钙离子瞬时受体电位通道的差异作用²⁺前列腺癌上皮细胞的进入和增殖

雄激素逃逸后，前列腺肿瘤细胞的增殖变得独立于正常的生长控制机制。已知控制生理和病理细胞增殖的各种生长因子、神经递质和激素参与细胞内钙的维持²⁺平衡。虽然这些激动剂在前列腺癌进展过程中的性质尚未得到很好的确定，但它们总是诱导钙²⁺名为“激动剂诱导钙”的条目²⁺条目”（ACE；参考。1–4).

尽管α₁-肾上腺素受体（α₁-AR）拮抗剂已广泛用于良性前列腺增生症的临床治疗(5)，α的确切作用₁-前列腺癌生长控制中的AR偶联信号通路尚不清楚。α₁-AR拮抗剂在不影响细胞增殖的情况下诱导人前列腺癌上皮细胞和平滑肌细胞凋亡(6)，不受其对α的影响₁-应收账款(7, 8). 使用雄激素依赖性前列腺淋巴结癌（LNCaP）细胞系(9)，我们之前已经证明α₁-AR刺激激活导致ACE的非特异性阳离子通道(10).

有趣的是，我们还表明，与α的刺激作用相反₁-前列腺癌细胞生长的AR，代谢性嘌呤能受体（P2Y-R）参与DU-145人前列腺癌细胞的生长阻滞(11). 两种受体对细胞增殖的不同影响令人惊讶，因为α₁-已知AR和P2Y-R与普通磷脂酶C（PLC）催化的肌醇磷脂分解信号通路偶联，α₁激动剂和细胞外ATP能够诱导细胞内游离钙明显增加²⁺（[钙²⁺]_我; 参考文献。12, 13). 只有当每个受体控制的ACE使用不同但仍不确定的钙时，才能解释细胞增殖的相反末端效应²⁺-可渗透膜通道最终以各种细胞内效应器为靶点。目前，广泛研究的瞬时受体电位（TRP）通道家族的成员，尤其是TRP规范亚家族的成员(14)，被认为是最有希望的候选ACE，包括参与增殖细胞活性的ACE(15–18). 然而，TRP参与生成钙的翻译机制²⁺前列腺癌细胞增殖活性的信号尚不清楚。

参与细胞增殖和凋亡的基因的表达受核转录因子调控。活化T细胞核因子（NFAT）蛋白代表Ca家族²⁺-依赖性转录因子(19)其活性受钙调节²⁺/钙调素依赖性蛋白磷酸酶(19). 另一种普遍表达的转录因子由核因子-κB（NF-κB）家族代表(20)已知其依赖于钙²⁺体内平衡，特别是钙的填充状态²⁺内质网(14).

在本研究中，我们首先询问不同的膜受体通过共同的信号级联触发的ACE对前列腺癌上皮细胞增殖的不同影响是否可以用钙的不同耦合效率来解释²⁺参与NFAT或NF-κB活化的进入途径。其次，我们希望确定，如果后者是这样的话，那么这些通路下面是什么类型的膜通道。为此，我们使用了从切除标本建立的hPCE细胞的原代培养物，从实际角度来看，这比使用细胞系更为相关。

初级培养。将人类前列腺标本机械分离，然后在KSF培养基（马里兰州盖瑟斯堡市生命技术贝塞斯达研究实验室）中培养，补充50μg/mL牛垂体提取物和50 ng/mL表皮生长因子，以特异性选择上皮细胞。通过免疫荧光染色对每个样本进行分析，以验证上皮标记物的表达（细胞角蛋白14和18；参考文献。21; 数据未显示）。培养基中还含有50000 IU/L青霉素和50 mg/L链霉素。细胞通常生长在50毫升的烧瓶中（法国斯特拉斯堡保利实验室Nunc），并在37°C的湿度培养箱中保存在95%空气/5%CO中₂大气。对于电生理和钙成像实验，细胞在培养皿（Nunc、Naperville、IL）中继代培养，并在3至6天后使用。每个原代培养只维持2周，以防止其分化表型的丢失。

