摘要

在许多亚洲和非洲国家，肝细胞癌（HCC）是导致癌症死亡的主要原因。缺乏早期诊断工具是肝癌有效治疗的临床障碍之一。因此，迫切需要加强对HCC相关分子变化的了解，以制定诊断和治疗这种可怕疾病的新策略。虽然长链非编码RNA（lncRNA）的异常表达在功能上与某些癌症有关，但lncRNA在HCC中的表达谱和生物学相关性尚不清楚。肝癌（HULC）lncRNA高度上调与肝癌细胞增殖的调节有关。在这项研究中，我们证明HCC肿瘤中HULC的表达显著高于正常肝组织。在肿瘤组织中，HULC的高表达与Edmondson组织学分级或乙型肝炎（HBV）阳性状态呈正相关。此外，与健康对照组相比，HCC患者血浆中检测到HULC lncRNA的频率更高。在Edmondson分级较高或HBV+状态较高的患者血浆中观察到较高的HULC检出率。这些发现首次表明，HULC在血浆中的表达可作为一种无创性的有希望的新生物标志物，用于HCC的诊断和/或预后。

1.简介

在许多亚洲和非洲国家，肝细胞癌（HCC）是导致癌症死亡的主要原因[1,2]. 据估计，全球每年有662000人死于肝癌（“癌症”世界卫生组织），其中约一半发生在中国。尽管肝癌肿瘤体积小、生长缓慢，但通过积极手术可以成功治疗，但由于缺乏有效的早期诊断工具，患者往往会失去手术切除的机会，从而导致5年生存率非常低。因此，为了改善HCC的预后，开发特异、敏感的HCC诊断生物标志物至关重要。

非编码RNA（ncRNAs）由微RNA、小干扰RNA和各种类型的长非编码RNA组成。NcRNAs在包括癌症在内的许多疾病的发展和进展中起着重要的调节作用[三,4].

LncRNAs由200到10000多个核苷酸组成，由哺乳动物基因组大量转录[5,6]. 人们发现LncRNAs在广泛的人类疾病和障碍中失调，包括各种类型的癌症。例如，lncRNAs PCGEM[7]和DD3[8]在前列腺癌组织中过度表达，暗示这些lncRNA可能参与前列腺肿瘤的发生[9]. BC200 RNA过表达最近与乳腺癌的进展相关，并被认为是乳腺癌潜在的新分子标记物[10]. MALAT-1基因表达增加提示肺癌患者预后较差[11]. 总之，这些观察结果为lncRNA在肿瘤发展和进展中的潜在作用提供了证据和支持。

人类血浆或血清中的miRNAs在包括癌症在内的不同疾病中具有不同的表达特征。因此，血清miRNAs可以作为某些癌症类型的重要诊断生物标志物[12——15]例如结直肠癌、口腔癌和胰腺癌。然而，血浆或血清中lncRNA的表达尚未被研究其作为HCC诊断或预后的潜在新生物标志物的潜力。

肝癌高表达（HULC）是首次从肝癌特异性基因库中发现的一种新的mRNA-like lncRNA，在肝癌中显著上调[16]与肝癌的分子发病机制有关。据报道肝癌中lncRNA HULC的异常表达[17,18]，并提出了其作为诊断生物标记物的潜力[15,19]. 然而，尚未检测肝癌患者血浆中HULC的表达。在本研究中，我们验证了肝癌患者血浆中存在lncRNA HULC的假设，并可作为临床生物标记物用于促进肝癌的早期诊断。我们使用实时定量RT-PCR检测了HCC肿瘤组织和健康志愿者肝组织以及这两组匹配血浆中HULC的表达水平。我们的结果表明，HULC在HCC肿瘤组织和HCC患者血浆中显著上调。

2.材料和方法

2.1. 组织和血液样本

从郑州人民医院（中国郑州）采集了20名健康志愿者的肝组织样本和30名肝癌患者的肿瘤组织。健康志愿者没有HCC或HBV感染史，体检正常。参与研究的患者获得了书面知情同意书。新鲜组织样本在手术后30分钟内冷冻，并储存在液氮中直至使用。病理学家对每个HCC样本的组织切片进行审查和分类。慢性HBV感染定义为至少6个月内HBV表面抗原阳性，PCR检测到HBV DNA，肝脏活检发现HBV感染相容性结果。

