自噬维持线粒体谷氨酰胺代谢和生长布拉夫^V600E型–驱动性肺部肿瘤

自噬是一个由代谢应激激活的分解代谢过程，细胞蛋白质和细胞器被吞噬并靶向溶酶体进行降解。这一过程通过回收细胞内成分用于大分子合成来维持新陈代谢，并防止可能有毒的受损蛋白质和细胞器的积累。自噬在癌症中的作用是复杂的，目前仍不清楚(1). 基本自噬基因等位基因缺失的小鼠贝克林1是肿瘤的易发性，并且是马赛克或肝脏特异性缺失附件5或附件7产生良性肝癌，提示自噬在肿瘤抑制中的作用(2–4). 然而，自噬定位于实体肿瘤代谢应激的缺氧区域，在那里它能使肿瘤细胞存活(5–7). 的确，喀斯特^第12天-驱动性肿瘤上调了维持功能线粒体、饥饿生存和肿瘤生长所需的自噬(8, 9). 在没有自噬的情况下，有缺陷的线粒体积累，引发线粒体呼吸减少，最终与增殖不相容。这损害了压力耐受性，促使我们将这些肿瘤称为“自噬成瘾”(8–10). 最近在转基因小鼠模型中证实了自噬成瘾喀斯特^第12天-驱动型非小细胞肺癌（NSCLC），自噬缺失将腺瘤和腺癌转化为嗜酸细胞瘤，这是一种与缺陷线粒体积聚相关的良性肿瘤类型(11–14). 因此，新出现的情况是，自噬在癌症中的作用与环境有关。在某些情况下，自噬可能通过保存蛋白质和细胞器质量控制（防止氧化应激和组织损伤）来限制肿瘤的发生，而在其他情况下，自噬促进新陈代谢、应激适应和肿瘤生长。在调节自噬成为有效的癌症治疗策略之前，需要全面了解该途径在不同组织类型中的作用以及由特定致癌事件驱动的肿瘤自噬依赖性的时空变化(15–17).

因为喀斯特^第12天-驱动肿瘤对自噬抑制非常敏感，我们将注意力转向其下游效应器BRAF布拉夫在许多人类肿瘤中发现，包括黑色素瘤（65%）、肺癌（3%）、甲状腺乳头状癌（40%）、卵巢癌（4%）和结直肠癌（18%；参考文献。18–20)最常见的变化是缬氨酸在残基600处被谷氨酸取代(布拉夫^V600E型)导致激酶的组成性激活和RAS独立性。检查自噬在布拉夫^V600E型-驱动性肺癌，Cre活化小鼠布拉夫^V600E型有无必要的自噬基因的条件等位基因附件7通过鼻腔注射腺病毒Cre重组酶诱导肺部肿瘤发生，并随时间随访产生的肿瘤。此外，抑癌基因的条件等位基因Trp53基因被培育成布拉夫和附件7复合突变小鼠评估Trp53基因失去了维持小鼠肺部代谢和肿瘤发生的自噬需求。

我们在此报告，自噬是生长发育所必需的布拉夫^V600E型-并确定自噬成瘾的代谢改变。此外，我们提供了直接证据，证明自噬的抑瘤功能可以通过肿瘤发生早期活性氧（ROS）的缓解来解释。最重要的是，自噬的主要促肿瘤功能可以通过保存线粒体功能和提供代谢底物来解释，代谢底物赋予持续肿瘤发生所必需的应激耐受能力。因此，自噬可以防止代谢功能障碍，并确保布拉夫^V600E型-驱动肺部肿瘤。

为了检测自噬在肿瘤形成和进展中的作用，将Cre激活的纯合小鼠布拉夫^{加利福尼亚州}等位基因(21)与…交配附件7^弗洛克斯老鼠(22)，在这些动物中，鼻腔注射腺病毒Cre重组酶可同时使致癌基因表达布拉夫^V600E型删除floxed等位基因时发生变异附件7在小鼠肺部。这个布拉夫^V600E型模型的选择既考虑了其快速进展（2-4周内增生，6-8周内形成离散腺瘤），也考虑了与功能丧失和获得肿瘤模型配对时产生多种恶性肿瘤的能力。这个布拉夫^V600E型小鼠肺肿瘤模型产生良性腺瘤，除非与已知抑癌基因缺失的小鼠杂交墨水4A/Arf或Trp53基因此时病变进展为腺癌(21). 因此布拉夫^V600E型小鼠肺肿瘤模型能够直接验证自噬作为肺肿瘤发生调节器的假设，并有可能揭示自噬对肿瘤生长的促进和抑制作用。

