研究文章细胞生物学肌肉生物学 免费访问|10.1172/jci.目击.136687
1外科,
2解剖、细胞生物学和生理学系,
三耳鼻咽喉头颈外科,
4西蒙癌症中心,以及
5美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院印第安纳肌肉骨骼健康中心。
通信地址:美国印第安纳州印第安纳波利斯市核桃街西980号印第安纳大学医学院外科Andrea Bonetto,邮编:46202;电话:317.278.0302;电子邮件:abonetto@iu.edu.
作者注释:JRH和LJN对这项工作做出了同等贡献。
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作者说明:JRH和LJN对这项工作做出了同等贡献。
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2解剖学、细胞生物学和生理学系,
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作者注释:JRH和LJN为这项工作做出了同等贡献。
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2020年4月16日出版-更多信息
晚期结直肠癌(CRC)常伴有肝转移(LMs)和骨骼肌萎缩(即恶病质)。尽管困扰着大多数CRC患者,恶病质仍未得到解决。通过皮下(s.c.;C26)或脾内注射Colon-26小鼠肿瘤来模拟癌细胞(mC26)在肝脏的播散,我们旨在进一步表征LMs对骨骼肌的功能、分子和代谢影响,并检查LMs是否加剧CRC诱导的恶病质。C26衍生的LMs与体重的逐渐减轻以及骨骼肌大小和强度的显著降低有关,这与蛋白质合成代谢标记物的磷酸化降低和蛋白质分解代谢增强一致。mC26宿主表现出糖酵解代谢和脂质积累增强的纤维普遍存在,这与线粒体稳态和能量代谢异常一致。与携带s.c.C26的小鼠相比,mC26宿主的恶病质加重,骨骼肌内的差异表达通路也支持这一点。总的来说,我们的模型概括了转移性CRC的恶病质表型,并揭示了CRC引起的LMs的形成通过促进不同的基因表达特征而加剧了癌症诱导的骨骼肌萎缩。
到2020年底,预计美国将诊断出约148000例新的结直肠癌病例,最终将有53000多人死于该病,这是所有癌症中第二大死亡原因(1). 值得注意的是,在70%的CRC病例中,最严重的障碍是肝转移(LMs)的发展,经常伴有骨骼肌萎缩(即恶病质)的发作(2)这是一种传统营养支持无法治愈的疾病(三–5). 恶病质癌症患者除了肌肉质量下降外,还经历了肌肉力量下降,以及心脏和呼吸衰竭,共同导致功能受损和无法耐受抗癌治疗(6–10). 尽管恶病质已知会对患者的预后和生存产生削弱性影响,但它仍然是一个研究不足的领域,主要是因为在识别新的致病机制和治疗方法方面进展甚微。
使用小动物模型是研究疾病机制和测试对抗疾病的治疗干预措施的一个有用工具。不幸的是,关于癌症恶病质,目前只有少数几种小鼠模型在使用,其分子特性较差是一个主要局限性(11–13). 事实上,除了Colon-26(C26)同种异体小鼠模型外,基因和代谢特征的数据普遍缺失(14)它仍然是研究CRC恶病质最广泛使用的模型(15). 然而,目前用于恶病质研究的循环模型的临床相关性和翻译能力最近受到质疑。事实上,尽管恶病质在肿瘤进展的早期阶段就可以被检测到,但它非常显著,并且与晚期转移癌高度相关(15)从而证实了对转移癌引起恶病质的临床前模型的需要。Tomasin等人最近也优雅地讨论了这一需求,强调了该领域仍然缺乏转移性癌恶病质的高质量、特征明确的临床转化模型这一事实(15). 为了满足这一需求并促进恶病质领域的发展,我们和其他人采用了CRC-相关LMs的潜在新模型,从而利用脾内注射,使肿瘤细胞快速迁移到肝脏(16–20).
在本研究中,我们试图使用特性良好的C26小鼠细胞系来彻底表征结肠直肠LMs模型中的骨骼肌。我们还评估了携带LMs的肿瘤宿主的系统代谢效应,并与传统的C26同种异体移植模型相比,检查LMs的发展是否会加重恶病质表型。总的来说,我们旨在进一步确立开发和使用转移癌临床前模型的重要性,以更好地了解晚期CRC引起的恶病质。在这里,我们证明转移性CRC会导致骨骼肌质量急剧下降,并干扰能量代谢。此外,我们提供了证据表明,与皮下C26肿瘤相比,结肠直肠癌LMs加重了骨骼肌质量和强度的损失,从而强调了使用临床前转移性CRC模型的重要性,以更好地理解晚期CRC引起的恶病质。
结直肠LMs的形成导致体重、肌肉质量和肌肉力量的损失。为了评估结肠直肠LMs对体内骨骼肌质量的影响,CD2F1雄性小鼠脾内注射2.5×105C26肿瘤细胞(mC26)。这一过程导致肝脏通过门脉循环播散后形成LMs,而不会在肝外器官(如脾或肺)中产生肿瘤。在实验过程中,每天监测注射肿瘤和手术不当的动物的体重。在注射肿瘤细胞后,mC26宿主经历了渐进性体重减轻,与假手术动物相比,体重减轻了16%(P(P)< 0.0001;图1,A和B). 与假手术动物相比,mC26宿主的肝脏大小无显著增加(+21%),这可能归因于C26肿瘤在肝脏内的定位(图1,C–E). 体重减轻伴随着几块骨骼肌的消瘦,包括腓肠肌(-26%,P(P)<0.01),胫骨前(-29%,P(P)<0.01),股四头肌(-33%,P(P)< 0.01) (图2A). mC26宿主的骨骼肌质量损失与全身握力下降25%平行(P(P)< 0.01;图2B)以及肌肉萎缩,如胫骨前横截面积减少(CSA;-22%,P(P)< 0.05) (图2C).
