SLC1A5介导肺癌细胞生长和生存所需的谷氨酰胺转运

肺癌是美国癌症相关死亡的主要原因(1). 非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌的80%。尽管在过去十年中，诊断和治疗策略取得了进展，但非小细胞肺癌患者的预后仍然很差，5年总生存率为15%至20%(2). 已经发现，一小部分肿瘤是由突变癌基因驱动的，对这些突变癌基因有活性但仍无致敏性的治疗方法。然而，绝大多数肿瘤都有复杂的发病机制，目前尚不清楚(三). 因此，迫切需要新的分子诊断和治疗靶点来提高肺癌患者的护理质量和生存率。尽管基因组分析为癌症发生机制提供了重要的新见解，但临床应用的治疗靶点和大多数生物标记物都是蛋白质产品。近年来蛋白质组学技术的进展使我们能够深入分析与肺癌相关的蛋白质表达和翻译后修饰的变化(4, 5). 这些研究产生了大量的蛋白质，这些蛋白质可能被转化为肺癌的分子靶点或生物标记物，但这些候选蛋白很少被证实或与疾病过程的功能相关性相关。

鉴于迫切需要一种可靠且无创的肺癌诊断测试，我们之前已经比较了新鲜冷冻I期非小细胞肺癌与匹配的对照肺标本的鸟枪蛋白组学特征，并确定了几个在非小细胞癌中显著过度表达的候选基因(6). Solute连锁运营商家族1成员A5（SLC1A5）成为首选。SLC1A5是我-培养中快速生长的上皮细胞和肿瘤细胞中的谷氨酰胺（Gln）(7). 中性氨基酸，包括谷氨酰胺，可以通过4种主要的氨基酸转运系统进行转运，包括钠依赖系统A、ASC、N和钠依赖系统L(8–11). 这些转运蛋白根据组织分布和不同氨基酸的亲和力进行分类。系统ASC是人类肿瘤衍生细胞中最常见的氨基酸转运体，这表明它可能在细胞转化和调节Gln依赖性生长中起主要作用(10, 12, 13). 因为SLC1A5属于Na⁺-依赖性氨基酸转运体ASC家族，我们检测了谷氨酰胺是否在肺癌细胞中被转运⁺-依赖方式。在肺癌中，生长、存活和细胞周期进展对谷氨酰胺的依赖性已被充分证明(14–16). 最近，通过谷氨酰胺酶将谷氨酰胺转化为三羧酸循环中间产物α-酮戊二酸对Kras诱导A549细胞中的凤尾鱼非依赖性生长至关重要(17). 其他研究表明，谷氨酰胺的还原羧基化是代谢重编程的关键，而代谢重编程可以使癌细胞在缺氧条件下存活并在包括肺癌在内的几种癌细胞模型中增殖(18–20). 总之，这些研究为Gln代谢在支持肺癌细胞生长和存活中的主要作用提供了有力的证据。然而，在肺癌细胞中捕获Gln的转运体的身份以及Gln转运如何与细胞生长和存活联系尚不清楚。因此，本研究的三个主要目标是：第一，评估SLC1A5蛋白在不同肺癌病理亚型中的表达模式，第二，评估其与肺癌临床结局的相关性，最后，研究SLC1A5对谷氨酰胺摄取的功能贡献及其在支持肺癌细胞生长和生存中的作用。

用石蜡包埋福尔马林固定（FFPE）块制备了98例肺癌肿瘤组织的组织芯片（TMA）。TMA由46例腺癌、37例鳞癌、4例支气管肺泡癌、4个大细胞癌、2例非小细胞肺癌、5例类癌组成，腺鳞癌、肉瘤和小细胞肺癌各1例。这些阵列是根据前面描述的协议构造的(21). 1989年至2002年间，从范德比尔特大学医学中心和纳什维尔退伍军人管理局医学中心病理科（田纳西州纳什维尔）的档案中检索到连续解剖切除的存档组织块。这两个TMA中98名患者的人口统计学和临床特征总结如下表1，有关免疫组织化学（IHC）分析的详细信息，请参阅补充材料。

