家族性真性红细胞增多症的克隆造血表明多种突变事件参与了该病的早期发病机制

偶发性骨髓增生性疾病（MPD）是由于单个造血细胞的获得性突变导致克隆性循环髓系后代。¹ 红细胞的积累是真性红细胞增多症（PV）的标志，而血小板、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的积累则是可变的。PV的分子病变尚不清楚。PV中的红系祖细胞在缺乏外源性促红细胞生成素（Epo）的克隆形成培养物中形成促红细胞形成素诱导的依赖性红系集落（EEC）。² 这种独特的特征使PV与其他有或无家族史的原发性红细胞增多症区别开来。^三,4 EEC分析还确定了缺乏完整PV表型的早期PV阶段，并允许在那些最初表现为血小板增多的患者与那些患有原发性血小板增多症的患者中区分PV。⁵ 红细胞增多症的家族聚集见于先天性红细胞增多状态，包括原发性家族性和先天性红血球增多症、Chuvash红细胞增多病、高氧亲和性珠蛋白突变体和二磷酸甘油酸变位酶缺乏症。⁶ 然而，很少有家族性PV发生的病例报道。^7-10 

根据PV研究组的标准，所有受影响的家庭成员都有典型的PV诊断。¹¹ 所有研究都是根据批准的机构审查委员会方案（贝勒医学院和阿拉巴马大学伯明翰分校）进行的，本研究中的所有受试者都提供了对其血液样本进行DNA和细胞培养研究的书面同意书。

EEC测定、细胞分离、克隆性分析、杂合性缺失（LOH）检测和连锁分析的详细描述在其他地方列出。^12,13 微卫星聚合酶链反应欧洲电力公司和血小板生成素受体基因是按照前面描述的方式进行的。^14,15 

我们研究了6个种族背景不同的白人家庭，每个家庭都有多个PV成员(图1A). 我们在所有受影响家庭成员的外周血培养中检测到EEC。临床结果总结于表1; 这些临床结果代表了所有可用的患者，并且这些患者不是预先选择的。除了具有完全PV表型的受影响成员外，我们还测试了无PV的家庭成员的外周血中是否存在EEC。我们确定了A和B家族中没有PV临床症状或体征但外周血中存在EEC的受试者（受试者A04、A06、A09、A14、A17、B01）。克隆性在具有完整PV表型的信息丰富女性中得到证实(表1;图1B). 具有部分表型（仅EECs）的成员是多克隆的，表明正常干细胞对生产性造血的贡献，因此缺乏PV的临床症状。为了检测EEC的存在是否是由于体细胞突变或遗传突变基因所致，我们分离了Epo-非依赖性红细胞群体并分析了其克隆性（该样本由约500-1000个母细胞形成单位-红细胞[BFUEs]组成从10个甲基纤维素板中提取，然后进行糖蛋白A的磁激活细胞分选。每个BFUE由约800-2000个原红细胞组成）。我们在一名有多克隆造血功能的信息丰富女性中检测到克隆EEC；请注意，T细胞的X染色体等位基因用法似乎有偏差；然而，观察到的偏斜在我们报道的正常造血后代的范围内(图1B).¹⁶ 

家族性PV的遗传模式与外显率降低的常染色体显性性状相一致。如果EECs的发现被认为是PV表型的早期迹象，则外显率增加。在这6个家庭中，有4个（A-D）用于连锁分析，因为这些家庭至少由2个受影响的兄弟姐妹组成。在E和F家族中，PV的聚集可能只是偶然的，而且我们在招募这些家族时可能会有选择偏见，因为十多年来，不寻常的红细胞增多症家族一直被推荐给我们。对于这些谱系，我们使用SIMLINK软件计算了检测连锁的功率(http://www.sph.umich.edu/group/statgen/software),¹⁷ 预测给定家系结构的最大比值比对数（LOD）得分为4.4。当EEC阳性受试者被视为受影响时，模拟LOD得分进一步增加至5.2分（数据未显示）。利用这些家族，我们可以检测一些先前被提议在MPD，特别是PV中起作用的候选基因座。我们分析了PV表型与染色体20q、13q和5q上作为PV遗传畸变发现的常见缺失区域之间的联系。^18,19 此外，血小板生成素受体(血小板生成素受体)和Epo受体(欧洲电力公司)包括PV在内的骨髓增生性疾病的发病机制中已经提出了基因。^20,21 最近，我们报道了涉及染色体9p的LOH的存在，这是散发性PV中最常见的克隆缺陷。¹² 我们在受试者A01和B02的9p染色体上检测到LOH(表1). 我们使用微卫星标记对这些位点进行连锁分析。在连锁分析中，只有具有完整PV表型的受试者被视为“受影响”。由于LOD得分低于-2.0被视为排除连锁，我们可以排除PV表型和所有测试基因座之间的连锁。的LOD分数环氧丙烷和血小板生成素受体基因分别为-3.16和-2.24。在散发性MPD中发现的常见缺失区域也被排除在外，20q的LOD得分为-4.40，13q为-4.79，5q为-6.27。我们还完全排除了LOH的染色体9p区域(图1C). 这些结果表明，在MPD中经常观察到的涉及20q、13q、5q和9p染色体区域的体细胞突变是继发性遗传变化，并不针对主要的PV位点。