mC26肿瘤宿主的体重显著降低。(A类)经脾内注射C26肿瘤细胞(250000个细胞/只小鼠,在无菌PBS中,mC26)或等体积的载体(Sham)的CD2F1雄性小鼠(12周龄)的BW曲线(n个= 5). (B类)净生物量变化(初始到最终),单位为克。(C类)肝脏重量(归一化为初始体重;IBW)。(D类)Sham和mC26小鼠肝脏的代表性全肝和H&E染色。黑色箭头表示肿瘤,图像是放大20倍拍摄的。比例尺:100μm。(E类)Sham和mC26小鼠肝脏内相对肿瘤面积的量化。数据表示为平均值±标准偏差。双尾t吨测试用于确定Sham和mC26之间的差异。差异的重要性:****P(P)<0.0001与Sham。
mC26导致肌肉萎缩和无力。(A类)将CD2F1雄性小鼠(12周龄)的肌肉重量标准化为初始体重(IBW),脾内注射C26肿瘤细胞(无菌PBS,mC26中的250000个细胞/只小鼠)或等量载体(Sham)(n个= 5). (B类)每周全身握力评估(单位:克)。(C类)整个胫骨前肌的横截面积(CSA)和用抗肌营养不良蛋白抗体染色的胫骨前肌肉切片的典型CSA图像。比例尺:100μm。数据表示为平均值±标准偏差。双尾t吨测试用于确定Sham和mC26之间的差异*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01与Sham。
mC26宿主在骨骼肌内经历萎缩信号传导。为了确定骨骼肌质量和肌无力的表型减少是否被合成代谢/分解代谢平衡标记物的破坏所模仿,我们评估了以前与癌症恶病质进展相关的多种蛋白质(14,21–23). 我们观察到磷酸化STAT3/STAT3比率显著增加(+136%,P(P)<0.0001),我们已经在其他癌症诱导恶病质模型中报道过(图3) (14,23). 另一方面,我们观察到ERK或p38磷酸化没有显著变化。尽管磷酸化AKT/AKT比率不变,与参考文献相似。23,我们确实观察到mTOR磷酸化降低(-23%,P(P)<0.05),也是由于总mTOR含量增加(+100%)(图3). 磷酸化-mTOR/mTOR比率的降低进一步得到其2个下游效应器磷酸化-4EBP1(-58%,P(P)<0.05)和磷酸化p70S6K(-45%,P(P)< 0.05) (图3). 除了合成代谢信号的抑制标记外,来自mC26肿瘤宿主的骨骼肌也经历了蛋白质分解代谢的升高标记,包括总蛋白泛素化(+142%,P(P)<0.01)和上调E3泛素连接酶Atrogin-1的基因表达(+671%,P(P)<0.001),MuRF-1(+2384,P(P)<0.05)和Fbxo31(+593%,P(P)< 0.001) (图4,A和B).
mC26破坏骨骼肌合成代谢。CD2F1雄性小鼠(12周龄)肌肉中磷酸化-STAT3、STAT3、磷酸化-ERK1/2、ERK1/2、磷酸化-p38、p38、磷酸化AKT、AKT、磷酸化mTOR、mTOR、磷酸化-4EBP1和4EBP1(印迹1)和磷酸化p70S6K和p70S6K(印迹2)的代表性蛋白质印迹和定量(以相对于Sham的倍数变化表示)脾内注射C26肿瘤细胞(无菌PBS中250000个细胞/只小鼠,mC26)或等量的载体(Sham)(n个= 5). Tubulin被用作两个杂交的负荷控制。磷/总蛋白比率的量化报告为平均值±标准偏差。双尾t吨测试用于确定Sham和mC26之间的差异*P(P)< 0.05, **P(P)< 0.01, ****P(P)<0.0001与Sham。
mC26小鼠蛋白质分解代谢增加。(A类)CD2F1雄性小鼠(12周龄)脾内注射C26肿瘤细胞(无菌PBS中的250000个细胞/只小鼠,mC26)或等量的载体(Sham)后,总泛素和微管蛋白的代表性Western印迹和定量(表示为相对于Sham的折叠变化)(n个= 5). 采用Tubulin作为负荷控制。(B类)通过实时定量PCR测定Atrogin-1、MuRF-1和Fbxo31泛素连接酶的基因表达水平。基因表达标准化为TBP水平。数据表示为平均值±标准偏差。双尾t吨测试用于确定Sham和mC26之间的差异*P(P)< 0.05, **P(P)< 0.01, ***P(P)<0.001与Sham。
mC26破坏骨骼肌线粒体稳态。我们最近证明,癌症或化疗诱发的恶病质伴随着融合和生物生成所需的各种线粒体蛋白的减少(23,24). 因此,我们试图确定是否在mC26恶病质模型中检测到线粒体稳态的破坏。在这里,我们证明了线粒体-2(-27%,P(P)<0.01),PGC1α(-15%,P(P)<0.05)和PGC1β(-44%,P(P)与Sham动物相比,mC26小鼠骨骼肌中的水平<0.01)(图5A). 同时,我们没有发现细胞色素C、OPA1、VDAC、Cox IV或Fis1的蛋白水平或Pink1和Parkin2的基因表达水平发生变化(图5A). 根据线粒体蛋白质的减少,我们评估并测定了丙酮酸脱氢酶(PDH;-87%,P(P)<0.05)和琥珀酸脱氢酶(SDH;-81%,P(P)< 0.05) (图5B)在mC26骨骼肌中。胫骨前肌SDH染色进一步证实了这一点,它揭示了mC26宿主从氧化代谢转变为糖酵解代谢(+14%糖酵化纤维)(图5B). 为了进一步检查骨骼肌能量代谢的可能中断,我们进行了油红O(ORO)染色,发现肌内脂肪积累显著增加(综合密度,+99%,P(P)< 0.01; 面积百分比,+127%,P(P)mC26骨骼肌<0.001)(图5C).
