生物成像中染色分析中两个随机集的独立性检验

摘要

彩色化旨在通过量化荧光显微镜中获得的两个通道之间的共现性和相关性来表征两个荧光标记生物分子之间的空间关联。共定位表现为两个通道之间的重叠程度或红色和绿色图像的重叠，黄色区域表示分子的共定位。这一问题仍然是衍射显微镜领域的一个悬而未决的问题，并随着超分辨率成像技术的出现提出了新的挑战，超分辨率成像是2014年诺贝尔化学奖授予的一种显微技术。我们为地理定位系统提出了GcoPS，这是一种利用标记分子的随机集结构提供明确测试程序的原始方法。我们的模拟研究表明，GcoPS在不利情况下（噪声、不规则形状的荧光图案和不同的光学分辨率）明显优于最佳竞争方法。GcoPS速度也快得多，这是超分辨率成像中面对海量数据的决定性优势。我们在两个生物真实数据集上演示了GcoPS的性能，这两个数据集分别是通过常规衍射显微镜技术和超分辨率技术获得的。

1引言

1.1生物挑战

分子相互作用的表征是定量显微术中的一个主要挑战。在活细胞中，这个问题通常通过用光谱上不同的荧光团荧光标记两种感兴趣的分子，并同时成像来解决。这个过程提供了同一个细胞的两幅图像，每幅图像都描绘了一个不同的荧光标记分子，都被衍射、噪声和讨厌的背景所破坏。如图所示1描绘了一个细胞，其中红色通道中含有Langerin蛋白，绿色通道中含有Rab11蛋白(布朗格等., 2014). 请注意，本文电子版中的数字是彩色的，任何提及颜色的地方都指的是该版本。在图的另一个示例中2脑源性神经营养因子（BDNF）蛋白呈绿色，突触前囊泡标记物呈紫色(安德烈斯卡等., 2014). 这两个数据集是通过不同的显微镜技术获得的：图中图像的三维多角度全内反射荧光显微镜（TIRFM）1，以及图中图像的直接随机光学重建显微镜（dSTORM）2。这些数据将在中进一步分析第4节支持信息中提供了实验的详细信息。

细胞内潜在的蛋白质相互作用取决于显微镜分辨率极限下的共定位程度，或者换句话说，取决于在同一位置或非常接近的位置共同保护的相互作用蛋白质的比例(曼德斯等., 1993;博尔特和科德利尔，2006年). 配体化通常与共组分化相对应，意味着两个或多个分子结合到细胞中的相同结构或结构域。因此，共定域分析是分子相互作用分析中的关键步骤。通过荧光显微镜观察细胞中两种类型的蛋白质，主要问题是共定位是否发生，是在整个细胞中还是仅在细胞的某些亚区中发生，以及细胞内共定位的空间量化。在生物成像中可用的2D、3D和3D+时间数据越来越多的情况下，需要正确解决这些问题。然而，就目前而言，即使对于通过传统衍射限制显微镜技术获得的2D图像，共定位分析也没有明确的解决方案。

此外，超分辨率显微镜技术的出现，如结构照明显微镜（SIM）、直接随机光学重建显微镜（dSTORM）、光激活定位显微镜（PALM）和受激发射损耗（STED），为共定域研究提出了补充挑战。这些技术的开发人员埃里克·贝齐格（Eric Betzig）、威廉·莫纳（William Moerner）和斯特凡·赫尔（Stefan Hell）因“超分辨荧光显微镜的开发”获得了2014年诺贝尔化学奖，这些技术可以获得高分辨率图像。图中的数据说明了这一点2通过dSTORM获得，与图1其中使用了更传统的TIRFM。但是这些高分辨率图像的尺寸变得非常大。彩色化方法必须有效地处理这些非常大的数据量。现在，一种更常见的方法是分析两种不同的显微镜技术获得的两个通道：传统衍射限制技术（共焦、TIRFM等）和超分辨率技术（如SIM、dSTORM等）。这就导致了必须在两个分辨率截然不同的通道之间分析同位化的情况（实际上是2-5个因子）。