人类肺癌细胞系A549（ADC）、H1819（ADC₂细胞每2至3天传代一次，以保持指数增长。

通过Gazzola及其同事最初描述的集群射线方法测量单层培养的非小细胞肺癌细胞的谷氨酰胺摄取(22). 简单地说，细胞在10岁时被电镀⁵在24孔培养板（Costar）中每孔培养细胞，并使其粘附过夜。在转运分析之前，用温钠冲洗细胞两次⁺-游离Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液（cholKFtP），其中氯化胆碱和磷酸胆碱等渗替代相应的钠⁺盐，去除细胞外钠⁺和氨基酸。使用的放射性示踪剂是我-[3.4加仑-^三H] 比活性为500000 dpm/μmol（5μCi/mL）的谷氨酰胺（Amersham）。对于动力学研究，转运缓冲液中未标记谷氨酰胺的量在400μmol/L到6.4 mmol/L之间变化。转运值是在没有细胞外Na+（扩散和钠依赖性摄取）的情况下使用cholKRP获得的，或者在有Na+（总摄取）的情况下使用NaKRP缓冲液测定钠依赖性速率，以微微摩尔/毫克蛋白质/min为单位进行报告。所有运输测量均在37°C下进行，并在3分钟后通过添加冰镇PBS盐水（PBS）终止，然后使用冰镇PBS进行3次快速洗涤。细胞内谷氨酰胺用0.2 mL每孔0.2%SDS在0.2 N NaOH中提取；在室温下1小时后，用2N HCl中和0.1mL裂解物并进行液体闪烁分光光度法。剩余的裂解液用于通过Pierce BCA蛋白分析测定细胞蛋白。谷氨酰胺转运速率根据每个样品每分钟计数（cpm）和摄取混合物的比活性（cpm/nmol）计算。然后使用Microsoft Excel将这些结果归一化为细胞蛋白质含量。用于γ的药物靶向-我-在NaKRP缓冲液中存在0、100和300μmol/L GPNA的情况下，进行谷氨酰胺-对硝基苯胺（GPNA）、谷氨酰胺摄取试验。根据放射性计数和蛋白质浓度计算转运速度，然后表示为每分钟每毫克蛋白质转运的谷氨酰胺pmol。每个数据点代表至少3次单独测定的平均±SEM。

为了测试细胞对谷氨酰胺的生长依赖性，将细胞以2×10的密度放置在12孔组织培养板中⁴每个孔的细胞数。第二天，用无血清Gln培养基冲洗细胞一次，并用RPMI-1640（Gibco by Life Technologies）替换，其变化如下：补充EGF（25 ng/mL）和1×生长因子混合物（Invitrogen），其中包括胰岛素、硒和转铁蛋白（Sup）、Sup+2 mmol/L Gln（+Gln+Sup），RPMI-1640+Gln，但没有补充物（+Gln−Sup），没有Gln，但有补充物（−Gln+Sup）或既没有补充物也没有补充物。每48小时更换一次培养基，让培养物生长3天。为了测试SLC1A5活性是否介导Gln耗竭效应，将A549和H520培养在含有（+Gln+Sup）+1 mmol/L GPNA的培养基中，静置培养2天。为了进一步验证GPNA阻断SLC1A5的抗生长作用，将A549和H1819细胞培养在最佳生长介质（+Gln+Sup）中，并增加GPNA的剂量（0、1、10、100、1000μmol/L），培养2天。通过测量OD监测细胞生长₄₉₀在第0天和培养48小时后通过Cell-Titer 96-水比色分析（Promega）。相对生长率表示为从第0天开始的生长百分比，并使用以下方程式进行计算；（Ti-Tz）/（C-Tz）×100，其中Ti是48小时后的细胞数（i=抑制），Tz是时间0时的细胞数，C是在最佳生长条件下培养的对照细胞的细胞数。23).