在EDTA试管中采集的全血样本在4°C下以1200 g离心10分钟，以使血细胞旋转。将上清液转移到微型离心管中，并在4°C下12000 g离心10分钟，以完全去除细胞成分。然后仔细收集、校准血浆，并在−80°C下储存，直至使用。根据制造商的说明，使用Trizol（Invitrogen）从1mL血浆中提取总RNA。

2.2. 肝癌组织和血液中HULC的q-RT-PCR检测

在1μg总RNA使用PrimeScript RT试剂盒（日本志贺TaKaRa BIO）。RT反应中使用了随机六聚体引物。然后使用SYBR Premix DimerEraser试剂盒（日本志贺县TaKaRa）进行实时PCR。使用商用引物（日本志贺县TaKaRa）将GAPDH作为qPCR反应的看家基因进行评估。所用的HULC-qPCR引物为正向，5′-TCATGATGGAAATTGGAGCTT-3′；背面，5′-CTCTTCTGGCTTGCAGATTG-3′。根据制造商的说明，所有反应均在Bio-Rad CFX-96实时PCR系统（加利福尼亚州Hercules市Bio-Rad）上进行。为了确保扩增的准确性，我们纳入了一个不表达HULC的阴性对照细胞株HL-7702[20]和阳性对照细胞系Hep3B，其表达高水平的HULC[20]每次跑步时。在50 ng中制备1%、10%、50%和100%Hep3B cDNA负载的标准品/μL背景，用HL-7702 cDNA连续稀释Hep3B cDNA。使用系列稀释标准的结果绘制HULC表达的标准曲线。每个标准反应的放大效率被证实为本研究中所有cDNA样本的浓度均在该标准范围内。我们共同证实了HULC表达结果的准确性。将每个样品中HULC的表达水平标准化为内部对照GAPDH的表达水平。通过计算肿瘤样本与健康对照组中HULC表达的倍数变化方法。

2.3. 统计分析

各组之间的统计显著性由双尾Student’s-测试。使用单向方差分析结合bonferroni校正分析HULC表达与临床病理特征之间的相关性。所有统计分析均使用STATA 10.0（StataCorp LP，College Station，TX）进行。A类<0.05的值被认为是显著的。绘制受试者操作特征（ROC）曲线，以确定HULC的表达水平在肿瘤样本和健康对照样本之间的区分程度。

3.结果

3.1. 与正常肝组织相比，HCC组织中HULC-lncRNA表达上调

为了评估HULC的潜在临床应用价值，我们分析了其在肝癌组织和健康对照肝脏标本中的表达水平。首先，为了确定反应效率，使用Hep3B cDNA系列稀释液的qPCR结果创建标准曲线，作为HULC表达的阳性对照。证实了实时PCR的线性。接下来，使用受试者操作特征（ROC）分析来评估HULC表达是否适合区分肿瘤和对照样品。HULC曲线下总面积（AUC）为0.86（图1（a）)，这表明HULC具有足够的敏感性和特异性来区分肿瘤样品和对照样品。此外，检测了30例HCC肿瘤样本和20例健康对照肝组织样本中HULC的表达。结果表明，与正常肝组织相比，HCC组织中HULC的表达水平显著增加()（图1（b）).

（a）

（b）

（a）
（b）

图1 

HULC在HCC组织中上调。HCC组织和健康对照肝组织中HULC RNA表达的受体操作特征（ROC）曲线（a）和方框图（b）。（a） ROC曲线下面积为0.86，用于区分肝癌和健康对照。（b） 用qRT-PCR检测20例健康对照肝组织和30例肝癌组织中HULC的表达。使用方法。方框的上限和下限以及方框内的线条分别表示第75个百分位和第25个百分位数以及中位数。上下横条分别表示第90个和第10个百分位。

3.2. HULC lncRNA表达与HCC分级相关

为了研究HULC-lncRNA在HCC肿瘤组织中的表达水平是否与疾病严重程度相关，我们根据Edmondson分级分析了HCC组织中HULC的表达。结果显示，从分化良好（Edmondson分级I-II）到未分化病变（Edmonsson分级III-IV）的HCC组织样本中HULC表达逐渐上调（图2（a）).