我们使用了来自四种局限性前列腺癌的标本，Gleason评分为8-10，前列腺特异性抗原（PSA）水平≥4.0 ng/mL，临床肿瘤分期为T₂根据肿瘤无转移、无化疗和/或抗雄激素治疗史的标准，选择接受根治性前列腺切除术的患者。因此，来自标本的前列腺癌上皮细胞很可能代表雄激素依赖人群。独立的组织学和解剖病理学分析证实了正常上皮细胞的缺失。所有关于患者组织的实验都是根据“Comite®Consultatif de Protection des Personnes dans la Recherche Biome®dicale de Lille”提供的协议编号“CP 01/33”下的医学伦理学进行的

钙成像。[加利福尼亚州²⁺]_我使用fura-2进行测量（如前所述；参考文献。22, 23). 细胞外溶液含有120 mmol/L NaCl、6 mmol/LKCl、2 mmol/LCaCl₂，2 mmol/L氯化镁₂、10 mmol/L HEPES和12 mmol/L.葡萄糖。对于Ca²⁺-游离HBSS，CaCl₂去除，并添加EGTA（0.5 mmol/L）。

电生理学和解决方案。如其他地方详细说明的，电流记录使用了全电池补丁灯技术(24, 25). 细胞外溶液含有150 mmol/L NMG、20 mmol/LCsCl或10 mmol/LCaCl₂，20 mmol/L TEA（Cl），pH 7.3（用HCl调节）。细胞内溶液含有125 mmol/L NMG、10 mmol/L-HCl、1 mmol/L-MgCl₂，2.6 mmol/L氯化钙₂（计算[Ca²⁺]_自由的=100 nmol/L），10 mmol/L HEPES，8 mmol/L.EGTA，20 mmol/L.NaCl，pH 7.2（用谷氨酸调节）。

逆转录-PCR分析。从hPCE细胞中分离出总RNA，如前所述(10). 对于PCR反应，基于Genbank hTRP序列，使用Genejodger II（Biosoft，Cambridge，United Kingdom）设计了特异性正义和反义引物，如表1为了进一步鉴定PCR-扩增产物，每个PCR条带要么使用每个扩增片段的特定酶进行限制性分析，要么在TA克隆载体（Invitrogen，San Diego，CA）中亚克隆，然后进行测序分析。

用作正义和反义的选定寡核苷酸序列见表1.

瞬时转染。对于反义分析，针对每个TRPC（TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6）的正（对照）和反义寡核苷酸（Eurogentec，Southampton，United Kingdom）在起始ATG密码子水平设计（参见表1用于序列）。用0.5μmol/L硫代磷酸反义寡核苷酸和2.5μmol/Lcytofectin（GS 3815与DOPE的摩尔比为2:1，未分级；Eurogentec）处理hPCE细胞长达72小时，或通过直接将其添加到培养基中来感测寡核苷酸。寡核苷酸转染程序如前所述(26).

Cis公司-报告系统（pNFAT-Luc质粒、pNF-kBLuc质粒和pCIS/CK阴性对照质粒）由Stratagene（Pathdetect In-vivo Signal Transduction Pathway）提供顺式-报告系统，加利福尼亚州拉荷亚）。将保存在DMEM-HG中的hPCE细胞放置在六孔板中过夜，并用顺式-使用Geneporter-2（Ozyme，Saint-Quentin en Yvelines，法国）在2 mL无血清DMEM-HG中选择的报告系统。8小时后，添加2 mL无血清培养基，其中含有10μmol/L苯肾上腺素或100μmol/L ATP（西格玛，密苏里州圣路易斯）。

蛋白质印迹。用抗TRPC6特异性（ACC-017，Alomone，Jerusalem，Israel）、抗cdk4特异性（NCL-cdk4-35，来自英国纽卡斯尔-泰恩河畔的Novocastra）、，如前所述，抗p27特异性抗体（来自加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯科技公司的sc-1641）、抗β-肌动蛋白特异性抗体(25). 通过Quantity-One软件（加利福尼亚州Hercules，Bio-Read）上的密度测定法对谱带强度进行量化。对于每个实验，将TRPC6、cdk4和p27的信号强度归一化为calnexin或β-actin值，作为负荷控制。

免疫荧光染色。如前所述，通过用cdk4（来自Novocastra的NCL-cd4-35）和p27（来自Santa Cruz Technology的sc-1641）抗体进行免疫荧光染色来评估cdk4和cdk抑制剂p27的表达(10).