在这个肺癌的基因工程小鼠模型中，所有肿瘤都是由组成活性的布拉夫^V600E型蛋白质(21).附件7通过PCR（数据未显示）以及在肿瘤发生的早期（5周和7周）和晚期（20周和30周）证实ATG7蛋白表达缺失布拉夫^V600E型-免疫组织化学衍生肿瘤；图1A和补充图S1）。附件7在肿瘤组织而非正常肺组织中检测到缺失，因为腺病毒Cre只感染一小部分肺细胞，并且只感染那些激活了BRAF的肺细胞^V600E型形成肿瘤并扩大附件7野生型或缺失的细胞。因此，在这种情况下，无法评估正常肺细胞的自噬功能。附件7腺病毒-Cre单独缺失不会导致肿瘤（补充图S2；参考。13). 所有肿瘤的表面活性蛋白c（II型肺泡上皮细胞的标记物）均为阳性，证实肿瘤在肺部发生(图1A). 肿瘤裂解物来自布拉夫^V600E型/+;附件7^−/−小鼠未能将LC3-I转化为LC3-II，并积累了自噬底物p62(图1B). 同样，在肿瘤组织中可以看到LC3点布拉夫^V600E型/+;附件7^+/+小鼠，而在来自小鼠的肿瘤组织中仅检测到弥漫性细胞质染色布拉夫^V600E型/+;附件7^−/−老鼠(图1C). 综合起来，这些数据表明附件7缺失足以阻止自噬布拉夫^V600E型-驱动肺部肿瘤。

接下来，我们进行了时间进程分析，以评估长期携带布拉夫^V600E型/+或者附件7^+/+或附件7^−/−肺部肿瘤。肺组织学检查显示肿瘤负担有显著差异。Cre后5周，附件7-不足布拉夫^{V600E版本/+}与之相比，肿瘤增加了近40%的肿瘤负担附件7^+/+肿瘤(图2A-C). 这增加了布拉夫^V600E型/+;附件7^−/−在Cre后3周和5周，在小鼠的显微计算机断层扫描（CT）分析中也观察到了小鼠（补充图S3）。因此，附件7缺陷提早出现布拉夫^V600E型-驱动肿瘤生长。

组织学上，布拉夫^V600E型/+;附件7^+/+肿瘤在5周时表现为轻度增生，7周时进展为离散腺瘤，在Cre后14周时稳定生长为乳头状腺瘤，此后不久小鼠死亡(图2D). 等位基因缺失附件7在里面布拉夫^V600E型/+;附件7^+/−Cre术后5周出现小的局灶性腺瘤，说明肿瘤适度加速生长（数据未显示）。重要的是布拉夫^V600E型/+;附件7^−/−早在Cre后5周，肿瘤就显示出深刻的腺瘤形成，但到Cre后10周，肿瘤显示出生长迟缓的迹象(图2A-C和补充图S2）。

组织学检查显示布拉夫^V600E型/+;附件7^+/+正如预期的那样，肿瘤是腺瘤，而布拉夫^{V600E版本/+};附件7^−/−肿瘤由肿瘤细胞组成，其细胞质呈嗜酸细胞瘤的特征，呈颗粒状扩大(图2D). 瘤细胞瘤是一种罕见但主要为良性的肿瘤类型，其特征是线粒体缺陷堆积(12). 的确，附件7缺陷同样改变了喀斯特^第12天-非小细胞肺癌致嗜酸细胞瘤(13).

符合附件7缺陷改变了从腺瘤到嗜酸细胞瘤的肿瘤命运，自噬缺陷肿瘤积累的线粒体明显多于它们附件7-表达IHC为Tom20测量的对应项(图2E). 电子显微镜显示布拉夫^{V600E版本/+};附件7^−/−与正常线粒体相比，肿瘤肿胀变形布拉夫^V600E型/+;附件7^+/+肿瘤。此外，线粒体在布拉夫^V600E型/+;附件7^−/−与肿瘤细胞相比，肿瘤细胞色素c氧化酶（电子传递链的重要组成部分）的酶活性显著降低，表明肿瘤功能较差附件7-表达对等项(图2E). 在来自附件7-与表达缺陷的肿瘤相比附件7表明自噬消融导致这些肿瘤线粒体的功能缺陷(图2E和F). 因此，自噬缺陷足以改变肿瘤从腺瘤到嗜酸细胞瘤的命运布拉夫^V600E型肺部肿瘤，类似于喀斯特^第12天突变。

