阿尔茨海默病所致轻度认知障碍和痴呆患者的脑源性神经营养因子血清水平和海马体积

阿尔茨海默病（AD）与海马萎缩和记忆力下降有关[1,2]. 记忆障碍是AD早期患者最常见的症状之一；它的特点是外显记忆缺陷，特别是情景记忆和工作记忆功能[三]. 这些缺陷反映了海马结构的参与[4]. 言语和情景记忆受损与海马结构和内嗅皮层体积减少相关，体积扫描可减少25%[5]. 萎缩最明显的部位是内嗅皮层和颞上回，并延伸至前扣带回[5]。

最近，人们的观念发生了转变，认为AD存在于痴呆症发作之前[6]. 因此，国际工作组的诊断标准中包括了一种无明显功能损害的记忆/认知障碍临床表现型，称为轻度认知障碍（MCI）[7]和美国老年痴呆症协会（NIA-AA）[6]. NIA-AA标准还提出了一些生物标记物来支持这种痴呆前期或前驱性AD诊断。在这些生物标记物中，包括以内侧颞区萎缩为阳性诊断信息的结构神经成像。结合不同的生物标记物，包括海马体积测定，对MCI患者区分AD和正常衰老具有良好的预测价值[6]。

脑源性神经营养因子（BDNF），一种在海马高度表达的神经营养素[8]是突触可塑性和记忆形成的重要组成部分[9,10]. BDNF与海马可塑性有关[9,11]它的作用在长时程增强机制中起着核心作用，长时程强化是记忆形成的最受接受的模型之一，它导致结构突触的改变[9,10]. 然而，尽管有所有可用的信息，但对于神经退行性疾病，尤其是AD患者的血清BDNF水平还没有达成共识。虽然一些研究报告称，与健康受试者相比，AD患者的BDNF血清水平较低[12,13,14]，其他研究表明AD患者的BDNF血清水平较高[15]或AD和控制之间没有差异[16]。

同样，关于AD和其他痴呆患者脑脊液（CSF）BDNF水平的研究报告了相互矛盾的结果。Forlenza等人[17]在健忘症MCI患者中，脑脊液BDNF浓度降低与AD进展相关。Blasko等人[18]未发现AD和对照组之间的BDNF存在显著差异，Laske等人[19]与健康对照组和非AD痴呆患者相比，AD患者的脑脊液BDNF浓度更低。此外，一项针对健康老年人的研究表明，脑脊液BDNF水平较低与记忆力较差和认知能力下降较快有关[20]。

BDNF基因变异性或BDNF循环水平对健康老年人和MCI或早期痴呆患者记忆和海马体积的影响也进行了评估，结果不一致。在患有遗忘性MCI和淀粉样蛋白β高蓄积的个体中，BDNF-Val66Met携带者表现出情节记忆和海马体积的显著且较大的下降[21]. 在MCI参与者的队列中，低循环BDNF与记忆缺陷之间存在显著相关性[14]. 一项与健康老年人的研究发现，BDNF血清水平和海马体积呈正相关[22]，但没有进一步观察到这种关系[23]. 此外，在认知正常和早期痴呆患者的两个大型独立中老年队列中，未发现BDNF在海马体积和记忆中的基因型或血浆方面有显著影响[24]. 最后，衰老本身与海马体积减少、血清BDNF水平降低和记忆力下降有关[22]。

因此，本研究的目的是评估MCI和AD痴呆患者以及健康老年参与者的BDNF血清水平和海马体积。在整个样本中还评估了BDNF血清水平与海马体积之间的关系。

样本由10名健康老年人、10名MCI患者和13名AD痴呆患者组成。健康老年人是社区居民，他们陪伴内科患者，功能独立，Mini-Mental State Examination（MMSE）评分>26，该人群的认知能力高于临界值，临床痴呆评定量表得分为0。NIA-AA关于AD所致MCI的核心临床标准用于确定MCI组：（1）反映患者或告密者或临床医生报告的认知变化的认知问题（即，历史或观察到的随时间下降的证据）；（2） 一个或多个认知领域受损的客观证据，通常包括记忆（即正式或床边测试，以确定多个领域的认知功能水平）；（3） 保持功能能力的独立性；（4）没有精神错乱。此外，临床病史排除了血管性、创伤性、医学性认知功能下降和常染色体显性遗传型AD的可能[6]. 所有痴呆症患者均符合NIA-AA标准，即AD可能导致痴呆[25]. 患者（MCI和痴呆）选自巴西阿雷格里港Clinicas de Porto Alegre医院的痴呆门诊。

所有受试者都接受了临床病史和体检，即MMSE[26,27]临床痴呆评定量表[28,29,30]、日常生活活动和工具性日常生活活动功能量表[31]以及多领域认知评估。该认知成套测验通过Rey听觉言语学习测试评估了情景记忆、执行功能、注意力控制、视觉空间技能和语言[32]数字复制和CERAD词表测试[33]、时钟绘制测试[34]、试跑测试[35]，数字向前跨距[36]以及字母和类别的流畅性[37]. 考虑可用的年龄和教育规范来评估每项测试的分数。

