唾液microRNA的发现、表征及其在口腔癌检测中的临床应用

口腔鳞状细胞癌（OSCC）占口腔癌的约90%。在美国，口腔鳞癌是第六大常见癌症，每年导致约8000人死亡(1). OSCC的平均5年生存率为～50%。令人震惊的是，这个数字在过去三十年里没有变化(2). 因此，需要一种早期检测OSCC的方法来提高患者的长期生存率。

唾液被用作口腔鳞状细胞癌的诊断介质，唾液分析物如蛋白质和DNA被用于检测口腔鳞状上皮细胞癌(1, 3, 4). 我们的实验室最近显示，唾液中存在数千个mRNA，一组唾液mRNA可用于口腔癌检测(5–7). 唾液mRNA似乎通过各种来源进入口腔，包括三个主要的唾液腺、龈沟液和脱落的口腔上皮细胞(8). 大多数唾液mRNA似乎以部分降解形式存在(9). 这些部分降解的mRNA通过与未知大分子的结合维持其在唾液中的稳定性(8).

微小RNA（miRNA）线-4和let-7最初发现于秀丽线虫作为动物发育的关键调节器(10). 自2000年以来，miRNA被大量挖掘(11–13). 从那时起，miRNA的产生机制和作用方式就得到了很好的描述。miRNAs作为mRNA内含子的一部分或作为一个独立的基因单位由RNA聚合酶II或RNA聚合物III转录(14, 15). 最初转录的miRNAs可以有数百到数千个核苷酸长，并且具有独特的干环结构，它被一种名为Drosha的III型RNase切割成<100个核苷酸干环结构(16). 然后，这些前miRNAs通过exportin 5从细胞核输出到细胞质。在细胞质中，前miRNA通过另一种III型核糖核酸酶Dicer进行另一轮核内裂解(17, 18). 完全处理的miRNAs长度约为18至24个核苷酸。这些成熟的miRNAs由一种称为RNA-induced silencing complex（RISC）的蛋白质复合物结合，该复合物由四种精氨酸家族蛋白Ago1-4组成(19). 这种活性miRNA-RISC复合物基于miRNA和mRNA之间的序列同源性与靶mRNA结合。通常，miRNA阻碍mRNA翻译和/或导致mRNA降解。由于miRNAs与靶mRNAs的互补性稍有缺陷，估计一个miRNA能够以不同的结合效率结合100多个不同的mRNA。由于人类基因组中预计存在约1000个miRNAs，推测所有mRNAs中约30%是由miRNAss转录后调节的(20, 21).

最近从各种生物体中发现了数百种miRNA，并进行了功能分析，结果表明miRNA在细胞生长、分化、凋亡、应激反应、免疫反应和葡萄糖分泌方面具有重要功能(22–26). 许多研究小组已经表明，与正常细胞相比，miRNAs在各种癌症细胞中的表达是不同的，并且似乎miRNA比mRNA更准确地聚集不同类型的实体肿瘤，这表明miRNA可以用于检测癌症(22). 此外，癌细胞和正常细胞之间mRNA的倍数变化相对较小，而许多miRNAs的表达水平表现出数十到数百倍的倍数变化(27).

在这项工作中，我们在健康对照组和口腔鳞癌患者的全唾液和上清液中分析了最近发布的miRBase 12.0版中注册的708个人类miRNAs中的314个。

如前所述，用RNAlater（QIAGEN，Inc.）保存整个唾液样品，用SUPERase·In（Ambion，Inc.）保留上清液唾液样品(28). 如前所述收集整个唾液的上清液相(5). 所有唾液样本始终保持在−80°C。所有志愿者都签署了加州大学洛杉矶分校机构审查委员会批准的参与研究的同意书。收集唾液时，10名患者处于肿瘤I期，14名患者处于II期，16名患者处于III期，10名处于IV期。OSCC志愿者的平均年龄为56岁，他们的人口统计分类如下：41名白种人，4名亚洲人，4名西班牙裔，1名非裔美国人；男性32人，女性18人。对照组志愿者的平均年龄为52岁，其人口统计学分类如下：39名白种人、3名亚洲人、3名西班牙裔和5名非裔美国人；29只雄性和21只雌性。志愿者没有免疫缺陷、自身免疫性疾病、肝炎或HIV感染史。