侵袭性肿瘤，如由致癌HRAS或KRAS驱动的肿瘤，依赖自噬生存(8, 9, 13, 15). 为了与这些发现保持一致，并与附件7-我们观察到，完全阻断自噬足以延长并几乎加倍患有肿瘤的小鼠的生存期布拉夫^V600E型-驱动性肺肿瘤(P（P）= 0.017;图2G). 老鼠布拉夫^V600E型/+;附件7^+/+肿瘤是第一个死亡的，Cre术后平均存活16周。相比之下，布拉夫^V600E型/+;附件7^−/−荷瘤小鼠的中位生存期为31周。肿瘤特异性等位基因缺失附件7或重要自噬基因的全身等位基因缺失贝克林1显著削弱但不能消除自噬(23)，没有改变小鼠的存活率布拉夫^V600E型肺肿瘤(图2G和H)表明完全而非部分消融自噬对抑制肿瘤生长和提高小鼠生存率是必要的(23). 值得注意的是贝克林1^+/−荷瘤小鼠（15.1周）与荷瘤小鼠几乎相同附件7^+/−肿瘤（15.8周）。重要的是，自噬底物p62的积累在布拉夫^V600E型/+;附件7^−/−肿瘤与布拉夫^V600E型/+;贝克林1^+/−肿瘤，与由附件7不足（数据未显示）。

提高小鼠的存活率附件7^−/−与相比附件7^+/+;布拉夫^V600E型/+在Cre给药14周后，通过核Ki67染色评估肿瘤细胞增殖减少，p53、p21和γ-H2AX水平升高(图2I和补充图S4和S5）。野生型和附件7-缺乏肿瘤对衰老相关的β-半乳糖苷酶呈阳性反应（补充图S6A），消除衰老作为生长停滞的机制，减少肿瘤负担附件714周时缺乏。同样，服用Cre 14周后，未检测到活性caspase-3的显著变化（补充图S6B）。

p53和p21的诱导附件7-肿瘤缺陷导致我们质疑自噬缺陷抑制肿瘤增殖的机制是否是通过诱导p53反应。为了验证这个假设，我们删除了Trp53基因在里面布拉夫^V600E型有或无肺肿瘤附件7并跟踪结果小鼠的肿瘤发生。

删除附件7在里面Trp53基因-不足，布拉夫^V600E型肺肿瘤导致ATG7蛋白表达缺失（残留的ATG7蛋白质是由于肿瘤的基质成分没有被删除附件7)LC3-I的积累和自噬底物p62，表明自噬失活(图3A). 烧蚀Trp53基因并没有改变附件7-肿瘤缺陷，表现为3周和5周时micro-CT定量分析中正常/健康肺体积减少(图3B)或肿瘤负担的最终减轻，表现为10周时正常/健康肺容量的增加，与之相比附件7–野生型肿瘤(图3C). 在小鼠体内观察到Trp53基因-完好无损，布拉夫^V600E型-活化肿瘤(图2I)，该表型与核Ki67染色减少显示的增殖缺陷有关(图3D). Kaplan–Meier分析表明，自噬缺陷延长了荷瘤小鼠的寿命，与p53状态无关。然而，动力学是不同的；带有Trp53基因-有缺陷的肿瘤比完整的肿瘤更容易死亡Trp53基因(图3E). 因此，ATG7的缺失导致p53提前诱导布拉夫^V600E型抑制增殖和肿瘤生长的肺部肿瘤。附件7缺乏抑制生长Trp53基因-有统计学意义的缺陷肿瘤(P（P）=0.04），显示一秒钟，Trp53基因-独立的生长抑制机制应对肿瘤特异性细胞丢失附件7然而，我们注意到Trp53基因在抑制肿瘤生长和提高荷瘤小鼠的整体生存率方面起着重要作用附件7-删除的肿瘤。

与嗜酸细胞瘤的出现一致附件7删除Trp53基因^−/−;布拉夫^V600E型/+肺肿瘤，这些肿瘤的特征是有缺陷的线粒体堆积（线粒体标记Tom20的染色增强表明），线粒体超微结构异常，细胞色素c氧化酶的酶活性丧失(图3F). 事实上Trp53基因缺陷不影响布拉夫^V600E型-细胞因子缺失诱导腺癌向嗜酸细胞瘤转移附件7提示自噬在防止缺陷线粒体的积聚和维持腺癌的命运方面至关重要。重要的是，尽管附件7缺乏，肿瘤生长最终受损，表明促进肿瘤发生的自噬需求占主导地位。因此，抑制自噬可能是一种重要的治疗手段，可以改变肺部肿瘤的进展，使其趋于良性。

确立了自噬对肿瘤生长的抑制和促进作用布拉夫^V600E型-在肺部肿瘤的驱动下，我们将注意力转向了识别潜在机制。肿瘤生长早期增强的一种解释附件7是异常线粒体产生的活性氧增加所致。为了验证这一假设，我们首先检测了抗氧化防御主调节因子NRF2的水平布拉夫^V600E型/+;附件7^+/+和布拉夫^V600E型/+;附件7^−/−肿瘤。NRF2通常被泛素化，并通过与KEAP1的相互作用通过蛋白酶体降解(24). 自噬缺陷导致自噬底物p62的积累，与NRF2竞争KEAP1上的结合位点。因此，在自噬缺陷的条件下，NRF2积累并转移到细胞核，激活细胞抗氧化防御程序(25–29). 事实上，NRF2的诱导是在附件7-通过IHC检测核NRF2水平和肿瘤裂解物的Western blotting检测缺陷肿瘤(图4A和B). 核NRF2的诱导与p62的积累相关附件7-预期的缺陷肿瘤(图4A). 然而，尚不清楚这种诱导是否是由附件7由于p62积累导致的缺失，或者更确切地说是由于线粒体质量控制失败导致的活性氧生成增加，这也会诱导NRF2(26). 为了解决这个问题，我们研究了编号2中的损失布拉夫^V600E型-存在或不存在驱动性肺肿瘤发生附件7.