荧光素酶分析。转染48小时后收集培养物进行荧光素酶活性测定。细胞裂解后，使用荧光素酶检测试剂盒（kit Galacto-Light，Tropix）通过生物发光测量（荷兰Landgraaf Lumac的Biocounter M1500光度计）测定从这些细胞中提取的荧光素酶水平。

增殖分析。CellTiter 96水性非放射性细胞增殖试验（Promega Corp.，Madison，WI）用于测定增殖中活细胞的数量，如前所述(10). 细胞以7.5×10的初始密度播种^三96 well板中的每口井（Poly Labo）。经过48小时的处理或在对照条件下生长后，将细胞胰蛋白酶化，转移到单独的试管中，并在350×克持续10分钟。在显微镜下仔细检查96号平板上的每个孔，以确保所有细胞都被回收。倒出离心后的上清液；这些细胞被仔细地悬浮在马拉塞兹小室中进行计数。

数据分析。每个实验重复数次，结果在适当的情况下表示为平均值±SE。使用Origin 5.0软件（Microcal，Northampton，MA）进行数据分析。

α₁-AR和P2Y-R耦合Ca²⁺信号传导涉及不同类型的钙²⁺hPCE细胞的进入途径。两者都是α₁-已知肾上腺素能受体和P2Y-嘌呤能受体可刺激PLC催化的肌醇磷脂分解，从而衍生出对钙重要的两个次级信使²⁺信号转导：三磷酸肌醇（IP_三)和二酰甘油（DAG）。IP（IP）_三释放Ca²⁺从细胞内储存，伴随的储存耗尽激活钙²⁺通过存储操作的Ca流入²⁺通道（SOC），而DAG诱导Ca²⁺通过直接浇灌一些阳离子钙进入²⁺-可渗透膜通道。各种钙源之间的相互作用²⁺在很大程度上决定了细胞内钙的分布²⁺浓度。

我们首先试图研究[Ca²⁺]_我刺激hPCE细胞中的每个受体所引发的信号。这是基于荧光测定[Ca²⁺]_我载钙人前列腺癌细胞的测量²⁺指示剂fura-2AM对α浴的反应₁-特异性激动剂，苯肾上腺素或嘌呤能受体激动剂，ATP。

图1A结果表明，苯肾上腺素（10μmol/L）诱导了规则的细胞内缓慢钙²⁺振荡。这些振荡的振幅和时间变量的量化(n个=67个细胞）提供Ca²⁺波峰值512±43 nmol/L，平均波长2.18±0.13分钟，平均造波周期4.2±1.06分钟。苯肾上腺素诱发[Ca²⁺]_我振荡严格依赖于细胞外钙²⁺（[钙²⁺]_外面的)退出后完全消失(图1A)从而表明钙的绝对需求量²⁺流入细胞膜以获得支持。此外，首次在钙中应用苯肾上腺素²⁺-游离溶液没有引起细胞内储存的钙的动员²⁺(图1B;n个=98），因此表明IP的可访问性较差_三-α的依赖存储₁-AR–触发信号，并指出DAG是该信号通路中的主要信使。

与这一概念一致，并与我们之前的研究完全一致(10, 27)，1-油酰基-2-乙酰基的应用-锡-甘油（OAG，100μmol/L）是一种膜透性DAG类似物，在诱导[Ca²⁺]_外面的-依赖[Ca²⁺]_我振荡(图1C). OAG诱发的振荡幅度甚至相同（546±39 nmol/L，n个=79）、持续时间（1.81±0.22分钟）和周期（3.1±0.9分钟）为苯肾上腺素诱导的，表明DAG下游的共同机制，基本上排除了IP的任何必要参与_三-相关流程。