使用400微升全唾液混合物（200μL全唾液和200μL RNAlater）和400μL上清液唾液进行RNA提取。唾液样本使用米尔Vana miRNA分离试剂盒符合制造商指南（Ambion，Inc.）。在最初的分析步骤中，我们使用每400μL唾液样品1mL的lysis/Binding溶液。提取后，用DNA消化100μL纯化RNA-自由的（Ambion，Inc.）完全去除任何基因组DNA。然后使用真空吸尘器（Eppendorf）使RNA样品完全干燥，并在20μL水中重新悬浮。

我们共分析了314个miRNAs（见补充数据表1用于逆转录酶扩增（preamp）-定量PCR（RT-preamp-qPCR）的所有试剂均来自Applied Biosystems。使用Bio-Rad Laboratories的PTC-200热循环仪进行逆转录（RT）和前置放大器，并使用7500和7900HT快速实时PCR系统（Applied Biosystems）进行qPCR反应。

对于314和71-plex RT-preamp，总共5μL的RT反应包含以下内容：2μL RNA，0.5μL 10×RT引物混合物（314 miRNA复合物），0.1μL 25 mmol/L脱氧核苷酸三磷酸，1μL 50 U/μL MultiScribe逆转录酶，0.5μL10×RT缓冲液，0.6μL 25 mm ol/L MgCl₂、0.06μL 20 U/μL AB核糖核酸酶抑制剂和0.24μL水。RT反应在热循环器中进行，条件如下：（16°C 2 min，42°C 1 min，50°C 1 s）40个循环，85°C 5 min。Preamp反应包含5μL RT，12.5μL 5×Preamp底漆混合物，5μL 314复合5×Preamp底漆混合液（各250 mmol/L）和2.5μL水。在以下条件下，在热循环器中进行前置放大器反应：95℃10 min，55℃2 min，72℃2 min和（95℃15 s，60℃4 min）14个循环。然后，通过添加75μL水将前置放大器产品稀释4倍。最后，10μL qPCR反应包含0.025μL稀释前放大器产物、5μL 2×TaqMan Master Mix（不含UNG）、2.975μL水和2μL 5×PCR探针/引物混合物。所有qPCR反应均重复进行。

四种RT-preamp-qPCR扩增出以下四种miRNAs：miR-142-3p、miR-200a、miR-125a和miR-93。对于RT，我们没有使用mega-plex RT协议，而是使用了标准的ABI RT反应条件，该条件包含以下内容：1μL RNA总反应7.5μL，三磷酸脱氧核苷酸混合物0.075μL，0.5μL 50 U/μL MultiScribe逆转录酶，0.75μL 10×RT缓冲液，0.095μL AB RNase抑制剂，3.58μL水，和1.5μL，分别含有0.375μL的四个引物。RT反应在16°C下进行30分钟，在42°C下执行30分钟。如上文所述进行预放大。将前amp产物用水稀释4倍，并如上所述使用0.1μL cDNA进行qPCR。

向10mL合并的上清液唾液中，加入5μL 100μmol/L miR-124a，并在每个时间点取出400μL一式三份的样品，并立即与赖氨酸/结合溶液孵育，赖氨酸/结合溶液是米尔Vana miRNA分离试剂盒，直到时间过程完成。提取的RNA用DNA消化-自由的，浓缩至30μL。如上所述，使用两微升纯化RNA进行RT反应。然后用水将RT稀释10倍，并使用2μL稀释的RT产物进行10μL qPCR反应，如上所述。qPCR重复进行。

为了使RNA输入量正常化，我们还对RNA聚合酶III-转录的U6 snRNA进行了RT-qPCR反应，这是细胞中miRNA正常化常用的RNA。两组间U6原始值的比较无显著差异(P（P）=0.27，曼希特尼单位测试）。通过减去U6周期阈值（C_吨)标记C的值_吨使用R的stats Utilities包对值和进行分析⁸