合成了四种靶向人类SLC1A5的21核苷酸siRNA的混合物（Thermo Scientific），并作为单一试剂提供。siRNA库中靶向人SLC1A5的4个siRNA序列为：；

1. UGAUAGAGUGAGAGUGA、，

2. GCAAGGAGUGCUCGAUUC公司，

3. GGUCGACCUAUCCUUG，

4. GCCUUCGCUCAUACUCUA。

从同一家公司购买了一种非靶向对照siRNA，该siRNA是一种杂乱核苷酸序列，用作非特异性结合的阴性对照（siRNACont）。AllStars Hs Cell Death Control siRNA被用作阳性对照，以验证转染效率和作为细胞活力的阳性对照（Qiagen）。使用DharmaFECT1试剂（0.2μL/孔）以1.0和2.5 nmol/L siRNA转染A549和H520细胞72小时，然后按照补充材料中的描述评估细胞生长、活力和细胞周期进展。

使用Kruskal–Wallis或Wilcoxon秩和检验分析SLC1A5表达与临床变量之间的相关性。动力学数据与Michaelis–Menten动力学拟合，数据点等于平均值±SEMn个减去非特异性结合的实验。使用GraphPad Prism（GraphPad-Software）对谷氨酰胺摄取动力学和细胞生长分析进行统计分析。双尾学生对两种实验条件的比较数据进行了统计分析t吨测试并且仅结果与P（P）<0.05被认为具有统计学意义。所有实验数据均以平均值±SEM表示n个独立测量（如各图图例所示）。每个实验中的所有处理均在三个孔中进行，并在3个独立的日子重复进行。为了评估GPNA的剂量反应治疗程度，使用普通回归分析来评估log和log之间的线性趋势（生长抑制的百分比）。

我们的鸟枪蛋白质组分析表明，SLC1A5蛋白在两个I期腺癌（ADC；N个=20）和鳞癌（SCC；N个=20）与对照肺样本相比(N个=20）来自新鲜冷冻组织和福尔马林固定石蜡包埋FFPE组织(N个=每种组织类型的5个；补充图S1A和S1B）。我们在从3个正常肺组织和3个非小细胞肺癌肿瘤收集的一组单独的组织裂解物中证实了这些结果（补充图S1C）。为了评估肺癌中SLC1A5蛋白的表达模式，我们使用经验证的人抗SLC1A5-IgG对从不同组织学亚型肺癌患者收集的2个原发性肺癌存档组织进行了免疫组织化学（IHC）分析(网址：http://www.proteinalas.org/). 38例鳞状细胞癌中的35例（95%）和46例ADC亚型中的34例（74%）可见SLC1A5信号。其他非小细胞肺癌，包括大细胞癌（LCC）、腺鳞癌和非小细胞癌，未另行说明，均为阳性（9/9；100%）。神经内分泌肿瘤，包括非典型和典型类癌和小细胞肺癌，在我们的TMA中也有表现，但只有50%（3/6）的SLC1A5染色阳性(表1). 腺癌和鳞状细胞癌中SLC1A5的染色模式均沿细胞质膜，细胞质染色较少。在正常细胞成分中，我们发现纤毛呼吸上皮细胞的0~1+细胞质膜染色，基底支气管/支气管细胞的2~3+细胞质薄膜染色，支气管粘膜下腺细胞的2+细胞质隔膜染色，反应性2型肺细胞的1+2+细胞质膜染色（1型肺细胞无染色），肺泡巨噬细胞的2+细胞质染色，浆细胞的1~2+细胞质和细胞质膜着色。基质成纤维细胞、平滑肌、软骨、内皮细胞或淋巴细胞没有染色(图1A). SCC中SLC1A5表达的发生率明显高于ADC(P（P）< 0.001;图1B). SLC1A5和临床变量之间的最显著相关性与性别有关，男性高于女性(P（P）< 0.001;图1C)组织学亚型，SCC高于ADC(P（P）< 0.001;图1C和表1). SLC1A5表达与总生存率、吸烟史或年龄无显著相关性。