mC26小鼠的骨骼肌显示线粒体功能受损。(A类)CD2F1雄性小鼠(12周龄)肌肉中丝裂霉素-2、细胞色素-C和PGC1α(印迹1;GAPDH用作负荷控制)以及PGC1β、OPA1、VDAC、CoxIV和Fis1(印迹2;微管蛋白用作负荷控制脾内注射C26肿瘤细胞(无菌PBS中250000个细胞/只小鼠,mC26)或等量的载体(Sham)(n个= 5). Pink1和Park2的基因表达水平通过定量PCR测量并标准化为TBP水平。(B类)胫骨前肌丙酮酸脱氢酶(PDH)和琥珀酸脱氢酶的酶活性以及SDH染色和定量。(C类)油红O(ORO)染色和胫骨前肌定量。图像以20倍的放大倍数拍摄。比例尺:100μm。数据表示为平均值±标准偏差。双尾t吨测试用于确定Sham和mC26之间的差异*P(P)< 0.05, **P(P)< 0.01, ***P(P)<0.001与Sham。
核磁共振代谢组学分析揭示了mC26宿主的能量扰动。与我们最近的研究结果一致,我们发现携带C26同种异体移植物的小鼠骨骼肌、血浆和肝脏中的代谢物发生了变化(25),我们旨在评估C26 LM的形成是否发生了类似的扰动。基于核磁共振(NMR)的骨骼肌代谢组学分析显示,葡萄糖显著降低(-52%,P(P)<0.05)在mC26主机中(图6A). 有趣的是,尽管PDH酶活性发生了变化(图5B),骨骼肌乳酸无明显变化(图6A). 然而,三羧酸(TCA)循环成分琥珀酸和富马酸减少了53%(P(P)<0.01)和47%(P(P)<0.05),表明mC26骨骼肌TCA流量受损(图6A). 有趣的是,mC26宿主显示异亮氨酸增加(+53%,P(P)<0.01)、缬氨酸(+51%,P<0.01)、苯丙氨酸(+156%,P(P)<0.0001)和氨基酸衍生物牛磺酸(+18%,P(P)< 0.0001) (图6、B和C). 与骨骼肌葡萄糖的降低一致,mC26宿主也表现出血糖降低(-49%,P(P)<0.01),而血浆乳酸和丙酮酸没有变化(图7A). 与骨骼肌相比,血清支链氨基酸(BCAAs)亮氨酸(-35%,P(P)<0.05),异亮氨酸(-45%,P(P)<0.01)和缬氨酸(-40%,P(P)<0.01)在mC26宿主中减少(图7B). 肝脏代谢组学分析显示葡萄糖显著降低(-89%,P(P)<0.0001)和糖原(-95%,P(P)<0.0001),这与葡萄糖的系统需求增加一致(图8和补充图1; 本文的在线补充材料;https://doi.org/10.1172/jci.insight.136687DS1). mC26宿主的肝乳酸也显著降低(-75%,P(P)<0.001)和丙氨酸(–66%,P(P)<0.01),这可能反映了为了增加血糖水平而试图增加糖异生。酮体3-羟基丁酸增加(+714%,P(P)<0.01),同时NAD降低+(–60%,P(P)<0.01)与脂肪酸氧化和糖异生上调一致。我们还观察到胸膜炎底物谷氨酸显著增加(+218%,P(P)<0.05)-和TCA循环中间产物富马酸(+92%,P(P)<0.05)和苹果酸(+99%,P(P)<0.05)-在mC26宿主中,表明肝脏TCA循环流量增加(图8).
mC26宿主骨骼肌代谢组受损。(A类)糖酵解和三羧酸(TCA)循环的代表图,显示了脾脏内注射C26肿瘤细胞(无菌PBS中的250000个细胞/只小鼠,mC26)或等量载体(Sham)的CD2F1雄性小鼠(12周龄)骨骼肌中代谢物浓度(mM)(n个= 4). (B类和C类)支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)浓度以mM表示(B类)甘氨酸、苯丙氨酸和牛磺酸浓度(单位:mM)(C类)sham和mC26宿主。数据表示为平均值±标准偏差。双尾t吨测试用于确定Sham和mC26之间的差异。差异的重要性:*P(P)< 0.05, **P(P)< 0.01, ****P(P)<0.0001与Sham。
mC26小鼠表现出代谢的系统性改变。(A类)糖酵解代表图显示了CD2F1雄性小鼠(12周龄)脾内注射C26肿瘤细胞(无菌PBS中的250000个细胞/只小鼠,mC26)或等量载体(Sham)后血清中代谢物浓度(mM)(n个= 4–5). (B类)Sham和mC26宿主的血清支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)浓度(mM)。数据表示为平均值±标准偏差。双尾t吨测试用于确定Sham和mC26之间的差异*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01与Sham。
mC26宿主改变了肝脏代谢组。糖酵解和三羧酸(TCA)循环的代表图,显示了脾脏内注射C26肿瘤细胞(无菌PBS中的250000个细胞/只小鼠,mC26)或等量载体(Sham)的CD2F1雄性小鼠(12周龄)肝脏中的代谢物浓度(mM)(n个= 4-5). 数据表示为平均值±标准偏差。双尾t吨使用测试来确定Sham和mC26之间的差异*P(P)< 0.05, **P(P)< 0.01, ***P(P)< 0.001, ****P(P)<0.0001与Sham。
mC26宿主有明显的松质骨丢失。我们和其他人最近已经证明,癌症和化疗诱导的骨骼肌萎缩也可能伴随着骨稳态的破坏,正如我们之前在卵巢癌的ES-2模型以及HT-29和Apc中所表明的那样最小值/+CRC模型(23,26–28). 有趣的是,传统的C26同种异体骨移植模型没有出现明显的骨破坏(28). 因此,我们试图研究mC26模型是否除了骨骼肌消瘦外还导致了骨丢失。为了检测松质骨形态计量学,对Sham和mC26荷瘤小鼠的股骨进行了μCT检查。mC26宿主显示股骨松质骨显著减少。小梁骨体积分数(BV/TV;-45%,P(P)<0.001),小梁厚度(Tb.th;-11%,P(P)<0.05),小梁数(Tb.N;–37%,P(P)<0.01),以及连接密度(Conn.Dn;-28%,P(P)<0.05),而两个小梁分离(Tb.Sp;+51%,P(P)<0.01)和小梁模式因子(Tb.pf;+85%,P(P)<0.01)增加(图9).
结直肠肝肿瘤的形成影响小梁骨。CD2F1雄性小鼠(12周龄)股骨的μCT扫描图像的代表性三维显示和骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离(Tb.Sp)、骨大梁数(Tb.N)、小梁模式因子(Tb.pf)和骨小梁连接密度(Conn.Dn)的量化脾内注射C26肿瘤细胞(无菌PBS中250000个细胞/只小鼠,mC26)或等量的载体(Sham)(n个= 5). 比例尺:1 mm。数据表示为平均值±标准偏差。双尾t吨测试用于确定Sham和mC26之间的差异*P(P)< 0.05, **P(P)< 0.01, ***P(P)<0.001与Sham。
结直肠LMs的形成似乎加剧了骨骼肌萎缩。由于我们观察到先前在同种异体C26肿瘤宿主中未发现的mC26宿主的骨丢失加剧,我们试图研究结肠LMs的形成是否也导致骨骼肌萎缩恶化。为了验证这一点,在另一个实验中,我们将CD2F1雄性小鼠移植到皮下C26同种异体移植或脾内注射以诱导LMs(mC26)。与C26宿主相比,在献祭时,mC26动物的体重减轻幅度更大(-2.35克,-113%,P(P)< 0.01) (图10A). 此外,正如腓肠肌重量的减轻(C26,–19%,P(P)<0.001与对照组相比;mC26,–23%,P(P)<0.0001 vs Sham),胫骨前(C26,–19%,P(P)与对照组相比<0.01;mC26,–25%,P(P)<0.0001 vs.Sham),尤其是股四头肌(C26,–18%,P(P)与对照组相比<0.001;mC26,-31%,P(P)<0.0001对Sham;mC26,–20%,P(P)<0.001与C26)(图10). 有趣的是,与对照组相比,mC26宿主的心脏也在更大程度上减少(–10%,P(P)<0.01)比C26主机(-7%,P(P)< 0.05) (补充图2). 与对照组相比,mC26宿主的心脏ANP和Myh7b基因表达显著降低(ANP,-61%,P(P)< 0.001; 我的7b,-59%,P(P)<0.001)和Sham(ANP,-58%,P(P)< 0.001; 我的7b,-62%,P(P)<0.001)动物比C26宿主(ANP,与对照组相比为-49%,P(P)<0.01,与Sham相比–46%,P(P)< 0.05; Myh7b,与对照组相比,下降了33%,P(P)<0.05,与Sham相比–38%,P(P)< 0.05) (补充图2). 此外,全身握力也显示出mC26的下降幅度更大(-33%,P(P)<0.01)比C26(-22%,P(P)<0.05)小鼠与各自的实验对照(图10).