与这些观察结果相反，ATP（100μmol/L）诱发了一个大的瞬态[Ca²⁺]_我增加（763±25 nmol/L，n个=93），随后在相当低的水平上持续稳定，对细胞外钙敏感²⁺移除(图1D). 最初在加州施用²⁺-自由溶液，ATP仅引起短暂[Ca²⁺]_我海拔580±28 nmol/L(n个=64）没有平台，正如人们预期的纯细胞内钙²⁺动员(图1E). 钙的重新引入²⁺在持续存在ATP的情况下，快速产生[Ca²⁺]_我增长后缓慢下降(图1E)可能反映了Ca²⁺-下膜钙的依赖性失活机制²⁺流入通道。因此，ATP实验为两种钙的贡献提供了明确的证据²⁺释放和钙²⁺整体条目[Ca²⁺]_我并表明P2Y-R控制Ca²⁺信令主要招募IP_三-和hPCE细胞中的存储相关过程。

总之，结果强烈表明Ca²⁺参与α的进入途径₁-AR介导的信号依赖于存储依赖性DAG门控膜通道，而P2Y-R介导的信使参与质膜SOC，后者在IP激活_三-依赖性钙²⁺存储耗尽。

苯肾上腺素和ATP刺激的ACE的差异储存依赖性。为了获得钙的不同储存依赖性和来源的更直接证据²⁺α参与的进入途径₁-AR和P2Y-R介导的信号传导，我们使用了几种方法。在第一个实验中，我们在ER Ca的背景下测试了苯肾上腺素和ATP的作用²⁺由thapsigargin产生的储存损耗，Thapsiga是一种已知的储存损耗剂，通过抑制SERCA泵钙发挥作用²⁺吸收。在第二部分中，我们检查了IP的影响_三肝素对苯肾上腺素和ATP激活膜电流能力的受体抑制。最后，我们筛选了一些不同类型的天然阳离子通道阻滞剂和TRP成员抑制苯肾上腺素和ATP诱导的[Ca²⁺]_我响应。

在使用thapsigargin的实验中，我们首先将其应用于钙²⁺-释放细胞内储存钙的游离溶液²⁺然后我们读了Ca²⁺启动存储操作的Ca²⁺条目（SOCE）。作为图2A研究表明，如果在毒肽诱导的SOCE过程中使用苯肾上腺素，它仍然能够激活特征钙²⁺SOCE顶部振荡(n个= 61). 相比之下，相同类型的ATP应用程序未能在[Ca中产生任何变化²⁺]_我在thapsigargin诱导的SOCE顶部(图2B;n个= 63).

知识产权的纳入_三受体拮抗剂肝素（0.1 g/L）在用于全细胞、斑贴试验的细胞内移液管溶液中不影响苯肾上腺素诱导的膜电流(图2C)但完全废除了ATP诱发电流(图2D;n个= 5-11). 苯肾上腺素和ATP均激活向内整流膜电流：I-V型两种电流的关系如所示插入属于图2C和D苯肾上腺素诱发电流在约2.0±0.7分钟内达到全振幅，其平均密度为11±1.5 pA/pFV（V）_米=−100毫伏(n个=11），而ATP感应电流的平均密度在约1.5±0.8分钟内达到全振幅，在V（V）_米=−100毫伏(n个= 5).

我们还比较了这些广泛使用的储存依赖性和储存非依赖性膜Ca抑制剂的效果²⁺以2-氨基乙氧基二苯硼酸盐（2-APB）、镧的形式转运³⁺、MDL、氟苯那酸和SK&F 96365对苯肾上腺素和ATP诱导的钙²⁺条目。鉴于所使用的药物均不能影响苯肾上腺素诱导的[Ca的时间变量²⁺]_我振荡，根据其在苯肾上腺素或最大[Ca时降低振荡幅度的能力来评估其有效性²⁺]_我Ca之后的标高²⁺ATP情况下的读取。如所示图2E(n个=95-102），除2-APB外，所有药物在低浓度（10μmol/L）下均强烈抑制ATP诱导的反应。除了SK&F 96365对苯肾上腺素诱导的反应有50%左右的阻断作用外，它们对苯肾上腺素诱发的反应几乎没有影响。这种不同的敏感性再次与储存依赖过程在ATP作用中所起的实质性作用相一致，但在苯肾上腺素作用中不一致，因为众所周知，所用的所有试剂对储存操作的通道比其他类型的阳离子通道更具特异性。此外，尽管2-APB效应可以阻止两个IP_三受体和SOC(28)，其在低浓度（10μmol/L）下刺激ATP反应和在高浓度（100μmol/L）下抑制ATP反应的能力与已知的2-APB对SOCs的双重增强抑制作用非常一致(28).