肺癌细胞株的免疫组织化学结果显示，除一株腺癌细胞株（H2009；补充表S1，免疫组织化学中未显示）和一株小细胞肺癌细胞株（H345）外，其余所有细胞株SLC1A5均呈阳性染色（补充表S1和补充图S2A）。与肺原发性肿瘤类似，我们发现SLC1A5的亚细胞位置在所有肺癌细胞系中主要是膜性的（补充图S2A）。使用兔多克隆抗SLC1A5抗体的蛋白质印迹分析(24, 25)证实该蛋白在恶性肺癌细胞系A549（ADC）、HCC15（SCC）、H520（SCC，和H460（LCC；补充图S2B和S2C）中的表达较高。使用3种不同的抗体验证了该抗体的特异性以及A549和H1819细胞系中SLC1A5表达的确认（补充图S3A）。一株ADC细胞株（H1819）SLC1A5呈阴性。类癌细胞系H727的蛋白质水平较低。肺癌细胞系的Western blot结果与鸟枪蛋白组学（补充图S1A-S1C）和肿瘤TMA免疫组织化学中SLC1A5的表达模式一致(图1A). 这些结果表明，SLC1A5在大多数肺癌中具有较强的细胞膜免疫染色，在鳞癌和男性中更为明显。

我们测试了Na⁺A549细胞对Gln摄取的依赖性我-【G】-^三H] Krebs–Ringer溶液(图2A和B; 裁判。26). 我们的结果如所示图2A补充表S2显示，68%的细胞Gln摄取发生在Na中⁺-依赖方式。为了测试SLC1A5在肺癌细胞摄取Gln中的作用，我们在缺乏或存在谷氨酰胺类似物（GPNA）的情况下对A549细胞进行了Gln摄取测定，GPNA是一种与SLC1A51特异结合的竞争性Gln摄取抑制剂(27, 28). A549细胞的Gln摄取动力学显示，Gln摄取受15%的剂量依赖性抑制(P（P）<0.05）和32%(P（P）<0.005），分别在100和300μmol/L GPNA下培养3分钟(图2B). 在相同条件下，当GPNA浓度增加到900μmol/L时，未观察到对谷氨酰胺摄取的进一步抑制（数据未显示）。这些结果表明，A549细胞摄取的大部分Gln发生在Na⁺-依赖性方式，约50%由SLC1A5介导。为了测试药物阻断SLC1A5介导的Gln摄取对肺癌细胞生长的影响，我们在GPNA浓度增加的情况下培养A549细胞48小时。观察到剂量反应生长抑制(图2C)与不含Gln和相同时间补充Gln的细胞生长相比。这些结果首次证明肺癌细胞中靶向SLC1A5活性可以直接影响细胞生长。

SLC1A5表达在调节谷氨酰胺代谢依赖性肺癌细胞生长中的作用尚未被研究。因此，我们培养了5种不同SLC1A5蛋白表达水平的肺癌细胞株(图3A和补充图S3），并在Gln和生长因子浓度不同的培养基中培养72小时，如方法部分所述。在缺乏谷氨酰胺的条件下，SLC1A5高表达细胞系（A549、HCC15和H520）的细胞生长显著下降，但SLC1A5（H1819；图3B). 有趣的是，与A549、H520和HCC15相比，即使在最佳生长条件下（+Gln+Sup），H1819（SLC1A5 null）的生长速度也要慢得多，所有这些都过度表达SLC1A5。增加谷氨酰胺拮抗剂6-重氮氧基-L-去甲亮氨酸（DON）剂量对A549细胞（过度表达SLC1A5）的药物治疗(29)连续4天，这些细胞的生长受到显著抑制，而H1819（SLC1A5无效）未受影响(图3E). 这些结果表明，SLC1A5的表达至少部分调节了肺癌细胞对谷氨酰胺的生长依赖性。为了研究SLC1A5在肺癌细胞对谷氨酰胺依赖性中的具体作用，我们用1 mmol/L GPNA处理A549和H520细胞（过度表达SLC1A5）48小时。我们的结果如所示图3C和D在A549和H520细胞系中，细胞生长显著下降，而生存能力受到的影响较小。