我们之前已经证明唾液中含有一个转录组，唾液mRNA的一个子集可以用作口腔癌检测的生物标记物(5–7). 为了在唾液中发现更多的疾病生物标志物，我们测试了唾液液中miRNAs的存在。12名健康对照者的全唾液和上清液均用于miRNA分析。我们从200μL全唾液或400μL上清液中提取总RNA。我们最初使用RT-preamp-qPCR检测了6名参与者的314个miRNAs。我们任意考虑了带有C的miRNAs_吨唾液中的值低于35。在最初分析的314个miRNAs中，发现71个存在于至少两名参与者中。然后，我们进一步分析了第二组六个样本中的71个miRNA（有关miRNA和RT-preamp-qPCR数据的列表，请参阅补充表S2）。我们对这12名参与者的结果表明，在整个唾液中可以检测到47个miRNA，在唾液上清液中可以检测出52个miRNA(表1A). 在整个唾液中，12名参与者中至少有11人存在47个miRNAs中的13个，在上清液唾液中，52个miRNA中的28个也存在于12名参与者的至少11人中(表1B). 健康对照组的整个唾液中存在的所有13个miRNAs也存在于上清液中(表1B). 这些数据共同表明，整个唾液和上清液中都含有可检测到的miRNA，健康参与者的唾液中似乎存在一组常见的miRNA。

我们之前表明，唾液mRNAs通过与目前未知的大分子结合而免受降解(8). 血浆和血清mRNA也观察到这种机制(8, 29, 30). 为了测试唾液中的miRNAs是否也受到保护而不被降解，我们测量了唾液中内源性和外源性miRNA的降解模式。作为唾液内源性miRNAs的模型，我们测量了miR-191，因为它始终显示低C_吨所有测试唾液样本的值。作为外源miRNAs的模型，我们设计了一个与miR-124a序列同源的RNA寡核苷酸。健康对照组的所有12份唾液样本均不含miR-124a，因此该miRNA可以很好地代表唾液外源RNA。在时间0时，将外源性miR-124a添加到唾液中，并在室温下进行30分钟的时间过程。在不同的时间点取出等分样品，并对miR-191和miR-124 a的纯化总RNA进行RT-qPCR。外源性miR-124a水平在时间过程中迅速下降，到3分钟时，检测到<10%的miR-124 a(图1). 这些数据表明miR-124a在唾液中快速降解。相比之下，miR-191的水平下降得慢得多，到30分钟时，仍有约30%的miR-191被检测到。总之，这些数据表明内源性miRNA的降解速度比外源性miRNA慢。

为了测试唾液miRNA是否可以用于口腔癌检测，我们比较了口腔鳞癌患者和年龄、性别、种族和吸烟史相似的健康对照者的唾液miRNA谱。对唾液上清液进行分析，以避免细胞的miRNA污染。在最初的12个对照组和12个OSCC患者数据集中，四种潜在的miRNAs被确定为在组间具有统计学意义的水平(P（P）< 0.05). 这些miRNAs是miR-200a、miR-125a、miR142-3p和miR-93(表2A). 然后，我们使用RT-preamp-qPCR在另外38个对照组和38个OSCC样本的独立队列中测试了这四种miRNA的潜在意义。因为我们只想测量这四种miRNAs，所以我们在这组实验中使用了一种简化的RT反应（见材料和方法）。我们还使用简化的RT条件对最初的12个对照和12个OSCC样品重复了RT-preamp-qPCR（见材料和方法）。平均C_吨,P（P），50名对照组和50名OSCC患者的组合数据集中这些miRNAs的AUC值如所示表2B. TheP（P）miR-200a和miR-125a的值在两组之间存在显著差异，分别为0.01和0.03。然而P（P）miR-142-3p和miR-93的值分别为0.18和0.17，这表明这些miRNAs在对照组和OSCC组之间没有显著差异。miR-200a和miR-125a的AUC分别为0.65和0.62，而miR-142-3p和miR-93的AUC较低；分别为0.58和0.57。miR-200a和miR-125a的联合AUC为0.66。RT-preamp-PCR结果的SD也包括在表2总之，这些数据表明，口腔鳞癌患者唾液中miRNAs miR-200a和miR-125a的水平明显较低。