可激活Cre的小鼠布拉夫^V600E型有或没有条件等位基因附件7与…交配编号2敲除小鼠，通过鼻内给予腺病毒Cre重组酶在肺中诱导肿瘤发生，并随着时间的推移跟踪所产生的肿瘤。令人惊讶的是，编号2消融导致了独立于自噬状态的早期肿瘤生长的显著但可比较的增加，这表明早期肿瘤的生长是由抗氧化防御能力的丧失所驱动的(图4C). 两者的复合缺陷编号2和附件7与单独缺失任一基因相比，早期肿瘤生长没有额外增加(图4C). 刺激诱发的早期肿瘤发生编号2缺乏与激活DNA损伤反应（γ-H2AX阳性）有关，与活性氧生成增加和氧化应激一致(图4D). 两者的复合损失编号2和附件7与两者单独缺失相比，磷酸化γ-H2AX的水平没有显著增加，表明它们在同一途径中发挥作用(图4D). 这些发现与肿瘤切片中ROS特异性DNA加合物8-oxo-2′-脱氧鸟苷（8-oxo-dG）的阳性率增加一致附件7和编号2但不在附件7–和编号2–Cre给药17周后的野生型肿瘤(图4D和E).

尽管显著促进了早期肿瘤的发生编号2以与观察到的相似的方式延长小鼠的存活时间附件7先前缺失：中位生存率编号2完整小鼠为17.4周，而对照组为21.6周编号2-删除的鼠标(P（P）= 0.003; 图。2G（2G）和4楼). 关键的是，当两种情况都发生时，存活率没有进一步增加附件7和编号2已删除(P（P）=0.61），表示编号2消融现象附件7这两个基因彼此具有上位性。进一步强化这一论点的是编号2^+/+;布拉夫^V600E型/+;附件7^−/−（26.4周）和编号2^−/−;布拉夫^V600E型/+;附件7^+/+（21.6周）小鼠(P（P）= 0.55). 因此，任何一方的损失编号2或附件7或如之前报道的那样，这两个基因的缺失会降低肿瘤生长并增加生存率编号2在中删除布拉夫^V600E型-诱发性肺肿瘤(30). 综上所述，这表明尽管氧化应激通过抗氧化防御能力丧失或自噬缺陷或两者兼而有之刺激肿瘤早期生长，但这种早期促进肿瘤细胞增殖的作用并没有持续下去，最终导致肿瘤生长缺陷。

我们假设自噬缺陷肿瘤最终无法生长，因为它们进化为代谢受损的嗜酸细胞瘤。为了验证这个假设，我们生成了附件7–野生型和缺陷型Trp53基因^−/−;布拉夫^V600E型/+肿瘤衍生细胞系（TDCL），并引导我们致力于识别在自噬缺陷环境中观察到的导致肿瘤发生迟缓的代谢缺陷。Western blot分析证实ATG7在附件7^−/−TDCL，但不包括从附件7^+/+肿瘤(图5A). 在汉克斯的平衡盐溶液（HBSS）中饥饿时，自噬会阻止附件7^−/−TDCL表现为LC3-I的持续积累，未被处理为LC3-II(图5B)，确认附件7^−/−TDCLs自噬缺陷(图5B).

以下方面的不足附件7与裸鼠相比，裸鼠的饥饿存活率和肿瘤生长显著受损附件7–野生型副本(图5C和D)，重述了转基因小鼠的发现(图2G). 与观察到的线粒体缺陷一致附件7在基因工程小鼠的肿瘤中，自噬缺陷的TDCL比野生型小鼠拥有更多的线粒体，但功能性线粒体的比例较小(图5E). 接下来，我们用HBSS（4小时）作为其代谢适应度的第一近似值，检测了在正常生长培养基（RPMI）中或短期饥饿后维持的自噬能力强和缺乏的TDCL的耗氧率（OCR）。自噬缺陷TDCL的基础和饥饿诱导OCR水平显著低于自噬活性TDCL测量的比率(图5F). 重要的是，自噬缺陷的TDCL在饥饿后几乎没有线粒体储备能力（注射解偶联剂三氟丙氰苯腙后的OCR），这进一步支持了自噬提供代谢物的假说，而代谢物维持线粒体功能(图5F).