所有参与者和/或代理人均出具书面知情同意书，所有程序均由阿雷格里港Clinicas de Porto Alegre研究伦理委员会（#110275）批准。

在临床评估期间，在血清分离管中收集非铸型血液样本，离心、校准并储存在-80°C下。

使用BDNF特异性单克隆抗体（R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）通过夹心ELISA测定血清样本中的BDNF水平。简单地说，在室温下用4μg/mL的单克隆抗BDNF抗体在PBS中对微量滴定板进行涂布过夜。然后，用洗涤缓冲液将滴定板清洗3次，并在室温下使用含有5%脱脂奶粉的PBS封闭1h。清洗后，在4°C下用1:200稀释在样品稀释剂（含1%BSA的PBS）中的样品在板上涂布过夜，标准曲线范围为7.8至500 pg/mL的BDNF。再次清洗平板，在PBS中添加0.2μg/mL的生物素化抗BDNF抗体，并在室温下培养2 h。清洗后，在室温下用链霉亲和素过氧化物酶结合物（在样品稀释剂中稀释1:1000）培养1小时。在室温下清洗平板并与基质孵育20分钟。最后，加入终止溶液，并通过在450nm处的吸光度测定BDNF的量。标准曲线显示了光密度与BDNF浓度之间的直接关系。

利用Philips Achieva 1.5-Tesla扫描仪（荷兰阿姆斯特丹）获得磁共振成像（MRI）数据。采用NEX=1，图像矩阵=256×232，翻转角度=8°，TE=4ms，TR=8.63ms，体素尺寸=1×1×1mm，获得T1高分辨率矢状面三维磁化包裹快速采集梯度回波^三从而产生160个切片。在220×220 mm视场下，获得了轴向流体衰减反转恢复，TR=11000 ms，TE=140 ms，TI=2800 ms，turbo因子=55，EPI因子=1，NEX=3，层厚=5 mm，矩阵=186×512，提供1×0.86 mm的像素测量值。这种流体衰减反转恢复的研究时间为2分钟和56秒。

我们使用NeuroQuant®（CorTechs Labs Inc.，San Diego，CA，USA）从高分辨率解剖图像中获得了体积测量值，这是一个完全自动化的程序，已经过其他分割程序的验证，并发现轻度AD患者对体积变化的敏感性[38]和MCI[39]. 该程序为2个内侧颞叶区域（海马和下侧脑室）提供体积。NeuroQuant（自动）分析3D MRI扫描，提供准确、一致和可重复的测量和大脑皮层下结构的分割，并根据年龄、性别和颅骨体积将其与标准值进行比较。NeuroQuant计算机自动分析定期提供9个大脑区域（左侧和右侧）的体积数据，共18个体积测量值(http://www.cortechs.net/products/neuroquant.php). 在本研究中，我们只使用了海马和前脑实质的体积。海马体的体积被分析为左右海马体的总和（总体积），以及前脑实质的总体积。

使用PASW Statistics 18.0 for Windows（SPSS，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行统计分析。计算人口统计学、认知学和MRI数据的描述性统计（平均值、标准差和频率）。χ²分类变量采用Fisher精确检验，并进行Spearman非参数相关分析。ANCOVA作为协变量用于控制年龄的分析。Bonferroni检验用于事后比较。

人口统计学和临床数据见表1痴呆患者的年龄明显大于MCI和健康受试者。此外，他们表现出较低的MMSE和较高的临床痴呆评定量表盒子总和得分。

表2显示了三组之间BDNF血清水平、海马和前脑实质体积的比较。健康参与者的BDNF水平较高(第页<0.001）。痴呆组的海马总体积明显低于MCI和健康参与者(第页<0.001），而后两组没有差异。前脑实质总体积（cm）无显著差异^三)在各组间进行观察。所有分析均经过年龄调整。

为了加强结果，对整个样本进行了相关性分析，使每个变量的变异性更高，样本量更大。然而，血清BDNF与海马体积无显著相关性（Spearman rho=-0.04；第页= 0.87).

根据NIA-AA标准，本研究旨在评估健康老年参与者以及AD引起的MCI和痴呆患者的BDNF血清水平和海马体积[6,25]. 我们还旨在分析整个样本中血清BDNF与海马体积的相关性。基于以下假设，我们假设健康受试者的BDNF血清水平和海马体积在MCI和AD所致痴呆中呈下降梯度：（a）BDNF在长期记忆增强机制中发挥中心作用[9,10]; （b） 记忆障碍是AD病理的早期典型临床表现[6,7]; （c） 发作性记忆障碍与海马体积减少相关[1,2,3,40]; （d）海马体积测定被纳入一组生物标记物中，以区分MCI患者的AD和正常衰老。考虑到海马中BDNF的高表达，我们还假设了BDNF水平与海马体积的关系[8]及其与海马可塑性的关系[9,11]. 我们的主要发现是：（1）健康参与者的BDNF血清水平显著高于MCI和AD痴呆患者；（2） 痴呆患者的海马体积明显小于MCI和健康参与者；（3）BDNF血清水平与海马体积无关。因此，我们先前的假设得到了部分证实。