我们小组以前的报告表明，唾液mRNA可以作为口腔癌的生物标志物，七种不同mRNA的联合检测显示出0.91的特异性和敏感性，可用于口腔癌的鉴别(5, 7). 为了提高唾液对口腔癌的诊断能力，我们对唾液中的miRNAs进行了分析，以确定是否有miRNA可以用作潜在的诊断标记。我们已经证明，整个唾液和上清液都含有miRNAs，并且它们的特征非常相似。OSCC患者和健康对照组唾液中miRNA的比较表明，OSCC患者唾液中的两种miRNA含量明显低于对照组唾液。与唾液中的mRNA类似，唾液中的miRNA比外源性miRNA更稳定。最近，在怀孕女性的血浆中发现了无细胞母体和胎盘来源的miRNAs。这项研究还表明内源性血浆miRNA比外源性miRNA更稳定(31).

平均而言，我们在整个唾液和上清液中检测到约50个miRNAs。然而，整个唾液似乎含有更异质的miRNA群体，因为与上清液唾液（~28）相比，一致检测到的miRNA更少（~13）。全唾液miRNA图谱的异质性可能是由于唾液中脱落的口腔上皮细胞数量的个体差异所致。我们之前已经证明，分别从三个主要唾液腺和牙龈缝隙收集的口腔液中含有数百个mRNA(8). 因此，我们认为，尽管整个唾液中含有来自脱落口腔上皮细胞的miRNA和来自不同口腔液的miRNA，但上清液中应含有少量或无来自脱落口腔粘膜上皮细胞的micRNA。唾液中脱落的口腔上皮细胞的数量因人而异，这取决于口腔健康状况和唾液流速，这导致与个人之间的上清液相比，整个唾液中的miRNAs存在异质性。

我们之前的数据表明，内源性唾液信使核糖核酸比裸露的外源性信使核糖核酸更稳定，因为它们与大分子有关(8). 在细胞中，成熟的miRNA与RISC复合体结合，这种相互作用使细胞中的miRNA具有稳定性。唾液中的miRNA很可能也与RISC结合，使唾液中的这些miRNA具有稳定性。使用RISC复合物成分Ago 2特异性抗体对唾液进行免疫印迹分析，结果表明Ago 2存在于上清液唾液中（数据未显示）。

我们发现两种唾液miRNAs，miR-200a和miR-125a，它们在口腔鳞癌患者唾液中的水平低于健康对照组。通过瞬时转染研究表明，miR-125a及其同源物miR-125b可以降低人乳腺癌细胞系SKBR3细胞中ERBB2和ERBB3致癌蛋白的水平(32). 据报道，miR-200a在头颈癌细胞系和其他癌细胞中有差异表达(27, 33–35). 有趣的是，在本研究中，与健康对照组相比，口腔鳞癌患者的miR-200a水平较低。相反，miR-200a在各种口腔鳞状细胞系中的表达水平较高(27, 35). 这种差异可能是由于与活细胞中的miRNA相比，观察到miRNA的无细胞状态所致。因为上清液唾液是唾液的无细胞期，所以上清液中的一些miRNA很可能是细胞死亡的副产品。与调节性mRNA的降解类似，肿瘤特异性miRNAs在细胞死亡期间可能会经历更快的降解和/或更短的半衰期(36).

总之，我们已经证明，miRNAs存在于整个唾液和上清液唾液中。其中两种miRNAs，miR-125a和miR-200a，在口腔鳞癌患者的唾液中的表达与健康对照组相比存在差异。这些发现表明，唾液中miRNAs的检测可以作为口腔癌的无创快速诊断工具。因此，miRNAs是唾液中的第三个诊断字母表。

没有披露潜在的利益冲突。

我们感谢ABI，特别是陈彩福博士为RT-preamp-qPCR提供了宝贵的意见和试剂。