接下来，我们确定了自噬提供的代谢成分，这些代谢成分能够在饥饿期间存活。添加外源性谷氨酰胺或少量丙酮酸钠，但不添加葡萄糖或活性氧清除剂N个-乙酰半胱氨酸（NAC）足以挽救附件7-克隆形成试验中缺乏TDCL对饥饿（HBSS）的反应(图5G和补充图S7）。这表明自噬缺陷使TDCLs谷氨酰胺依赖。NAC无法保护附件7-饥饿诱导的死亡导致的TDCL缺陷表明，生存能力的丧失不是由过量的ROS产生引起的，而是由代谢不足引起的（补充图S7）。OCR分析显示，自噬缺陷的TDCL能够利用谷氨酰胺来改变三羧酸（TCA）循环，导致与谷氨酰胺抵抗的情况相比，OCR增加，尽管它们在这方面的效率不如自噬活性的TDCLs(图5H). 综上所述，这些数据表明附件7-肿瘤生长不足是由于线粒体整体功能受损和剩余功能线粒体的底物限制（尤其是谷氨酰胺），共同导致与肿瘤持续生长不相容的代谢危机。

自噬在癌症中的作用是复杂的；它可以根据细胞环境抑制或促进肿瘤发生(1, 15). 自噬的这些差异效应是否是由于所检测模型的人为因素造成的，或是发生在人类癌症中的，尚待确定。可能影响自噬在癌症中作用的因素包括组织类型、驱动基因突变的性质、生长和增殖引起的代谢需求、固有代谢应激水平以及参与的特定代谢途径。很明显，生理、遗传和体内需要采取措施来解决这些问题。

为了解决自噬在癌症中的上下文依赖性作用，我们消融了附件7在Cre激活小鼠模型中布拉夫^V600E型-驱动性肺肿瘤发生通常导致良性肿瘤(21). 我们发现通过丢失附件7同时，线粒体质量控制的丧失增加了氧化应激，促进了早期肿瘤的发生，揭示了自噬限制肿瘤生长的潜在机制。然而，持续的线粒体功能障碍最终掩盖了这种最初的肿瘤生长优势，导致代谢障碍、肿瘤负担减轻、嗜酸细胞瘤的出现以及小鼠总体存活率的增加。

这些研究提出了几个重要观点。第一，附件7以下方面的不足布拉夫^V600E型-驱动性肺肿瘤发生促进肿瘤早期生长。这种对肿瘤细胞增殖的最初刺激与氧化应激的增加有关，表明这可能是ROS介导的事件。同样，失去抗氧化防御主调节器，编号2，最初促进了布拉夫^V600E型-驱动性肺部肿瘤，以及两者的丧失附件7和编号2没有提供额外的增长优势。这表明，自噬或抗氧化防御能力丧失导致的氧化应激可能会在早期刺激布拉夫^V600E型肺肿瘤的生长和附件7和编号2是遗传上位性的。

众所周知，活性氧会导致基因组损伤和突变，从而引发癌症，而自噬缺陷会增加活性氧水平、突变率和基因组不稳定性(6, 7). 然而，ROS生产的这些后果不太可能在这里发挥作用，因为附件7或编号2损失是暂时的。ROS激活致癌信号通路，包括HIF、Wnt/β-catenin、Notch和细胞外信号调节激酶（ERK布拉夫^V600E型肺肿瘤缺乏附件7或编号2.肿瘤负担的最终减轻是否与附件7或编号2损失对应于线粒体功能的逐渐恶化和活性氧生成的损失。我们认为，自噬缺陷会导致功能失常的线粒体堆积，从而引起氧化应激（就像失去线粒体一样）编号2-介导的抗氧化防御），最初刺激布拉夫^V600E型-通过激活促生长信号通路驱动肺部肿瘤。在这种情况下激活的潜在信号事件仍有待确定，尽管在附件7–野生型和缺陷型布拉夫^V600E型肺肿瘤（数据未显示）。另外，自噬提供的底物水平不足，如蛋白质降解产生的谷氨酰胺，可能会损害线粒体代谢、活性氧生成和代谢适应性(图6).