健康参与者的BDNF血清水平高于MCI和痴呆患者。MCI患者和AD所致痴呆患者表现出相似的水平。我们的研究结果与报告健康老年人BDNF水平较高，MCI和AD患者BDNF降低的研究组相似[12,13,14,24,41]. 然而，在这些条件下，血清BDNF的模式还没有达成共识，因为另一组研究报告更高[15,42]或类似BDNF水平[16,43,44]尽管如此，我们的发现支持了神经退行性疾病（如MCI和AD所致痴呆）中血清BDNF的减少[17]，脑脊液BDNF浓度降低预示着MCI向AD的进展，表明BDNF参与AD神经退行性改变的病理生理学。

通过分析脑容量，我们发现痴呆患者的海马比前脑减少的程度更高，但MCI和健康受试者的海马减少程度不高，这强调了AD所致痴呆轻度阶段这些区域的比例失调（根据临床痴呆评定量表框分布总和）。NIA-AA诊断标准建议将AD中的特定海马萎缩作为早期AD病理的结构生物标志物和进展预测因子[6,25,45]. 特别是MCI结果，与健康参与者相比，未发现海马体积有显著差异。这可以通过在本研究中使用NIA-AA MCI核心临床标准来解释，这是一种由临床、认知和功能标准定义的综合征。NIA-AA组报告称，与AD引起的痴呆类似，除AD病理生理过程外，其他病因可能在符合AD所致MCI标准的个体中共存[6]. 这种异质性可能影响了我们MCI患者海马体体积测量的神经元损伤的进展。尽管MCI临床标准被建议应用于临床环境，但它们与MCI研究标准不同，后者包括一组神经成像和CSF生物标志物[6]. 在这些生物标记物中，海马体积测定就是其中之一。然后，从临床病例鉴定开始，我们不能期望所有MCI患者的生物标记物均为阳性。根据生物标记物发现的存在和性质，还提出了确定程度，作为AD所致MCI的最终标准[6]. 最后，尽管作为体积测量分割程序使用的自动化程序是有效且敏感的[38、39]，需要根据手动分割黄金标准验证自动海马分割算法[46]。

公认的是，BDNF血清水平降低可能与缺乏神经营养支持有关，这是由于淀粉样蛋白-β积累增加导致受阿尔茨海默病影响的特定脑区进行性变性[19]. 综合我们的结果（MCI和AD引起的痴呆中BDNF水平较低，AD导致的痴呆中海马体积较小），我们可以假设BDNF的减少可能在海马减少所表达的神经元损伤建立之前开始。

BDNF可以双向穿过血脑屏障，血液和大脑皮层中的BDNF在动物研究中显示出正相关[47,48]. 海马是大脑皮层BDNF表达的主要区域之一，支持本研究的先验假设。然而，我们的发现驳斥了这一假设，因为没有发现BDNF血清水平与海马体积的关系。因此，血清BDNF似乎不是海马萎缩的一致标志物。

与我们的结果一致，另一项研究显示，BDNF血清水平反映了神经元完整性的某些方面，尽管BDNF血清浓度与任何海马脑代谢产物之间没有观察到显著关系[49]. 此外，我们没有分析BDNF基因变异（Val66Met替代）对海马体积的影响，这一点已经得到了研究。然而，这些研究并不是结论性的，因为一些研究表明[50]在健康和早期痴呆受试者中，这种遗传变异性或BDNF循环水平与海马体积没有关系[24]. BDNF减少对海马体积的早期影响，即神经元损伤，将是解释这一发现的另一种可能性。

目前的研究存在局限性，如样本量小、横断面设计妨碍了另一种数据方法以及对这些患者的纵向评估。然而，应该强调该研究的一些方法优势。三组中BDNF水平和海马体积的比较是年龄调整的，因为年龄本身会影响海马体积、血清BDNF和记忆能力[22]. 此外，使用神经心理学测试，如Rey听觉言语学习测试来测量情节性记忆损伤（即获取和保留新信息的能力），这些测试对巴西人群具有年龄和性别规范，为确定临床AD表型提供了更高的可靠性。

最后，这是一项探索性研究，支持BDNF血清水平降低（易于测量）在健忘症表型中的作用，以及AD所致痴呆中海马缺失检测到的既定神经元损伤。未观察到循环BDNF与海马体积的关系，但这个问题值得进一步研究，需要更大的样本、纵向设计和BDNF脑脊液测量。

这项工作得到了阿雷格里港Clínicas de Porto Alegre医院（HCPA）的激励基金会（FIPE）和巴西国家高级体育协会（CAPES）的博士奖学金的支持。

提交人声明，不存在利益冲突。