因此，我们的结果明确表明，在hPCE细胞中，ATP刺激P2Y-R偶联Ca²⁺信号传导涉及钙²⁺通过存储操作的膜通道进入，而苯肾上腺素刺激α₁-AR–耦合Ca²⁺信号传导涉及钙²⁺通过门店相关DAG-门控Ca进入²⁺渗透性阳离子通道。

hPCE细胞中TRPC通道的表达。使用特异性引物确定苯肾上腺素和ATP诱导的ACE下通道的分子特性(表1)利用逆转录-PCR技术，我们首先研究了人类TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6亚型mRNA在hPCE细胞中的表达。在第一组实验中，设计了特异性引物来扩增NH的一部分₂-围绕每个TRPC成员的起始密码子ATG的终端序列(图3A和D). 在第二组实验中，设计了特异性引物来鉴定TRPC4和TRPC6剪接变体亚型(图3E和F)，但TRPC1除外，其中NH₂-终端引物允许我们识别剪接变异体。图3显示TRPC1A剪接变异体转录本的表达(图3A)和TRPC3预期尺寸的PCR产物(图3B)，TRPC4(图3C)和TRPC6(图3D)在hPCE细胞中。剪接变异体亚型的研究(图3E和F)显示除了未剪接形式的TRPC4和TRPC6外，TRPC4β和TRPC6γ剪接异构体在hPCE细胞中也表达。

靶向TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6杂交缺失对ACE的影响。阐明每个确定的TRPC成员对α的贡献₁-AR和P2Y-R介导的钙²⁺信号转导方面，我们采用了反义杂交缺失技术。因此，我们减少了TRPC1/3/4/6的表达，从而可以评估其对苯肾上腺素、OAG和ATP刺激的钙的影响²⁺大量涌入。我们用每个TRPC成员特有的反义寡核苷酸处理细胞，然后将其用于钙²⁺成像。用不影响内源性mRNA水平的相应义寡核苷酸处理相同时间段的细胞作为对照。我们之前已经通过Western blotting分析显示前列腺细胞系中反义处理细胞与正义处理细胞中特异性TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6 mRNA表达的减少(29, 30).

因为苯肾上腺素和OAG诱导的[Ca的振荡性质²⁺]_我反应以及改变TRPC表达可能潜在影响振荡的振幅和时间变量的可能性，我们选择通过计算30分钟观察期内振荡面积（即计算积分）来表征反义处理的结果(S公司_钙)然后减去[Ca²⁺]_我基线。对于在标准条件下未处理的hPCE细胞中苯肾上腺素诱导的振荡，S公司_钙=2700±210 nmol/L·min。在ATP反应的情况下，根据最大[Ca²⁺]_我在钙的转化过程中²⁺-游离钙²⁺-含有溶液（参见图1E).

图4A显示TRPC1的反义杂交缺失(左上角；n个=48-85）以及TRPC4(左下角；n个=72-105）对ATP诱导的反应（即分别为87%和84%的抑制）产生显著的下调作用，实际上并不影响苯肾上腺素和OAG诱导的反应。相反，TRPC6的反义敲除强烈抑制了对苯肾上腺素和OAG的反应（分别为62%和59%），使ATP保持不变(右下角；n个= 59-99). 最后，TRPC3杂合物耗竭对ATP、苯肾上腺素和OAG诱导的反应的影响几乎相同，分别抑制了50%、52%和68%(右上角；n个= 54-87).