（a）

（b）

（a）
（b）

图2 

HULC lncRNA表达与HCC Edmondson分级和HBV状态相关。（a） 不同Edmondson分级的正常肝组织和肝癌组织中HULC相对水平的比较。（b） HBV−和HBV+患者正常肝组织和HCC组织中HULC相对水平的比较。

慢性HBV感染是HCC的主要病因，多功能癌蛋白乙型肝炎病毒X（HBx）在HCC的发生发展中起着至关重要的作用[21]. HBx介导的HULC上调通过降低p18促进肝癌细胞增殖[22]. 这些证据促使我们调查HCC患者中HULC表达与HBV感染状态之间是否存在任何关联。我们比较了HBV阳性和阴性HCC患者中HULC-lncRNA的表达。HCC组织中HULC表达与HBV状态呈正相关（图2（b）). HBV+患者HCC组织样本中HULC的表达高于HBV-患者（图2（b）). 进一步对肝癌患者HULC表达与各种临床病理参数的相关性进行统计学分析（表1). 不同Edmondson组织学分级或不同HBV状态患者的中位HULC表达水平不同。统计分析显示，HULC表达水平与HCC组织学分级显著正相关()（表1). HBV阳性组和阴性组之间的HULC表达也存在统计差异()（表1).

3.3. 肝癌患者血浆中HULC-lncRNA的检测

HCC患者外周血细胞中检测到HULC RNA[16]. 因此，我们研究了HULC作为肝癌诊断新生物标志物的潜力。用qRT-PCR检测健康志愿者血浆中HULC的表达水平()和肝癌患者()从谁那里采集组织样本。63%（19/30）的HCC患者检测到HULC，远高于健康对照组（10%，2/20）（表2和三). 在HCC患者中，HULC检测频率随Edmondson分级而增加（表2). 埃德蒙森I-II级、II-III级和III-IV级的检测率分别为14%、62%和100%（表2). HULC在HBV+HCC患者（90%）血浆中的检出率高于HBV−患者（25%）（表三). 这些观察结果表明，HULC的存在是HCC及其进展的一个迹象。因此，数据支持HULC-lncRNA作为肝癌诊断和预后的潜在生物标志物的临床应用。

4.讨论

LncRNAs是一类长度超过200个核苷酸的新型非编码RNA分子[23]. 据报道，许多lncRNA可控制转录改变，这意味着正常细胞和癌细胞之间lncRNA谱的差异可能在癌症进展中起调节作用，而不是癌症转化的次要影响[24]. LncRNA表达与癌症的发展和进展密切相关[24]. 因此，lncRNAs在癌症中的差异表达可用于促进癌症诊断、发现潜在治疗靶点和改善预后。在这项研究中，我们证明与健康肝组织相比，lncRNA HULC在HCC肿瘤组织中过度表达。在HCC患者中，Edmondson分级较高或HBV阳性的患者HULC表达明显较高。这些结果表明，HULC的表达与HCC的进展呈正相关。

据广泛报道，在癌症患者的血液、痰、尿和其他生物液体中可以检测到癌症特异性miRNAs。因此，miRNAs被认为是癌症诊断和预后的潜在生物标志物。同样，lncRNAs已经证明作为特定癌症的基于流体的标记物是有用的。血清和血浆中含有临床鉴别的蛋白质组和转录组生物标记物，可以很容易地评估其临床应用价值。在目前的研究中，在HCC患者的血浆中检测到HULC，并且在Edmondson分级较高或HBV阳性的患者血浆中发现较高的检测率。

我们的数据表明，肝癌中HULC的表达可能与肿瘤的侵袭性和进展有关。虽然在前瞻性随访研究中，HULC表达的预后能力显然必须通过纵向分析来证实，但我们的结果是朝着确定HULC作为HCC预后指标的实用性迈出的重要一步。

总之，我们已经表明，与健康对照组相比，HCC患者的组织和血浆中HULC的表达存在差异。这些发现首次表明，血浆中HULC的表达可作为肝癌的一种新的快速诊断和/或预后生物标志物。

利益冲突

任何作者都没有利益冲突。

鸣谢

本研究得到了上海市卫生局研究经费（20114300）的支持。

补充资料