结肠直肠肝转移加重肌肉萎缩和虚弱。(A类)献祭时的体重(BW)变化(相对于初始体重),单位为克;(B类)肌肉重量标准化为初始体重(IBW);和(C类)CD2F1雄性小鼠(8周龄)全身握力评估(单位:克),皮下注射C26肿瘤细胞(无菌PBS,C26中1000000个细胞/只)或脾内注射(无菌PBS,mC26中250000个细胞/两只)。对照组(C26的Con)和Sham(mC26的对照组)注射等量的载具(n个= 4–6). 数据表示为平均值±标准偏差。进行单向方差分析以确定Con、C26、Sham和mC26之间的差异。#P(P)< 0.05,###P(P)< 0.001,####P(P)<0.0001与Con相比*P(P)< 0.05, **P(P)< 0.01, ***P(P)< 0.001, ****P(P)<0.0001对Sham;$$P(P)< 0.01,$$$P(P)与C26相比,<0.001。
mC26和C26主机具有差异表达的信令网络。由于我们在mC26宿主中观察到恶病质表型加剧,因此我们研究了转移性和非转移性CRC骨骼肌中基因表达特征及其相关途径的差异。下一代RNA测序(RNA-seq)分析显示,与各自的对照组相比,mC26和C26之间有大量共同的基因(>60%)。然而,发现1227和1494个差异表达基因分别是C26和mC26独有的(图11,A和B). 然后使用差异表达的基因进行通路和上游调节器分析,揭示C26和mC26宿主内常见和差异改变的信号通路,以及不同的上游调节器(图11,C–E). 有趣的是,C26和mC26之间唯一类似的改变途径之一是钙信号,这表明LMs的形成明显改变了骨骼肌内的信号。已确定的上游调节因子在两组之间也存在差异,在C26骨骼肌中发现TLR2和SOCS1,在mC26骨骼肌肉中发现NOS1和STAT1。
骨骼肌RNA序列分析揭示了C26和mC26小鼠中差异表达的基因。对从CD2F1雄性小鼠(8周龄)骨骼肌中提取的完整RNA进行下一代RNA测序,该雄性小鼠注射C26肿瘤细胞s.c.(无菌PBS,C26中1000000个细胞/只小鼠)或脾内注射(无菌PBS,mC26中250000个细胞/小鼠)。对照组(C26的Con)和Sham(mC26的对照组)注射等量的载具(n个= 5–6). (A类)热图表示C26和mC26骨骼肌中差异表达基因的完整列表。基因的截止值为折叠变化1.5,FDR为0.05。(B类)差异表达分析确定了C26和mC26之间的4277个共同基因,以及几个独特的基因。(C类)前10个代表性通路:使用C26(1227个基因)和mC26(1494个基因)中的独特基因进行分析。方点表示–对数10 P(P)值。蓝色表示C26中确定的途径,红色表示mC26中的途径。(D类和E类)在我们的C26和mC26差异表达分析中确定的上游调控因子。蓝色表示抑制,橙色表示激活调节器。
根据最近的统计,CRC是美国和全世界第三大最常见的癌症,估计一生中发生CRC的概率为1/25,它仍然是一个主要的健康问题(1). 恶病质,包括CRC在内的几种癌症的毁灭性共病(2)直接导致20%以上的癌症相关死亡,抗癌药物常常使其恶化(8–10,24,29,30). 我们和其他人讨论了保持瘦体重对提高癌症患者治疗耐受性和生存结果的重要性(31). 尽管跨越了几十年,但研究工作在治愈恶病质方面进展甚微,这可能也是由于临床前动物模型的可用性有限。事实上,最近有人讨论说,在过去10年中,用于恶病质研究的临床相关和转化动物模型的使用发生了最小的变化(15). 当将当前的动物模型转化为转移性癌恶病质时,尤其是对于CRC而言,这一点尤其正确,在CRC中,携带C26的小鼠仍然是使用最广泛、最公开和最具特征的模型(15). 鉴于恶病质通常在较晚期的CRC患者中观察到,这些患者通常患有LMs,很明显,需要更好、更具特征性的转移性CRC恶病质模型,不仅是为了更好地从机制层面了解疾病,同时也希望抵消瘦体重的损失,以提高生存率(2). 在本文中,我们试图通过描述CRC恶病质转移模型来缩小这一文献中的紧迫差距。
为了模拟转移性CRC恶病质的恶病质表型,我们采用脾内注射的方法,通过小鼠C26大肠肿瘤细胞在体内传播LMs。这种诱导LMs的特殊方法是癌症生物学中常用的公认的最先进的模型,并且已经成为研究恶病质的一个越来越感兴趣的领域。尽管这种特殊的方法以前曾被用于证明与LMs相关的肌肉消耗(16,18),已经研究了与转移性CRC相关的骨骼肌的最小遗传、代谢或分子改变。在本研究中,我们证明C26 LMs可导致体重逐渐下降(图1)伴有几块骨骼肌严重萎缩和力量逐渐下降(图2). 此外,我们证明骨骼肌的消耗伴随着骨骼肌合成代谢、分解代谢、线粒体稳态和能量代谢的破坏。
我们和其他人在一些肿瘤模型中,包括C26同种异体移植物和Apc中,发现STAT3与癌症诱导的肌肉萎缩有关最小值/+CRC模型以及Lewis肺癌(LLC)、B16黑色素瘤和ES-2卵巢癌模型(14,21,23,32–38). 与这些发现一致,这里我们显示mC26宿主中STAT3磷酸化显著增加(图3)表明STAT3可能是C26转移性肿瘤中癌诱导肌肉萎缩的关键预测因子。随着STAT3信号转导的增加,我们也证明了蛋白质分解代谢的增加,如蛋白质泛素化增加以及E3泛素连接酶Atrogin-1、MuRF-1和Fbxo31的表达增加所示(图4)之前曾报道与恶病质肌肉相关,包括与LM相关的恶病质(18,23,39–41) (18,23,39–41). 有趣的是,我们没有观察到之前描述的在癌症恶病质中起作用的其他几种蛋白质的活化发生变化,包括ERK(图3),先前显示携带C26同种异体移植小鼠的骨骼肌增加(22). 另一方面,p38和AKT磷酸化未发生变化(22)尽管mTOR及其2个下游效应器4EBP1和p70S6K的磷酸化降低(图3). 这与White等人的工作一致,他们的工作表明Apc中mTOR、4EBP1和p70S6K的减少最小值/+CRC模型(42). 此外,Murphy等人之前提到的工作表明,在患有LM的动物中,AKT的磷酸化没有变化,p70S6K的磷酸化降低(18).