1.2统计公式和现有方法

从统计角度来看，检测细胞中两种蛋白质之间的共定位相当于测试荧光显微镜获得的两个图像是否相关。乍一看，这可能是一个基本的简单统计问题。然而，感兴趣的对象，即每张图像中的蛋白质，并没有被清楚地识别出来。数据是同一个细胞的两幅图像，被噪声、干扰背景和衍射所破坏。在撰写的评审中邓恩等. (2011)作者总结道：“同位化数据的显著性检验问题目前还没有简单的答案。”

在文献中，通常会考虑两类不同的共同定位方法（见博尔特和科德利尔，2006年;邓恩等., 2011综述）：基于强度的方法和基于对象的方法。前者分析图像内容并聚焦于荧光信号，而后者首先检测感兴趣的对象，然后通过空间点过程统计分析它们的联合重划分。

常用的基于强度的技术是简单地计算两幅图像之间的皮尔逊相关系数。然而，该系数对高强度背景很敏感，如果图像的信噪比或比例不相似，则会产生误解。由于这些原因，并且每个图像都是空间自相关的，所以测试皮尔逊相关性的重要性并不简单。广泛使用的解决方案(成本等., 2004)包括多次对一个信道进行块重采样，以便通过蒙特卡罗模拟无相关零假设下皮尔逊系数的分布。此技术受到用于重采样的像素块大小的选择的限制，这严重影响其结果。作为之前工作的总结(拉米雷斯等., 2010;邓恩等., 2011)经我们的模拟研究证实，该测试程序适用于成本等. (2004)导致过多的假阳性同位情况。由于蒙特卡罗步骤，它还面临着较高的计算成本，这使得这种方法不适合于现代大数据。生物成像界已经从流行的Mander系数中提出了基于强度的替代系数(曼德斯等., 1993)到更复杂的(科莫等., 2008;拉米雷斯等., 2010;吴等., 2010). 这些系数受到与皮尔逊系数相同的基本限制，即对噪声和干扰背景的敏感性，需要进行大量模拟来测试其重要性。

在基于对象的方法中，在每个图像中应用分割过程来检测细胞中与感兴趣的蛋白质相对应的斑点（或区域）。然后将检测到的点简化为点（其中心），提供两个点模式，并通过空间点过程统计分析两个点图案之间的相互作用。在最后一步中，假设两个点模式是平稳的，最实用的策略是分析⁠里普利的十字架-两个点模式之间的函数。大致上，给一分属于点图案1，是点模式2中位于以为中心的球上的预期点数带半径⁠.如果两个点模式是独立的，简单地说就是球的体积和半径(Möller和Waagepetersen，2004年). 在某些条件下，估计值的分布可以在独立性的零假设下渐近地表征（在观测的空间域足够大的意义上），并且利用这一点构造了一个在拉加什等. (2015).英寸谢尔曼等. (2011)，分析密切相关的交叉对相关函数，而不是⁠，但未考虑显著性测试程序。另一种方法是，在赫尔穆斯等. (2010)对两个点模式之间的交互进行建模。然后通过蒙特卡罗模拟测试吉布斯相互作用的重要性。

与基于强度的技术相比，基于对象的方法对噪声和背景的敏感性更低，尽管识别对象的初始分割步骤可能很关键。将每个图像转换为点模式特别适合感兴趣的对象可以与点（通常是小球）相当相似的图像。得益于成熟的空间点处理技术，统计分析变得严谨。然而，这种变换不适用于存在大型或各向异性形状的对象，在这种情况下，将每个对象缩减为一个点会造成信息的急剧丢失。出于同样的原因，这些方法不能应用于仅包含少量对象的单元的子区域，在这种情况下，相关的点模式将过于稀疏，无法进行分析。此外，计算成本随着检测点的数量增加而增加，并且在涉及大量对象的高分辨率图像中可能变得难以实现。