因此，这些数据表明内源性TRPC1和TRPC4通道仅参与ATP刺激的存储依赖型钙²⁺进入，而TRPC6是DAG门控通道，介导苯肾上腺素刺激的、储存无关的Ca²⁺hPCE细胞中的条目。内源性TRPC3可能在商店依赖性钙和商店依赖性Ca中发挥同等作用²⁺流入途径。

α₁-AR激动剂苯肾上腺素而非ATP通过TRPC6上调促进hPCE细胞增殖。在我们之前的研究中，我们已经表明，苯肾上腺素通过涉及钙的机制促进雄激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞的增殖²⁺流入，流入(10, 11)而细胞外ATP通过影响存储依赖性过程，导致雄激素依赖性前列腺癌DU-145的生长停滞(10, 11). 因此，研究这两种激动剂如何影响原代hPCE细胞的增殖是很自然的。

与我们对其他前列腺癌细胞类型的观察结果一致，用苯肾上腺素（10μmol/L）处理原代hPCE细胞2天可使其增殖增加37.3±2.0%，而相同时间的ATP（100μmol/L）处理可抑制细胞增殖61.6±1.6%(图4B). 证明TRPC6在α的生长调节特性中的关键作用₁-AR和P2Y-R激动剂，我们使用TRPC6杂交缺失的hPCE细胞。在没有激动剂的情况下，TRPC6正义（TRPC6/s）或反义（TRPC6/as）寡核苷酸处理不会改变hPCE细胞的增殖活性(图4B). 然而，在有苯肾上腺素存在的情况下，TRPC6正、反义处理细胞的增殖发生了显著的变化：如果正、反意处理没有改变苯肾上腺素通常的促增殖作用，那么反义处理不仅消除了这些作用，甚至逆转了这一趋势，从而导致增殖抑制。同时，TRPC6正反义处理不影响ATP对hPCE细胞增殖的抑制作用。

通过检测两种细胞周期调节因子cdk4和cdk抑制剂p27的表达，进一步证实了激动剂对细胞增殖的特异性作用(31)用抗cdk4和抗p27抗体进行半定量Western blot分析。检查中显示的图像图4C结果表明，与ATP相比，苯肾上腺素处理导致cdk4表达上调，p27表达下调，而ATP对这些细胞周期调节因子的表达的作用正好相反。这些结果通过FITC-结合抗cdk4和抗p27抗体的免疫染色得到证实(图4D). 这些数据使我们得出结论，苯肾上腺素和ATP对细胞计数的影响确实分别与细胞增殖和生长停滞有关。

此外，半定量Western blot分析参与苯肾上腺素诱导Ca的TRPC6表达的可能变化²⁺信号传导可能是生长调节作用的基础，它揭示了对苯肾上腺素治疗的反应中TRPC6表达的上调约3倍(图4E).

总之，这些结果表明TRPC6在苯肾上腺素生长调节功能中的关键作用。

α的增殖效应₁-AR激动剂涉及NFAT激活。确定哪种转录因子介导α₁-AR和P2Y-R激动剂对原代hPCE细胞生长的影响，我们使用含有荧光素酶报告基因插入物的pCIS-CK质粒瞬时转染细胞，该报告基因由合成NFAT或NF-κB依赖性启动子驱动（参见材料和方法）。

图5A结果表明，与在控制条件下维持的转染hPCE细胞相比，用苯肾上腺素（10μmol/L）处理2天可使NFAT依赖性荧光素酶的表达增加约5倍，而相同时间的ATP（100μmol/L）处理并未改变NFAT依赖型荧光素酶的表达，与控制值保持一致。同时，两种激动剂均未引起NF-κB依赖性荧光素酶表达的显著变化(图5B). 此外，苯肾上腺素诱导的细胞增殖增加与NFAT活性增加特别相关，因为环孢菌素A（100 nmol/L）或FK506（10μmol/L）阻断了钙调神经磷酸酶，从而阻碍了核NFAT的移位，在不影响ATP诱导的生长停滞的情况下阻止苯肾上腺素诱导细胞增殖的能力(图5C). 因此，α₁-AR介导的hPCE细胞增殖刺激主要通过NFAT激活实现。