最近,线粒体在癌症恶病质骨骼肌质量维持中的作用受到了广泛关注。沿着这条路线,我们和其他人已经证明,患有癌症或接受化疗的小鼠骨骼肌中线粒体蛋白的丢失与肌肉质量和力量的损失相关(23,24,43,44). 此外,Brown等人最近证明,线粒体功能障碍实际上可能先于恶病质LLC模型中的肌肉萎缩,而Xi等人能够证明,Mitofusin-2的过度表达可以部分维持CRC中的骨骼肌质量(43,44). 在本研究中,我们发现mC26宿主的线粒体蛋白质水平降低,包括线粒体丝裂霉素-2、PGC1α和PGC1β(图5)与我们之前发表的C26同种异体移植小鼠的研究结果一致,而细胞色素C和OPA1没有变化(29). 与线粒体稳态受损相一致,我们还观察到SDH活性显著降低。这也与我们和其他研究小组之前的研究结果一致,这些研究表明患有癌症或接受化疗的恶病质动物的肌肉SDH活性降低(18,23,24).
鉴于骨骼肌线粒体受到干扰,我们想评估mC26宿主是否也经历了骨骼肌和全身的能量代谢受损。最近,我们发现患有CRC和接受化疗的动物骨骼肌和全身能量代谢紊乱(25,45). 我们目前的研究结果表明,mC26宿主的血浆和骨骼肌葡萄糖降低反映了葡萄糖代谢的系统需求增加(图6和7). 这也与我们之前的观察结果一致,即C26同种异体移植模型的血糖降低(25). 同样与我们之前的研究相似,这里我们显示循环BCAA减少,与肌肉分解代谢增加和随后的氧化一致。在脓毒症和创伤以及内毒素或肿瘤坏死因子治疗后,全身和骨骼肌中的BCAA氧化增加(46–48). 有趣的是,在mC26骨骼肌中,我们发现异亮氨酸和缬氨酸升高,这与骨骼肌蛋白质的积极分解代谢相一致。有趣的是,mC26骨骼肌中的TCA中间产物琥珀酸和富马酸被抑制,这意味着TCA流量减少。这与SDH和PDH酶活性降低一致(图5B)也表明氧化代谢受损。骨骼肌氧化环境受损与糖酵解作为主要能量产生途径的转变一致(图6A).
由于mC26宿主骨骼肌和血浆的代谢组均显示出严重损伤,我们想评估肝脏是否显示出类似的变化,特别是考虑到肝脏在能量应激时的强大代谢灵活性。事实上,我们在这里表明,血浆和骨骼肌对葡萄糖的高系统需求也反映在肝脏葡萄糖的急剧下降上(图8)和糖原(补充图1). 这些改变模拟了先前的数据,显示C26宿主的肝葡萄糖和糖原降低(25). mC26宿主的肝脏丙氨酸和乳酸水平显著降低,这与它们在糖异生中的用途一致(图8) (25). 3-羟基丁酸酮体的急剧增加(+714%)与糖异生的增加一致。在这些条件下,通常用于与乙酰辅酶A缩合形成柠檬酸盐并供给TCA循环的草酰乙酸盐被还原为苹果酸,并继续进行糖异生途径。因此,脂肪酸β-氧化后的乙酰辅酶A备份导致3-羟基丁酸的形成。NAD减少+观察到,这与它在β-氧化中的消耗量一致。在mC26宿主中,TCA循环中间产物苹果酸和富马酸以及胸膜基质谷氨酸显著增加,表明TCA循环活性增加。在C26携带者的肝脏中,TCA流量显著增加并不明显,这表明肝脏肿瘤浸润可能会引起更大的能量扰动(25).
鉴于需要改进转移性癌恶病质模型以加深我们对该疾病的理解,也有必要更好地描述受不同类型肿瘤和化疗负面影响的多个器官(49). 事实上,研究恶病质中的器官串扰可能为找出导致这种忧郁症的机制提供重要线索。我们的团队和其他人已经证明,癌症引起的恶病质不仅影响骨骼肌,而且还损害心脏、脂肪和骨骼(23,26,28,50). 特别是,最近的观察表明,异常肌肉-骨骼串扰可能在癌症恶病质中发挥重要作用。例如,在多个CRC小鼠模型中生成的观察结果,包括C26、HT-29和Apc最小值/+,显示出不同程度的骨质流失,尽管骨骼肌质量持续下降(28). 有趣的是,C26肿瘤宿主股骨中的松质骨通常保持不变,而在本研究中,使用C26肿瘤细胞诱导LMs足以驱动骨骼肌和骨丢失(图9)进一步表明LMs的骨表型恶化。我们的数据还表明,由于LMs通常发生在晚期CRC患者中,因此应检查骨密度,尤其是考虑到骨丢失加剧可能会进一步导致肌肉丧失和虚弱(50).