其次，自噬是维持布拉夫^V600E型-并决定了它们的命运。具体来说，自噬消融改变了腺瘤的肿瘤进展(Trp53基因-完整肿瘤）和腺癌(Trp53基因-无效肿瘤）转化为嗜酸细胞瘤。这些数据表明，通过抑制自噬改变肿瘤向良性嗜酸细胞瘤的转移可能是一种新的治疗方法BRAF公司^V600E型-有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导驱动的其他肿瘤。重要的是，任何一种重要自噬基因的缺陷附件7或附件5在RAS转化的癌细胞系中，损伤肿瘤生长并导致缺陷线粒体的积累(8, 9)，如图所示布拉夫^V600E型-诱发肿瘤。因此，嗜酸细胞瘤表型和肿瘤生长缺陷是自噬缺陷的结果，与肿瘤细胞的自噬非依赖性功能无关附件7.尽管附件7缺乏也会改变喀斯特^第12天-腺瘤和癌致瘤细胞瘤(13)，英寸布拉夫^V600E型肺肿瘤发生得更快，生存率更高，提示MAPK信号可能是自噬依赖性的关键驱动因素。测试自噬在其他疾病中的作用将非常有趣布拉夫^V600E型-导致恶性肿瘤。确定急性自噬消融是否足以将既定肿瘤转化为嗜酸细胞瘤也非常重要。

自噬消融产生的嗜酸细胞肿瘤与增殖减少相关，表明细胞周期抑制是肿瘤负担减少的主要原因。由以下因素引起的p53诱导增强附件7缺陷有助于但不是增殖性停搏反应所必需的附件7缺乏，揭示了p53依赖性和非依赖性机制，自噬通过这些机制促进肿瘤细胞增殖喀斯特^第12天-驱动性肺肿瘤(13). 自噬缺陷（消融或等位基因丢失）激活DNA损伤反应(6, 23). 最近，等位基因丢失贝克林1被证明可以激活p53介导的阻滞物来促进乳腺肿瘤的发生(31). 肿瘤明显激活自噬来抑制p53反应，这是肿瘤促进机制的一部分。这些发现与自噬在维持线粒体代谢中的核心重要性相一致RAS系统-驱动性肿瘤(8–10, 13)并将该现象的普遍性扩展到包括布拉夫^V600E型-驱动性肺部肿瘤，以及可能由其他致癌事件驱动的肿瘤(32).

第三，我们确定了一种潜在的机制来解释附件7-有缺陷的布拉夫^V600E型-驱动肺部肿瘤。自噬最初在酵母中被确定为氮饥饿生存所需的途径(33). 哺乳动物也需要自噬才能在饥饿中生存(34)就像许多癌细胞一样(1). 自噬降解细胞内成分，使其在缺乏时在代谢和生物合成途径中再循环(16). 事实上，自噬缺陷布拉夫^V600E型TDCL在肿瘤发生过程中受损，无法在饥饿中存活，但通过补充谷氨酰胺，TDCL得到了极大的挽救。因此，附件7缺乏导致对外源性谷氨酰胺的依赖，可能是由于缺乏从自噬介导的蛋白质降解中回收的内源性谷氨酰胺。因此，自噬成瘾可能只是为肿瘤细胞提供谷氨酰胺的一种手段。重要的是要确定附件7-缺乏的肿瘤细胞由于底物限制或线粒体功能障碍或两者兼而有之而代谢衰竭。此外，重要的是要确定附件7-TDCL不足在体外是肿瘤生长缺陷的直接原因体内.

删除附件7在里面Trp53基因-不足和喀斯特^第12天-激活的肺肿瘤导致显著的炎症，导致肺炎，并积累了缺陷线粒体和中性脂质，继而导致脂肪酸氧化受损(13). 我们没有观察到炎症或脂肪堆积附件7在中Trp53基因-不足，布拉夫^V600E型-激活的肺肿瘤或TDCL在体外; 我们也没有看到移植瘤中出现脂质囊肿（补充图S8和未显示的数据），这表明在代谢和线粒体利用方面存在根本差异喀斯特^第12天和布拉夫^V600E型肺部肿瘤。事实上，在黑色素瘤中，BRAF公司^V600E型激活丙酮酸脱氢酶，促进TCA循环中丙酮酸的利用，从而驱动肿瘤诱导的衰老(35). BRAF在黑色素瘤模型中也得到了很好的证实^V600E型通过调节转录因子抑制线粒体生物发生MITF公司和过氧化物酶体增殖物激活受体γ，辅活化因子1α（PGC1α；参考文献。36). 线粒体质量控制对布拉夫^V600E型恶性肿瘤是指由于丙酮酸利用增加，功能线粒体的数量已经减少，呼吸增强。总之，这项工作为自噬在何处以及如何调节提供了有价值的见解BRAF公司^V600E型-并为自噬抑制在癌症治疗中的临床应用提供了进一步的支持。