对受影响家庭成员的临床分析证实，他们的表型与散发性PV相同。家族性PV的发生提供了对PV分期的独特见解，因为我们可以使用EEC分析在疾病早期识别受影响的成员。这在散发性PV中是不可能的，因为只有在出现症状时才能确定个体。血栓细胞增多症是一些PV受试者首次出现的异常，⁵ 有趣的是，在C和D家族中，血小板增多症发生在红细胞压积升高之前。在所有受影响的信息女性中，我们观察到克隆循环髓样细胞，如散发性PV；在某些情况下，克隆性无法确定，因为（1）患者进行了用于克隆性分析的活性X染色体基因外显子多态性的基因分型，但没有提供信息；（2）未能获得后续研究的知情同意；或（3）患者不再能够或不愿意参与我们的研究。⁴ 克隆造血是完全发育PV的标志。在A和B家族中，我们观察到血液学正常的受试者外周血中存在EEC。在其中一个病例中，我们证明了Epo-非依赖性细胞的克隆起源，但其余的髓样细胞是多克隆的。因此，在多克隆造血的症状前PV中可能存在PV干细胞克隆，但其对血液生产的贡献有限。在这个阶段，PV克隆的后代可以通过EEC分析检测到。在症状阶段，PV克隆失去调节并扩张，出现克隆造血。对于那些在红细胞压积升高之前出现血小板增多的PV患者，血小板增多是否先于（如我们之前研究的受试者C02和一名散发PV的女性）或在克隆循环造血子代建立之后，还有待确定。

克隆性造血的发现表明获得性突变是家族性PV病因学的一部分。家族性PV中遗传和获得性突变的存在使得对该疾病的病因有多种解释。如其他家族性癌症易感性（如视网膜母细胞瘤）所示，该基因的突变无功能拷贝在家族中遗传，随后剩余野生型等位基因发生获得性突变。该基因的两个等位基因突变后（一个等位遗传突变，第二个等位获得突变），疾病就开始了。因此，在有PV倾向的家庭中，PV表型的发生年龄预计要早于散发性PV。B、E和F家族的情况确实如此。在此初始阶段建立的干细胞克隆可能会经历进一步的突变，从而加速克隆扩展。另一种解释是假设两个或多个基因发生突变，一个基因发生遗传突变，而另一个（或多个）基因发生突变。然而，如果一个以上的基因可以促进最终PV表型的形成，这将使PV成为一种遗传异质性疾病，并且一些位置克隆数据解释将无效。基因功能丧失是第一种模型的必要组成部分，而在第二种模型中，功能获得突变也可能与功能丧失突变同时出现。在这两种模型中，获得性突变与克隆性造血的存在有关。在家族中观察到的不完全外显率与这两种模型相一致。

“原发性PV突变”的染色体定位尚不清楚。迄今为止，PV表型未显示与PV相关的任何位点的关联。具有多个PV成员的家族应该被证明是确定PV易感基因的基础，因为它们为全基因组连锁分析和位置克隆提供了可能性。

我们感谢Hanneke Kluin Nelemans博士和Rangaswamy Govindarajan博士提供的血液样本，以及Valerie Irvin和Yongli Guan的技术援助。