1.3 GcoPS

我们介绍了一种新的共定位方法，详细内容见第2节我们将其命名为GcoPS，用于地理定位系统。其基本思想是对每幅图像进行初步分割后得到的检测点组成的两个随机集进行分析。因此，这第一步与前面描述的基于对象的方法类似。然而，我们并没有将分割的图像简化为点模式，而是保持原样：两个二值图像，每个图像代表一组随机的斑点。对这些随机集的分析可以看作是一种基于强度的方法，因为它主要是测试两个二值图像之间的皮尔逊相关性的重要性（参见第2节). 从这个角度来看，GcoPS可以被视为基于对象的方法和基于强度的方法之间的折衷。此外，与以前基于强度的方法不同，我们的测试过程利用了一个封闭的公式，不需要蒙特卡罗模拟。

GcoPS已在Icy软件中实现(德肖蒙特等., 2012)，一个基于Java的生物图像信息学开放平台，可作为一个免费下载模块（更多详细信息，请访问http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/GcoPS). 尽管如此，本文的支持信息中也提供了C++代码。

论文的其余部分组织如下。第2节描述了该方法的数学基础，并解释了为实现GcoPS所做的实际选择。第3节总结了我们的模拟研究结果（详见支持信息），与最常用的基于强度的方法相比，GcoPS具有良好的性能成本等. (2004)以及基于对象的方法拉加什等. (2015)利用Ripley的十字架功能。在第4节，我们将GcoPS应用于分析第1.1节结束讨论见第5节最后，本文的支持信息可在威利在线图书馆的生物识别网站上获得，其中包含我们贡献的最技术方面、模拟研究的详细结果、数据准备的特殊性和支持信息图。

2方法

2.1数学基础

GcoPS对二进制图像对进行测试，如本节所述。通过对输入的荧光图像进行分割，得到两幅二值图像。这会将像素集拆分为背景集和前景集，两者都应该是非空的。该初步步骤的敏感性分析如下第3节，其中GcoPS被视为对分割算法的选择具有鲁棒性。

在下文中，我们将两个二值图像的两个前景集视为通过像素化图像观察到的两个随机集的实现。我们指的是邱等. (2013)关于随机集的基本概念。正式地，让和是两个随机集⁠，其中代表尺寸（通常或在我们的例子中）。直觉上，如果此图像在无限晶格上受支持，则将是第一个图像的前景集⁠和类似的⁠.我们让是这些随机集的观察区域，即观察图像的感兴趣区域。索引表示中元素（像素或体素）的数量⁠或者换句话说，它的基数。例如，当⁠，如果感兴趣区域是大小为的整个观测图像像素，就是格子具有像素。总的来说，感兴趣的地区是观察到的图像的子区域（例如，参见图1). 因此，观察到的两个前景集是和⁠。在下文中，我们制定了一个程序来测试和是否独立（共定位的情况），基于对和以及何时⁠.

让我们考虑一下，对于一般给定点⁠，概率

如果和是两个独立的随机集，我们有⁠.一种自然的经验测量方法，用于衡量和因此是

哪里

哪里表示有限子集中的元素数属于⁠。请注意是感兴趣区域中“红色”像素的平均数，而是“绿色”像素的平均数是“黄色”像素的平均数（即“绿色”和“红色”）。以下命题是我们测试过程的基本结果。它提供了一个中心极限定理什么时候和都是独立的。

为此，我们假设和是固定集。表示方式翻译按向量⁠，这意味着与对于任何⁠，对于⁠。我们表示为和的自方差函数和⁠分别是。具体来说，表示为指示器功能等于1，如果否则为0，为任何以及任何通过

此表达式不依赖于通过平稳性但涉及到两个点相隔的概率属于⁠特别是，⁠。的公式都是一样的被替换为⁠、和通过⁠.如果我们进一步假设和是旋转不变的，那么和是各向同性的，只依赖于范数⁠我们的程序只假设平稳性，但不一定假设各向同性，这使得它适用于生物成像中观察到的分子不具有各向同性形状的情况。协方差函数可以由经验自方差函数估计和基于对和⁠。对于⁠，让⁠。的标准表达式由提供

如果和⁠; 否则，请参见，例如，克雷西语（1991）。此估计值很好地近似于无论何时不太小。稳健或锥形估计也可以用来减少偏差(克雷西，1991年;盖恩，1995年). 从理论上看，我们可以使用（和类似的⁠)在提案1中，前提是所有提案都一致⁠尤其是三根据我们的假设(盖恩，1995年，定理4.1.1）。

为了说明我们的中心极限定理，我们需要假设观测域是一个有规律的有限子集⁠，这意味着作为哪里表示的边界⁠。该假设不具有限制性，并且在以下情况下成立：，包含边长为的方形晶格和作为⁠.