所有实验均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南进行。布拉夫^CA/CA公司老鼠被培育成附件7^弗洛克斯（由东京都医学院小松博士提供）或贝克林1^+/−（由西奈山Z.Yue博士提供）生成布拉夫^{加利福尼亚州/+};附件7^+/+,布拉夫^卡/+;附件7^−/−、和布拉夫^{加利福尼亚州/+};贝克林1^+/+或布拉夫^{加利福尼亚州/+};贝克林1^+/−老鼠。化合物布拉夫；附件7老鼠被培育成Trp53基因^{液氧/液氧}（杰克逊实验室）或编号2^−/−（Y.W.Kan，加利福尼亚大学旧金山分校），产生了三突变小鼠。对于腺病毒Cre感染，6至8周龄的小鼠用异氟醚和高滴度复制缺陷型腺病毒-Cre（4×10⁷pfu/小鼠；衣阿华大学基因载体核心）作为钙沉淀经鼻给药。在老鼠回到它们的住所之前，对它们进行监测，直到它们完全从麻醉剂中恢复过来。对于TDCLs的同种异体研究，10⁷将细胞双侧注射到6周龄裸鼠（Taconic）的侧面。每2天测量一次肿瘤大小。在注射后14天处死小鼠。肿瘤组织学固定如下所述。

使用Siemens Inveon PET/CT和Inveon Acquisition Workplace软件获得最大通气量小鼠的呼吸门控低分辨率CT图像。使用INVEON Research Workplace软件，通过高斯滤波器处理重建数据，并对确定为肺部的组织进行分割并计算其体积。使用Osirix软件生成正常肺组织和横截面的三维（3D）重建。

以下抗体用于Western blotting或免疫组织化学分析：ATG7（Sigma；Cat#:A2856）、表面活性剂C蛋白（Seven Hills Biochents；Cat#:WARAB-SPC）、LC3（Nano Tools；Cat#：LC3-5F10）、p62（针对MBP全长p62的抗血清(8)或购自Enzo Life Sciences PW9860-0100）、Ki67（Abcam；Cat#：ab-15580）、p53（Leica；产品代码：NCL-p53-CM5P）、p21（BD Biosciences；Cat#:56431）、活性caspase-3（Cell Signaling Technology；Cat#:9661）、γ-H2AX（Cell信号技术；Cat#:2577）、TOM20（Santa Cruz Biotechnology；Cat#sc-11415）、Cox-IV（Molecular Probes）、，8-oxo-dG（clone 2E2；Trevigen）、phospho-Erk（Cell Signaling Technology；Cat#4376）、NRF2（Epitomics；Cat#2178）和β-actin（Calbiochem；Cat#CP01）。

对于石蜡切片，肺被分割成单个肺叶，在PBS中清洗两次，然后在室温下在10%的福尔马林缓冲溶液（福尔马林；Fisher Scientific）中固定4小时，然后转移到70%的EtOH中进行切片。对于冷冻切片，将肺组织固定在10%福尔马林中，然后转移到15%蔗糖中2小时，最后转移到30%蔗糖中进行处理。

改良Nadi反应如下：将未固定的冰冻切片在培养液（7.5 mL水中75 mg蔗糖，pH 7.6的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液，5 mg 3′-二氨基联苯胺四氯化物，10 mg细胞色素c，20μg过氧化氢酶）中在室温下染色1小时。过氧化氢酶（C-10）、细胞色素C（C-2506）和3,3′-二氨基联苯胺（DAB；D-5637）购自Sigma。在安装和成像之前，将载玻片在去离子水中清洗三次，在升华醇中脱水（50%、70%、80%、95%两次，然后100%两次）。

β-半乳糖苷酶染色按照制造商的建议进行（细胞信号技术；Cat#9860）。简言之，将切片在1×固定剂中固定10分钟，并用PBS洗涤两次，然后在37°C、不存在CO的情况下用β-半乳糖苷酶染色缓冲液孵育过夜₂用曙红对样品进行短暂的复染，以便于组织的可视化。

TDCL生成于第53页^−/−;布拉夫^V600E型/+有或无肿瘤第7天Cre后9周。TDCLs在含有10%FBS、1%青霉素/链霉素、1 mmol/L丙酮酸钠和1 mmol/L碳酸氢钠的RPMI-1640培养基中培养，培养温度为38.5°C，CO含量为8.5%₂.附件7PCR和Western blot分析证实了这些品系的状态。TDCLs在使用前饥饿后进一步表征LC3和p62的积累。未执行其他身份验证。

总计0.6×10⁶细胞被镀在6孔板的盖玻片上，在HBSS中饥饿24小时。饥饿后，用PBS冲洗细胞两次，然后用Bodypy（1 mg/mL）培养15分钟，并用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）进行复染。将载玻片在水中冲洗，用Prolong Antifade Gold固定，然后成像。

肿瘤块被snap冷冻，然后用研钵和杵在液氮中研磨。材料在放射免疫沉淀分析缓冲液中进行裂解，用Bio-Rad BCA试剂评估蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE进行分析。对于TDCL，如前所述制备全细胞裂解物(5).