在目前的工作中，我们报告了钙的三个主要发现²⁺α对hPCE细胞增殖反作用的信号转导₁-AR和P2Y-嘌呤能受体激动剂：(一) α₁-AR激动剂苯肾上腺素刺激细胞内钙²⁺钙维持的振荡²⁺通过储存依赖性DAG门控膜通道进入，主要以TRPC6为代表，而P2Y-R激动剂ATP刺激储存依赖性和暂时性钙²⁺涉及SOC激活的信号，其主要贡献者是TRPC1和TRPC4。(b)TRPC6是α促增殖作用的关键决定因素₁-通过振荡型Ca的AR激动剂²⁺发送信号。(c（c）) α₁-AR激动剂刺激钙²⁺振荡提高了与核Ca的耦合效率²⁺-依赖性转录因子NFAT参与增殖促进基因表达的激活。

hPCE细胞的激动剂依赖性生长调节。在这项研究中，我们证实了关于α的生长调节特性的主要结论₁-AR和P2Y-R信号系统在我们之前关于前列腺抵消细胞系模型系统的研究中获得(10, 11)也适用于初级hPCE细胞。我们的研究是首次对原代细胞进行此类研究，其结果允许从一个共同的角度考虑所有数据，包括在细胞系中获得的数据。尽管在实际应用中，初级hPCE细胞代表了此类研究的首选模型（有关详细信息，请参阅材料和方法），但鉴于细胞系因其方便性和可访问性而广泛使用，这一点非常重要。

因此，似乎可以证明α₁-AR偶联信号传导与hPCE细胞增殖的增强有关，而P2Y-R信号传导诱导增殖活性的停止。我们已经证明，尽管是由常见的PLC催化的肌醇磷脂分解启动的，但这两种受体的下游途径还是因优先依赖两种不同的次级信使（即IP_三或DAG）。这种差异允许产生两种不同的细胞内钙模式²⁺这两个受体对激动剂介导的刺激产生反应，最终导致对细胞增殖产生相反的末端效应。

我们表明Ca的模式²⁺由α启动的信号₁-AR刺激的特点是有规律的振荡活动，这几乎完全基于钙²⁺DAG直接阻断进入通路，对IP无明显作用_三-介导的存储损耗。后者表现为苯肾上腺素不能产生可测量的钙²⁺在缺乏细胞外钙的情况下释放²⁺一般来说，这是令人惊讶的，因为大多数钙模型²⁺波的产生涉及钙之间的相互作用²⁺入口和IP_三-中介的、依赖于存储的流程(25, 26). 因此，它可能表明钙是非常局部化和分区化的²⁺无法改变全局的释放²⁺]_我或与仓库相关的Ca的参与²⁺摄取/挤出机制，例如线粒体机制。相反，Ca²⁺与P2Y-R刺激耦合的信号主要由IP决定_三-介导的、依赖于存储的过程，包括强健的Ca²⁺储存操作钙的释放和活化²⁺流入(图6). 目前，众所周知，IP_三在细胞内半衰期短，并且本地产生的IP扩散_三是速率限制(32–34). 然而，对在单个单元格中评估这些变量知之甚少：有相当多的计算模型，但没有可用的指标来允许IP_三要可视化(35). 研究DAG的细胞内信号似乎也存在类似的困难。碳-11标记的DAG被提议用于评估其细胞内信号传导，但其使用需要进一步研究(36). 由于这些技术限制，解决了α₁-AR耦合和P2Y-R信号似乎不现实。

最近的数据表明，振荡[Ca²⁺]_我活性可能特别适合钙的特异性²⁺信号(37)，因为振幅和频率信号编码的可能性允许针对不同的效应器。我们关于选择性增殖促进α的数据₁钙诱导的激动剂作用²⁺hPCE细胞中的振荡与这个概念一致。此外，事实上，这些振荡通过激活钙离子转化为增强hPCE细胞增殖²⁺-依赖性转录因子NFAT与之前关于钙的重要性的研究结果基本一致²⁺信号振幅和频率特征，用于确定与各种转录因子（包括NFAT）偶联的效率和特异性(37). 相反，Mignen等人报告了重复钙²⁺低激动剂浓度引起的振荡不能增强Ca²⁺-m3-HEK293中NFAT的依赖性激活，而高浓度激动剂可诱导胞浆Ca持续升高²⁺浓度能够转移NFAT(38). 然而，Ca²⁺在他们的实验中，信号模式明显不同：Ca²⁺在每次振荡过程中，浓度仅升高几秒钟（～10-15）(39)而T细胞和hPCE细胞的振荡周期为～2分钟。