鉴于发现mC26宿主发生骨丢失,与携带s.c.C26肿瘤的小鼠的正常骨表型相比,我们试图了解转移性肿瘤宿主的骨骼肌丢失是否也加剧。在一项直接比较C26同种异体移植小鼠和mC26肿瘤小鼠的后续实验中,我们发现在LMs存在的情况下,体重、骨骼肌质量、心脏大小以及全身握力的损失更大,而mC26的股四头肌比C26肿瘤宿主小20%(图10和补充图2). 尽管mC26宿主最初获得的肿瘤细胞数量少于C26宿主(2.5×10),但患有CRC LMs的动物中出现了更严重的消瘦现象5与1.0×106)。这一点值得注意,因为它暗示注射部位是恶病质发展的关键预测因子,千叶等人(Chiba et al(51). 尽管如此,该研究并没有考虑LMs的影响。为了了解可能导致这种恶化的途径,我们对股四头肌进行了RNA-seq。我们发现,mC26和C26宿主中60%以上的基因改变是相似的,包括已知的肌肉萎缩预测因子,如STAT3、MurRF-1、Atrogin-1、FBXO31和PDK4(14,21,39–41,52). 然而,在mC26宿主中,这些基因的折叠变化升高通常更大(STAT3,5.6对4.6;MuRF-1,25对20;Atrogin-1,14对13.9;FBX031,6对6.2;PDK4,8.7对5.7),这可能在一定程度上解释了肌肉萎缩恶化的原因。使用差异表达基因进行的后续通路分析确定了几种差异调节通路,以及mC26和C26肿瘤宿主体内的差异上游调节器(图11、D和E). 包括钙、sirtuin、STAT3、PTEN和氧化磷酸化在内的几种调制途径与肌肉消耗性疾病有关(14,21,23,25,53–55). 已确定的C26调节因子TLR2先前已显示可介导肌管萎缩,但在目前的研究中,TLR2被发现下调(56). 我们还确定STAT1是mC26骨骼肌内的上游调节因子。有趣的是,STAT1最近被认为是自噬的调节因子,自噬是一种已知在恶病质癌症患者和恶病质动物模型中上调的降解过程(57–59). 未来的研究将探讨这些途径,以更好地了解LMs的形成对骨骼肌信号的不同改变机制。
总的来说,我们的研究清楚地表明,LMs的形成会诱导甚至加重CRC诱导的肌肉萎缩。虽然我们检查并确定了携带LMs的肿瘤宿主骨骼肌内的差异信号网络,但目前的研究并未探讨CRC转移如何改变肝脏内分泌功能以及这可能最终如何影响骨骼肌消瘦。此外,仅使用组织学分析粗略评估了mC26模型中的肿瘤负担,因此可能代表了我们方法的局限性,并阻止我们与C26宿主中的肿瘤大小进行直接比较。考虑到寻找更具翻译相关性的模型,本研究的另一个局限性是恶病质发展的缩短性质。虽然本研究的目的是在CRC LM的背景下检测恶病质,但未来的研究可能会考虑使用低剂量的C26肿瘤细胞或可能允许恶病质进展超过2周的其他CRC细胞。此外,在本研究中,我们没有考虑化疗药物的使用是否会进一步加剧肌肉萎缩,特别是考虑到我们的实验室和其他实验室已经证明,几种抗癌化合物诱导恶病质的发生与它们对肿瘤生长的影响无关(24,26,27,29,30,60). 最后,当前研究的另一个局限性是将重点放在雄性动物上,忽略了对LMs的反应可能存在的性别差异。由于在其他CRC模型中已发现性别二型性,未来的研究应探讨LMs如何影响男性与女性的骨骼肌(33).
总之,我们已经证明C26 CRC LMs的形成会导致强健骨骼肌萎缩。mC26宿主的骨骼肌萎缩伴随着蛋白质分解代谢升高、线粒体内稳态破坏和骨骼肌代谢紊乱。C26 LMs的形成还导致能量代谢的系统性改变和骨稳态受损。此外,与C26皮下肿瘤诱导的CRC恶病质相比,C26 LMs的形成加重了恶病质并诱导骨骼肌内的差异基因表达。总的来说,我们的研究为使用体内转移模型研究癌症恶病质提供了支持。
细胞系。在进行动物实验之前,由Donna McCarthy(美国俄亥俄州哥伦布俄亥俄州立大学)提供的C26细胞在补充有10%FBS(赛默飞世尔科学)、1%青霉素/链霉素(赛默飞科学)和1%丙酮酸钠(赛默菲世尔科学并保持在5%的CO中2,37°C增湿培养箱。C26细胞进行培养、传代,并在分流后进行胰蛋白酶化,以备在无菌盐水中进行动物注射。
动物。对于结直肠LM模型,我们使用了实验室和其他实验室以前使用的方法(16–20,61). 简单地说,将12周龄CD2F1(ENVIGO)雄性小鼠置于麻醉下,并进行侧肋下切口以仔细暴露脾脏。然后向动物脾内注射100μL含2.5×10的生理盐水5C26肿瘤细胞(mC26)或单独生理盐水(Sham)1分钟,然后2分钟止血(n个=5/组)。脾内注射方法允许肿瘤细胞快速进入门静脉循环,从而浸润肝脏,而不会在脾脏或其他常见的结直肠癌转移部位(如肺)形成肿瘤。在另一项实验中,8周龄CD2F1雄性小鼠的脾脏内(mC26;2.5×105)或s.c.(C26;1.0×106)注入C26细胞(n个=4-6/组)(62). 非荷瘤小鼠(对照组)和假手术小鼠(sham)作为对照组。小鼠每天称重,然后在轻度异氟醚麻醉下安乐死。在处死时,采集骨骼肌组织,称重,在液氮中进行snap冷冻,并将其储存在−80°C下以供进一步研究。如前所述,胫骨前肌在液氮冷却异戊烷(Thermo Fisher Scientific)中冷冻进行组织学检查(23). 所有小鼠尸体,包括部分肝脏,在10%中性缓冲福尔马林(赛默飞世尔科技公司)中固定2天,然后转移到70%乙醇中。
全身握力评估。如前所示,使用商用自动握力仪(哥伦布仪器)评估全身握力(63). 在5次测量中记录了绝对力(单位为克),前3次测量用于分析。为了进一步避免习惯化偏见,实验期间只对动物每周进行一次测试。
H&E染色。为了检查LM的形成,将固定的肝组织石蜡包埋并切片(10μm),以准备H&E染色(23). 然后在Axio观察仪下观察染色的肝脏切片。记录Z1电动显微镜(蔡司)和5×图像进行肿瘤浸润评估。使用ImageJ 1.43软件(NIH)评估图像中肿瘤面积相对于肝脏面积的比例(以百分比表示)。
肌肉CSA。为了评估骨骼肌萎缩,在中腹取胫骨前肌10μm厚的冰冻切片,如前所述进行免疫染色(30). 简言之,切片在室温下封闭1小时,并在4˚C下用肌营养不良蛋白一级抗体(美国爱荷华州爱荷华市发育研究杂交瘤银行;MANDRA1[7A10])孵育过夜,然后在室温下孵育1小时二级抗体(AlexaFluor 594,a-11032,Thermo Fisher Scientific)。使用Lionheart LX自动显微镜(BioTek仪器)分析整个肌营养不良蛋白染色切片的CSA。