将活的TDCL与25 nmol/L MitoTracker-Red CMXRos（分子探针/Invitrogen）混合，以评估线粒体膜电位（MMP），并在正常生长条件下测量线粒体质量，持续30分钟。标记后，将样品在生长培养基中洗涤两次，进行胰蛋白酶化，并通过流式细胞仪（BD Influx Cell Sorter；BD Biosciences）进行分析。显示了平均线粒体质量荧光。通过将平均MMP荧光（红色）除以线粒体质量荧光（绿色）的平均值来计算相对MMP。

如前所述，使用Seahorse Biosciences细胞外通量分析仪（XF24）测量OCR率(8). 总计5×10⁴每孔细胞接种在正常生长介质（含10%FBS的RPMI）中，并在38.5°C和8.5%CO条件下附着24至30小时₂在学习之前。在与RPMI或HBSS孵育4小时后收集基础测量值。通过从XF24端口注射线粒体解偶联剂FCCP（1.5μmol/L）和复合III抑制剂抗霉素（20μmol/L），测量SRC（最大呼吸容量-基础呼吸速率）和总储备容量。在谷氨酰胺利用实验中，将细胞如上所述进行电镀，与HBSS孵育30分钟，然后转移到海马进行分析，其中我-通过XF24端口注入谷氨酰胺（2 mmol/L）。如图所示，在添加谷氨酰胺之前/之后收集测量值。

将肿瘤固定在2.5%戊二醛/4%多聚甲醛/8 mmol/L氯化钙溶液中，缓冲液pH为7.4，缓冲液浓度为0.1 mol/L。样品在交付前在4°C下储存过夜，以进行进一步处理。它们在缓冲的1%四氧化锇中后固定，随后在一系列分级的丙酮中脱水，然后包埋在环氧树脂中。薄切片（90nm）在徕卡电子显微镜UC6超薄切片机上切割。用乙酸铀酰和柠檬酸铅饱和溶液对剖切的网格进行染色。如前所述，使用AMT XR41数码相机在JEOL 1200EX透射电子显微镜上以80 kV电压拍摄图像(5).

总计0.07×10⁶将TDCL接种在正常生长培养基中的12孔板中，并允许其连夜附着。在用正常生长培养基、HBSS或添加1 mmol/L丙酮酸钠、2 mmol/L.的HBSS培养之前，用PBS冲洗细胞两次我-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖或4 mmol/L NAC，按指示持续3天。饥饿后，细胞在正常生长介质中恢复4天，然后甲醇固定和Giemsa染色。对于补充图S7，在固定和染色之前，细胞饥饿3天，并在正常培养基中恢复3天。

使用GraphPad Prism 5.0版进行统计分析。采用双向方差分析和Bonferroni后验计算统计显著性。卡普兰-迈耶分析中的显著性使用对数秩和检验进行计算。为了量化免疫组织化学切片的肿瘤负担，用Trestle MedScan全玻片扫描仪对标本进行数字化。在MATLAB 2011b上建立了自动图像处理协议。对每个标本的整个幻灯片进行分析，得出肿瘤面积和总组织面积的测量值。每张幻灯片都制作了肿瘤和全组织面具。分割模板用于生成肿瘤负担比率。对于IHC的定量，每个基因型的多个图像中至少有200个细胞被打分。

M.McMahon获得了诺华、普莱克斯康和辉瑞的商业研究支持。其他作者没有透露任何潜在的利益冲突。

概念和设计：A.M.Strohecker、J.Y.Guo、E.White

方法开发：A.M.Strohecker、J.Y.Guo、M.McMahon

数据采集（提供的动物、采集和管理的患者、提供的设施等）：A.M.Strohecker、R.Mathew、M.McMahon

数据分析和解释（例如统计分析、生物统计学、计算分析）：A.M.Strohecker、G.Karsli Uzunbas、R.Mathew

撰写、审查和/或修订手稿：A.M.Strohecker、J.Y.Guo、G.Karsli Uzunbas、M.McMahon、E.White

行政、技术或物质支持（即报告或组织数据、构建数据库）：S.M.价格

组织切片的IHC：G.J.陈

作者感谢小松先生提出的条件附件7老鼠，Z.Xue代表贝克林1^+/−老鼠和Y.W.Kan代表编号2击倒老鼠。作者还感谢R.Patel的电子显微镜，N.Campbell的micro-CT，W.Chen的组织学定量，A.Roberts的荧光激活细胞分选（FACS）分析，新泽西癌症研究所（CINJ）组织分析服务人员，P.Chin的技术援助，和怀特实验室的成员进行有益的讨论。

这项工作得到了美国国立卫生研究院的资助（R37 CA53370、R01 CA130893、RO1 CA163591和RCI CA147961授予E.White；CA131261授予M.McMahon），以及新泽西州癌症研究委员会（NJCCR）授予a.M.Strohecker的博士后研究金（09-2406-CCR-E0）。