VEGF-a活性的调节剂和内皮细胞粘附的介质在血管生成中起重要作用。这一结论与内皮细胞靶向NRP1缺失小鼠出现的明显血管异常一致⁶² NRP1缺乏小鼠心脏、血管和神经系统缺陷导致的胚胎死亡。^63,64 通过下调VEGFR2和NRP1的表达，Dll4被定位为内源性血管生成抑制剂。

与静脉相比，Dll4在发育中的动脉、小动脉和毛细血管中的优先表达，^14,16 HEY2的动脉特异性表达，⁶⁵ Notch1或HEY1/HEY2缺陷小鼠大动脉中CD44和ephrinB2动脉内皮标记物的丢失，⁵² HEY2诱导HUVEC中许多动脉内皮细胞标记物的表达⁶⁵ 已经表明Dll4-Notch1/4-HEY1/2通路指定了发育过程中的动脉内皮命运。³⁰ 本文观察到HUVECs过度表达Dll4显示动脉标记物ephrinB2 mRNA水平增加，这与此概念一致。Dll4在卵巢肿瘤血管内皮和血管生成内皮中的表达及其缺氧和VEGF-A诱导^16,40,41 进一步表明，Dll4也可能在新生血管形成过程中的内皮细胞分化过程中发挥作用。

我们将Dll4鉴定为内皮细胞对VEGF-a（一种主要促血管生成因子）反应的阻遏物，赋予Dll4一种以前未知的功能，并扩展了目前血管生成调节的概念。未来实验的挑战将是评估Dll4作为血管生成抑制剂在癌症和其他以过度血管生成为特征的疾病治疗中的潜在效用。

我们感谢R.Schwartz、M.Lenardo、M.Delong和S.Kennedy博士的支持；V.Kapoor博士和W.Telford博士负责细胞分类和流式细胞术支持；G.P.Nolan博士提供逆转录病毒载体；L.Sierra女士、L.Yao博士和M.Narazaki博士提供技术支持；以及N.Patel博士、S.Suchting博士、K.Tahtis博士和R.Yarchoan博士就这项工作的各个方面提供帮助。

C.K.W.是美国国立卫生研究院牛津大学健康科学学者。