我们从I期肺癌新鲜冷冻组织中获得的鸟枪蛋白质组数据显示，谷胱甘肽合成途径中的两种关键酶丙氨酸氨基肽酶（ANPEP）和谷胱甘苷合成酶（GSS）的表达增加（数据未显示）。因为谷氨酰胺在谷胱甘肽（GSH；参考文献。30)因为谷胱甘肽是细胞内活性氧过剩的清除剂（ROS；参考文献。31, 32)，我们测试了抑制SLC1A5介导的A549细胞Gln摄取是否会增加细胞内ROS水平。当用增加剂量的GPNA处理24小时后，A549细胞显示出细胞内ROS水平的上升，这是通过H氧化形式的相对荧光信号来测量的₂DCFDA公司(图2D). 为了测试抗生长效应和细胞内ROS释放的增加是否由SLC1A5-Gln活性介导，我们测量了与H1819相比表达高水平SLC1A5的A549细胞的Gln摄取、细胞生长和细胞内活性氧释放（补充图S2B）。H1819的Gln摄取显著降低（40%；P（P）<0.005），与A549细胞在300μmol/L SLC1A5抑制剂GPNA作用下的相同摄取水平相当(P（P）< 0.05). 与A549细胞相比，GPNA对H1819细胞的Gln摄取没有影响，而A549细胞在300μmol/L时被抑制了33%。随着GPNA剂量的增加，SLC1A5的药理学阻断48小时，导致A549细胞内ROS释放量呈剂量依赖性增加，而H1819则没有（补充图S3C）。类似地，当细胞在含有浓度增加的SLC1A5抑制剂GPNA的培养基中培养时，在A549（过表达SLC1A5）中观察到细胞生长的剂量依赖性降低，但在H1819（SLC1A5无效）中没有观察到（补充图S3D）。总之，这些结果表明，肺癌细胞中的SLC1A5转运活性在一定程度上介导了Gln的摄取，阻断这种活性会降低细胞生长并增加细胞内ROS的释放。

为了评估谷氨酰胺耗竭和SLC1A5对谷氨酰胺依赖性摄取对细胞周期进展的影响，A549细胞用补充的生长培养基（+Gln+Sup）、补充的生长消除培养基（+Gln−Sup）和谷氨酰胺消除培养基，缺乏谷氨酰胺和生长补充剂（−Gln−Sup）或（+Gln+Sup）培养基+5 mmol/L GPNA的培养基。仅谷氨酰胺消耗（−Gln+Sup）导致生长完全抑制，如在G₁S期和G期细胞数减少₂–M期，但细胞活力不受影响(图4A和B). 在用GPNA处理的细胞中也观察到类似的效果。为了测试Gln缺失的抗增殖作用是否可归因于SLC1A5活性，我们通过使用特定的siRNA从基因上靶向SLC1A5-下调。在与2种不同浓度的抗SLC1A5-siRNA孵育72小时后，通过Western blotting证实了SLC1A5/蛋白的显著下调(图5A). 与谷氨酰胺耗竭和GPNA处理类似，当小干扰RNA下调SLC1A5时，观察到生存能力和生长显著降低(图5B和C). siRNA下调SLC1A5也导致细胞周期在G₁.

虽然文献表明SLC1A5的细胞表面表达增加可以解释为癌症对谷氨酰胺代谢的依赖性，以支持其对能量和大分子生物合成的高需求(33–35)最近的研究表明，SLC1A5介导谷氨酰胺转运独立于谷氨酰胺代谢，对于激活某些癌症类型中的关键生存和细胞生长信号级联，包括mTOR和ERK通路是必要的(24, 28, 36). 为了测试肺癌细胞摄取Gln是否会诱导mTOR信号传导，我们首先将H520细胞饥饿24小时。第二天，细胞在培养基中添加谷氨酰胺（+Gln-Sup）或无谷氨酰胺（−Gln+Sup），但添加生长因子（EGF和胰岛素）或完整生长介质+5 mmol/L GPNA，持续1小时。然后采集细胞，进行裂解，并通过Western blotting分析mTOR通路的激活状态。如所示图6B与总mTOR蛋白相比，磷酸化mTOR（p-mTOR）的水平通过Gln缺失或GPNA处理而降低。与总蛋白水平相比，p-mTOR水平的降低导致其下游靶点p85 S6K和p70 S6K的活化降低。与mTOR激活相比，我们没有检测到磷酸化pAKT和p-ERK水平所指示的Akt或ERK信号级联的显著变化(图6B). 与H520相反，在H1819细胞中，通过mTOR的信号传导不受任何一种Gln剥夺GPNA治疗的影响（SLC1A5为空），而生长补充剂的剥夺削弱了该细胞系中mTOR和ERK的激活(图6A). 这些结果与以前的研究一致，这些研究表明细胞外谷氨酰胺能够激活生长信号级联，如mTOR信号，并表明Gln作为生长信号刺激物发挥作用(24, 28). 这种机制是否在所有表达SLC1A5的肺癌细胞中普遍存在尚不清楚。