蛋白质印迹。通过在RIPA缓冲液(150 mM NaCl[Thermo Fisher Scientific]、1.0%NP-40[Sigma-Aldrich]、0.5%脱氧胆酸钠[Thermo-Fisher科学]、0.1%SDS[Thermo-Fisher科学]和50 mM Tris[Thermo Fisher科学]pH8.0)中均匀化50 mg股四头肌组织,获得骨骼肌蛋白提取物添加蛋白酶(罗氏)和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(赛默飞世尔科学公司)。通过离心(15分钟;14000克; 4˚C),收集上清液,并使用BCA蛋白质分析方法(Thermo Fisher Scientific)测定蛋白质浓度。然后在4%–15%梯度SDS标准TGX预制凝胶(Bio-Rad)中电泳蛋白质提取物(30μg),然后将凝胶转移到硝化纤维素膜(Bio-Rad)。在室温下用SEA BLOCK封闭试剂(赛默飞世尔科学公司)封闭膜1小时,然后用稀释抗体在4°C下用含有0.2%吐温-20(赛默飞科学公司)的SEA BLOCK缓冲液(赛默费希尔科学公司)培养过夜,轻轻摇晃。用含有0.2%吐温-20(PBST)的PBS清洗后,在室温下用抗兔IgG(H+L)DyLight 800(目录5151S)或抗鼠IgG,H+L,DyLight680(5470S)二级抗体培养膜1小时(细胞信号技术)。然后使用奥德赛红外成像系统(LI-COR Biosciences)对斑点进行可视化和定量。所使用的抗体为磷酸-STAT3(Tyr705,目录9145)、STAT3(目录12640)、磷酸-ERK1/2(Thr202/Tyr204,目录4370)、ERK1/2(目录4695)、磷酸-p38(Thr180/Tyr182,目录4511)、p38(目录9212)、磷酸-AKT(Ser473,目录4060)、AKT(目录9272)、磷酸-mTOR(Ser2448,目录5536)、mTOR(目录2983)、,Cell Signaling Technologies提供的phospho-4EBP1(Thr37/46,目录2855)、4EBP1(目录9644)、phosphoto-p70S6K(Thr389,目录9234)、p70S6K(目录9209)、泛素(目录3933)、线粒体-2(目录9482)、细胞色素C(目录11940)、OPA-1(目录80471)、COX IV(目录4844)、VDAC(目录4866)和GAPDH(目录97166);MilliporeSigma的PGC-1α(目录AB3242);来自Abcam的PGC-1β(目录ab176328);Proteintech的FIS1(目录10956-1-AP);以及来自发育研究杂交瘤库的α-微管蛋白(目录12G10)。一般来说,磷酸化蛋白水平被归一化为各自总蛋白的表达,微管蛋白或GAPDH被用作负荷控制。
定量PCR(qPCR)。按照制造商提供的方案,使用mi-REasy Mini Kit(Qiagen)从股四头肌中分离RNA。使用Synergy H1分光光度计(BioTek)定量RNA。使用Verso cDNA试剂盒(Thermo Fisher Scientific)将总RNA反向转录到cDNA。利用TaqMan基因表达分析系统(Invitrogen),通过实时PCR(Light Cycler 96,Roche)测量转录水平。检测了Atrogin1(Mm00499523_m1)、MuRF1(Mm01185221_m1)、Fbxo31(Mm00505343_m2)、Pink1(Mm 00550827)Park2(Mm0450187)、ANP(Mm01255747)、BNP(Mm 01255770)和Myh7b(Mm1249941)的表达水平。使用标准2将基因表达标准化为TBP(Mm01277042_m1)水平-ΔΔCT方法。
PDH和SDH酶活性。根据制造商的说明,使用MilliporeSigma的比色分析试剂盒(分别为MAK183和MAK197)测量PDH和SDH的酶活性。简单地说,将10 mg股四头肌均匀放置在100μL冰镇分析缓冲液中,然后离心(5分钟;10000×克; 4°C)。将总计10μL的样品上清液添加到96 well板中。将PDH和SDH反应混合物加入适当的孔中,得到与酶活性成比例的比色(PDH为450nm,SDH为600nm)产物。通过培养平板(PDH为37°C,SDH为25°C)并每隔5分钟进行测量(450 nm和600 nm),持续30分钟,记录吸光度。
SDH染色。在低温恒温器上将胫骨前肌切成10μm的横截面,并在37°C下用0.5 mg/mL硝基四氮唑蓝(MilliporeSigma)、50 mM琥珀酸钠(MilliopreSigma-)和0.08 mM甲基硫酸吩嗪(Thermo Fisher Scientific)在PBS中孵育30分钟。然后将切片在去离子水中漂洗3次,安装PBS-甘油(MilliporeSigma),并使用Axio Observer拍照。Z1电动显微镜(卡尔蔡司)。使用ImageJ软件(NIH)对整个SDH染色切片的综合密度、总纤维数、氧化纤维数和糖酵解纤维数进行量化。
ORO染色。为了进行ORO染色,将胫骨前肌切片(10μm)并立即固定在冰冷的甲醛(3.7%;Thermo Fisher Scientific)中1小时。切片在Milli-Q水(MilliporeSigma)中连续清洗,并在ORO工作溶液中染色(如前所述制备;参考文献。64)ORO染色后,再次在Milli-Q水中连续冲洗切片,然后在流动自来水中冲洗10分钟。切片安装在50%的甘油中(PBS中),并使用Axio Observer拍照。Z1电动显微镜(蔡司)。使用ImageJ软件分析整个ORO染色切片的信号强度和阳性染色面积。
核磁共振代谢组学分析。通过使用500μL氘化磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释100μL血浆,该缓冲液含有最终浓度为0.5 mM的2,2,-二甲基-2-硅烷-5-磺酸钠(DSS;Thermo Fisher Scientific),制备用于NMR分析的血浆样品,以用作化学位移和定量参考。溶液通过10 kDa分子量截止过滤器(MilliporeSigma)过滤,以去除大蛋白。然后将样品置于5 mm核磁共振管中进行分析。按照之前执行的甲醇/氯仿-水程序制备肌肉和肝脏组织以进行核磁共振分析(25). 所有样本均使用~100 mg的组织样本,但记录实际重量以使数据正常化。核磁共振数据是在Bruker Avance III 700 MHz核磁共振波谱仪上获得的,该波谱仪带有一个在25°C下工作的TXI三重共振探针。通过覆盖12 ppm的1D NOESY脉冲序列收集光谱。在3.9秒的采集时间内,用32768个点对光谱进行数字化。混合时间设置为100 ms,扫描之间的松弛延迟设置为2.0秒。然后使用高级化学开发Spectrus处理器(版本2016.1)处理所有数据。将光谱零点填充至65536点,并使用0.3-Hz衰减指数函数切趾,然后进行快速傅里叶变换。对所有样本进行自动相位校正和一阶基线校正。使用Chenomx NMR Suite(8.2版)量化代谢物浓度。DSS-d6用作所有光谱的化学位移和量化参考,并设置为0.00的化学位移以及500μM的浓度。在批处理模式下对每个光谱进行定量拟合,然后进行手动调整,以纠正光谱重叠引起的错误。对于组织样品,最终浓度根据用于制备每个样品的组织重量进行标准化。按照制造商的说明,使用比色法糖原测定试剂盒II(Abcam,ab16955)对肝组织中的糖原进行定量。