另一方面，ATP介导的P2Y-嘌呤能受体刺激的抗增殖作用，通过诱导储存依赖性钙²⁺信号传导通常与ER-Ca的关键作用一致²⁺存储内容和SOCs在前列腺癌细胞凋亡调节中的作用，如我们之前的研究所示(23, 25). 事实上，P2Y-嘌呤能受体的持续激活可能导致内质网钙长期不足²⁺SOCE的储存和适应性降低，尽管这可能不足以诱导细胞凋亡(23, 25)，但足以发挥抗增殖作用(11).

TRP成员参与激动剂刺激钙²⁺hPCE细胞中的条目。我们的研究结果也强调了Ca的重要性²⁺α信号转导中的进入途径₁-hPCE细胞中的肾上腺素能和P2Y-嘌呤能受体。事实上，α₁-AR激动剂苯肾上腺素以及DAG类似物OAG激活Ca²⁺主要通过TRPC6通道进入，而ATP诱发Ca²⁺进入主要涉及TRPC1和TRPC4通道。

将各种TRPC成员归因于DAG-门控或SOC类型及其激活模式的文献存在很大的冲突和争议(40–42). 因此，彻底评估每个特定TRP在创造特定类型Ca方面的贡献²⁺在任何情况下都需要进入通道。到目前为止，我们自己关于LNCaP细胞系的数据仅表明TRPC1和“香草醛”TRP亚家族成员TRPV6主要参与SOC的形成(26)这与TRPC1在ATP诱导的储存依赖型钙中的作用密切一致²⁺上述条目。此外，TRPC1是最参与存储操作钙的通道之一²⁺一般入境(40). 另一个TRPC成员，TRPC4，我们也确定其对ATP诱导的、储存依赖型Ca起主要作用²⁺在SOCE和其他细胞模型中都显示了hPCE细胞的进入(41).

尽管已明确存在外源表达TRPC6的直接DAG-门控激活模式(42–44)，我们的研究首次确定内源性TRPC6是生理相关激动剂诱导钙的主要决定因素²⁺前列腺起源细胞中直接DAG门控机制的进入操作。此外，我们不仅揭示了TRPC6参与苯肾上腺素诱导的钙的生成²⁺hPCE细胞中的振荡，但也显示了该通道在增强α的促增殖作用中的可能作用₁-AR激动剂，因为长期接触苯肾上腺素会导致TRPC6过度表达。此外，促进增殖以应对α₁-AR的刺激可能不仅源于Ca的较高耦合效率²⁺NFAT激活的振荡，以及TRPC6与Ca机制的空间共定位²⁺-依赖性NFAT激活。

一般来说，对平滑肌细胞增殖活性中TRP成员的作用的研究最好。有趣的是，这些研究结果表明TRPC1和TRPC6都是促进肺血管平滑肌细胞增殖的重要决定因素(45, 46). 然而，潜在的机制似乎涉及到存储操作钙的增强²⁺仅包括两个TRPC通道。

潜在的临床意义。我们目前的研究以及上述最近的研究(10)揭示了α的新的、以前未曾预料到的临床效应₁-AR阻断在控制前列腺上皮细胞增殖中，可进一步用于良性和恶性前列腺的生长抑制。此外，因为我们已经确定了介导α₁-AR刺激的增殖促进，所有涉及的分子实体都可能成为治疗干预的合适靶点。对于TRPC6通道来说尤其如此，它决定了Ca的振荡模式²⁺偶联激动剂介导的α₁-AR刺激Ca²⁺-NFAT转录因子的依赖性激活，因为破坏这种模式将最终终止增殖基因的表达。

拨款支持：法国国立桑特医学研究所（Institute National de la Sante et de la Recherche Medicale）、法国国家控制癌症协会（Legue National Contre Cancer）、法国教育部（Ministe de l'Education Nationale）（Y.Shuba）。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，必须在此标记此物品广告根据《美国法典》第18卷第1734节，仅为了表明这一事实。

我们感谢Etienne Dewailly和Philippe Delcourt提供的技术支持。