我们首次报道了SLC1A5作为候选诊断生物标志物的临床相关性以及其在肺癌中的生物学功能。我们的结果表明，SLC1A5介导肺癌细胞生长和生存所需的谷氨酰胺转运。具体而言，我们报告了（i）SLC1A5在细胞质膜上过度表达，并与鳞癌组织学和男性相关，（ii）肺癌细胞中谷氨酰胺的摄取部分由SLC1A5s介导，（iii）SLC1A5的表达调节NSCLC细胞对谷氨酰胺的生长依赖性，（iv）阻断肺癌细胞中SLC1A5相关Gln的摄取可增加细胞内ROS的释放，（v）靶向SLC1A5-导致G₁通过抑制mTOR信号来阻止。

SLC1A5的表达与鳞癌组织学显著相关，但并不局限于鳞癌组织(图1和补充图S1），并与男性较高的肿瘤表达水平显著相关(图1B和表1). 这种性别相关性的生物学原因尚不完全清楚。一种可能的解释是，性激素可能调节SLC1A5，其他氨基酸转运蛋白可能解释这些发现，值得进一步研究。氨基酸转运体在包括肝脏在内的不同实体瘤中的表达模式(10, 12)，胸部(12)和结肠癌(37)出现在文学作品中。在肺癌中，最近对160个非小细胞肺癌患者进行的组织学研究发现，在79.6%（43/54）的非腺癌和15.1%（16/106）的腺癌中，Lat1（一种钠依赖性氨基酸转运蛋白）表达(38). 同一项研究还表明，Lat1的表达与糖酵解、血管生成、磷酸肌醇-3激酶（PI3K）/Akt、EGF受体（EGFR）和mTOR途径的标志物显著相关。此外，同一组发现Lat1与非小细胞肺癌的化疗耐药性和不良预后相关(39). 由于缺乏功能数据，本报告为氨基酸转运蛋白在肺癌进展中的潜在重要性提供了初步证据。未来的功能研究应旨在确定Lat1对肺癌细胞谷氨酰胺摄取的相对贡献。

SLC1A5在正常细胞和癌细胞中具有已知功能：在胎盘发育过程中作为逆转录病毒受体，在乳腺癌中作为癌-内皮细胞融合(25, 40)，作为一种中性氨基酸转运蛋白，对谷氨酰胺具有高亲和力(11, 41). 肺癌模型的早期研究在体外和体内表明谷氨酰胺对细胞的生长和活力都是必不可少的(14–16). 因此，我们致力于研究SLC1A5对肺癌细胞株谷氨酰胺转运的作用。我们假设SLC1A5在肺癌和细胞系中的增强表达可能是一种适应机制，使肺癌细胞能够有效地从细胞外环境中捕获过多的Gln。我们的结果表明，A549细胞对Gln的大多数摄取发生在Na⁺-依赖性时尚，其中一半由SLC1A5介导。SLC1A5的药理学和基因靶向性通过迫使细胞在G₁阶段。因为SLC1A5可以运输包括谷氨酰胺在内的脂肪族中性氨基酸(10, 41)我们预计，其阻断的部分生长抑制作用可归因于减少其他中性氨基酸的摄取。尽管如此，因为SLC1A5与Gln（循环中最丰富的氨基酸）有很高的亲和力，并且SLC1A5的Na占50%⁺-依赖性谷氨酰胺转运(图2和补充表S2），SLC1A5活性很可能是观察到的表型效应的原因。这些数据还表明，其他Na⁺-依赖性转运体如SN1（SLC38A3）和/或SN2（SLC39A5）可能有助于癌细胞摄取Gln。未来的研究需要评估其他氨基酸转运蛋白在肺癌中的相对贡献。