股骨骨形态计量学的μCT分析。μCT扫描测量股骨干骺区的形态学指标。安乐死后,将左侧股骨包裹在浸泡过盐水的纱布中,并在-20°C下冷冻直至成像。骨样本围绕其长轴旋转,使用Bruker Skyscan 1176采集图像,参数如下:像素大小,9μm三; 峰值管电位,50 kV;x射线强度,500μA;以及0.3°旋转步长。使用羟基磷灰石模型进行灰度级校准。根据该校准和生成的相应标准曲线,等效的最小羟基磷灰石钙水平为0.42 g/cm三使用SkyScan重建软件(NRecon,Bruker)将原始图像重建为使用三维锥束算法的三维横截面图像数据集。使用Skyscan CT Analyzer软件(CTAn,Bruker)计算重建图像的结构指数。股骨远端生长板下1.0至2.0 mm的小梁骨采用80–255的阈值进行分析。小梁参数包括BV/TV、Tb。N、 Tb、。Th、Tb。Sp和Tb.pf。
RNA序列。首先使用安捷伦生物分析仪2100评估总RNA的数量和质量。对于RNA质量,要求RNA完整性数(RIN)为7或更高。总共使用了50 ng总RNA。根据KAPA mRNA Hyper Prep Kit技术数据表KR1352–v4.17(Roche),cDNA文库制备包括mRNA纯化/富集、RNA片段化、cDNA合成、指数适配器连接和扩增。每个产生的索引文库都被量化,其质量通过Qubit和Agilent生物分析仪进行评估,多个文库以等摩尔浓度合并。在加载到HiSeq 4000进行75 bp末端测序(Illumina)之前,对每条通道共5μL的2 nM混合文库进行变性、中和,并应用于cBot进行流式细胞沉积和簇扩增。每个库大约产生3000万次读取。采用Phred质量评分(Q评分)来衡量测序质量。90%以上的排序读取达到了Q30(99.9%的基本调用准确率)。测序数据首先使用FastQC(Babraham生物信息学)进行质量控制评估。然后,使用STAR RNA-seq对准器将所有测序文库映射到小鼠基因组(mm10)(65)使用以下参数:“--outSAMmapqUnique 60”。使用bamutils(来自ngsutils)评估基因组中的reads分布(66). 使用featureCounts(来自subread)为mm10 refGene基因指定唯一映射的测序读取(67)使用以下参数:“-s 2–p–Q 10”。使用MultiQC总结测序和绘图结果的质量控制(68). 在4个以上的样本中,删除了读取计数(CPM)<0.5的基因。使用TMM(M值的修剪平均值)方法对数据进行归一化。使用edgeR进行差异表达分析(69). FDR是根据P(P)使用Benjamini-Hochberg程序的值。热图是使用Partek Flow基因组分析软件生成的。使用灵巧途径分析(IPA;QIAGEN Inc.)软件识别典型途径和上游调节器(70). 具有的路径P(P)<0.05被认为是显著的。我们只考虑了数据集中差异表达的上游分子。我们考虑了具有z评分的路径。本出版物中讨论的数据已保存在NCBI的基因表达综合数据库中,可通过GEO系列登录号GSE142455访问(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE142455) (71).
统计。双侧t吨测试用于确定Sham组和mC26组之间的差异图1-9进行单向方差分析以确定对照、C26、Sham和mC26之间的差异。事后比较通过Tukey检验完成,统计显著性先验设定为P(P)≤ 0.05. 使用GraphPad Prism 7.04进行所有统计,所有数据均以平均值±SD表示。
研究批准。所有研究均符合实验动物护理和使用指南(国家科学院出版社,2011年)和1964年《赫尔辛基宣言》及其后来的修正案。此外,这些研究是根据印第安纳大学医学院IACUC的批准进行的(IU IACUC协议编号11275)。
JRH、LJN和AB构思并设计了实验;JRH、LJN和FP进行了体内实验、握力分析和恶病质的分子表征;TMO分析代谢组学数据;JRH、AN、TAZ和AB分析了RNA-seq数据;JRH、TMO和AB撰写并编辑了这篇论文。
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本研究得到了印第安纳大学外科和耳鼻咽喉头颈外科的支持,获得了国家癌症研究所(R01CA122596,R01CA194593)、退伍军人管理局(1I01-BX004177-01)、卢斯特加滕基金会和IU西蒙癌症中心(NIH P30CA082709)对TAZ的资助,以及由Showalter Research Trust、V癌症研究基金会(V2017-021)、美国癌症学会(研究学者基金会132013-RSG-18-010-01-CCG)向AB提供的资助。JRH得到了NIH T32机构培训资助(AR065971)的支持。RNA测序在印第安纳大学医学院医学基因组中心进行,该中心部分得到印第安纳大学印第安纳基因组计划(INGEN)的支持;INGEN的部分支持由礼来捐赠公司提供。12G10号抗微管蛋白单克隆抗体(由Frankel J.和Nelsen E.M.在爱荷华州大学开发)和MANDRA1(7A10)抗肌营养不良蛋白单抗(由NE Wales Institute的Morris G.E.开发)来自发育研究杂交瘤库,由NIH NICHD创建,由美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学生物系维护。
利益冲突:提交人声明,不存在利益冲突。
版权:©2020,美国临床研究学会。
参考信息:JCI洞察力. 2020;5(9):e136687。https://doi.org/10.1172/jci.insight.136687。