我们的结果显示，肺癌细胞中SLC1A5的siRNA下调的抗生长作用与以前使用反义方法下调肝癌细胞中SLC1 A5的研究一致(24). SLC1A5下调对肺癌细胞周期进展的直接影响提供了第一个强有力的证据，证明SLC1A5是Gln可用性和细胞分裂之间的联系。除此之外，还符合我-谷氨酰胺与癌症进展(18, 19)，我们发现GSS（一种催化γ转化的速率限制酶）的蛋白质水平-我-谷氨酰-我-半胱氨酸合成谷胱甘肽(42)，A549高于H1819。有趣的是，GSS的表达模式与SLC1A5在这两种细胞系中的表达模式相同。这与我们的鸟枪蛋白质组数据一致，该数据显示GSS在SCC和ADC I期NSCLC组织中与对照组相比过度表达（数据未显示）。为了验证SLC1A5转运的Gln有助于GSH合成的假设，我们用GPNA抑制了转运蛋白活性。随着GPNA剂量的增加，SLC1A5的阻断导致A549（SLC1A5阳性）细胞内ROS释放增加，但H1819（SLC1A5阴性）细胞内ROS释放增加（补充图S3C）。这些结果表明，SLC1A5的表达可能是肺癌细胞为对抗微环境中的氧化应激而采用的更广泛的代谢重编程方案的一个组成部分。

最近的研究表明，SLC1A5活性独立于谷氨酰胺代谢，在某些癌症类型中对激活关键生存和细胞生长信号级联（包括mTOR和ERK通路）具有新的作用(24, 28). Gln及其转运蛋白在癌细胞中的作用超出了氨基酸的传统代谢功能。与这些报告一致，我们的结果(图6B)提示通过SLC1A5摄取谷氨酰胺可以激活H520 SCC细胞中独立于生长因子的mTOR信号。总之，本研究的结果表明，对谷氨酰胺的生长依赖性与SLC1A5的表达和活性有关，抑制其谷氨酰胺摄取活性对肺癌细胞具有细胞抑制作用体外试验。

总之，我们的结果首次提供了SLC1A5活性与肺癌细胞对谷氨酰胺的生长依赖性之间的功能联系。靶向SLC1A5活性的细胞抑制作用可以部分解释为mTOR信号的失活，以及肺癌细胞生物合成大分子所需的细胞内谷氨酰胺库的耗竭。SLC1A5的差异表达、其细胞表面位置及其作为氨基酸转运蛋白的功能使其成为肺癌中有吸引力的靶点。

没有披露潜在的利益冲突。

概念和设计：M.Hassanein、J.E.Clark、W.E.Alborn、P.P.Massion

方法开发：M.Hassanein、M.Shiota、W.E.Alborn、P.P.Massion

数据采集（提供的动物、采集和管理的患者、提供的设施等）：M.Hassanein、M.D.Hoeksema、J.Qian

数据分析和解释（例如统计分析、生物统计学、计算分析）：M.Hassanein、H.Chen、J.E.Clark、P.P.Massion

撰写、审查和/或修订手稿：M.Hassanein、J.E.Clark、W.E.Alborn、R.Eisenberg、P.P.Massion

行政、技术或物质支持（即报告或组织数据、构建数据库）：M.D.Hoeksema、M.Shiota、B.K.Harris

研究监督：M.Hassanein，P.P.Massion先生

作者感谢Snjezana Zaja-Milaovic在处理组织和细胞系阵列方面的帮助，感谢Adriana Gonzalez博士在TMA肿瘤病理分类方面的帮助以及Brian Lehmman在siRNA实验方面的帮助。

这项工作得到了范德比尔特体内细胞和分子成像中心（ICMIC）职业发展奖（授予M.Hassanein）、NCI拨款CA102353（授予P.P.Massion）和范德比特肺癌SPORE项目（授予P.P Massion）的支持（P50CA090949）。

这篇文章的出版费用部分由支付版面费支付。因此，必须在此标记此物品广告根据《美国法典》第18卷第1734节，仅为了表明这一事实。