此外，我们假设和是两个-相依平稳随机集。我们记得是-取决于事件和在任何时候都是独立的和相隔距离大于⁠。在这种情况下，如果然后和⁠该理论框架保证了和⁠，但实际上不需要知道（见备注2）。这种假设可能会减弱为强混合条件，如博尔特豪森（1982），但代价是我们宁愿略去更多的技术性内容。这相当于将收敛速度控制为属于和什么时候⁠尽管如此，-依赖性是生物成像应用中的一个合理假设，它提供了深刻的结果。例如，如果和是半径有界的布尔芽粒模型(格策等., 1995).

在这些假设下，我们在以下命题中证明了等于具有

最后一个简化来自-我们所做的相关假设。我们的测试数据终于出来了

哪里估计并且是为通过

注意，如果和是一致的估计量，是的一致估计量无论何时⁠。我们现在可以陈述我们的主要结果。其证明推迟至支持信息。

提议1。让和是两个-相关平稳随机集具有自动方差函数和⁠分别满足哪里定义于4.假设是的正则有限子集具有基数还有那个和是一致的估计和对于任何⁠.让由定义5具有⁠.如果和是独立的，那么趋向于标准正态变量的分布⁠.

备注1。统计数据可以看作是两个二值图像之间经验皮尔逊相关性的标准化版本和⁠从这个角度来看，我们的方法与成本法有一些相似之处(成本等., 2004)，其中通过蒙特卡罗模拟测试两个原始图像之间的相关性。两个重要的区别是，我们考虑二值图像而不是原始图像，这限制了噪声和背景影响，并且我们知道⁠，避免了蒙特卡洛模拟。

备注2。我们假设和是-依赖但不需要知道。这个假设是捕获随机集的空间弱依赖性的一种方便方法。在弱依赖性的更一般的情况下，虽然证明需要更多的技术性，但陈述将是类似的。一个关键点是必须是一致的估计量⁠一般来说，正确选择取决于⁠具体来说，需要倾向于但慢于⁠.此选项对应于计量经济学中异方差和自相关一致性估计量的带宽（或截断参数）的选择（例如，请参见，安德鲁斯，1991年). 对于-相依随机集，就足够了。选择的实用方法⁠，适用于任何弱相依随机集，不依赖于-相关假设。

2.2 GcoPS的实施

共定位试验程序归根结底，是对两个国家之间独立性的测试和⁠，这是从命题1直接推导出来的：在渐近水平上拒绝独立性的零假设如果哪里表示上部标准正态分布的分位数。相应的-值为

哪里表示标准正态分布的累积分布函数。如果替代假设的焦点是更具体的共定位（相对反定位），也就是说，两者之间的正（相对负）依赖性，那么这种双边检验可以修改为单边检验和⁠而不是一般意义上的依赖。然后在渐近水平上使用更强大的程序包括当（分别为。⁠)，对应于（分别为。⁠).

在Icy的GcoPS模块和下一节的实验中，我们做了以下实现选择。经验协方差和通过对每个图像进行快速傅里叶变换获得。关于截断参数在里面⁠，我们选择较大的值这样两者都可以和⁠换句话说，是经验相关性的最大范围和超过此值，相关性小于0.1。超出此范围⁠，我们查看令人讨厌的噪音。与更大的截断选择相比，这种截断选择还具有加快计算的优点⁠最后，⁠,⁠、和直接从二值图像的平均值中获得和⁠和他们的产品。这种实现确保了非常低的计算成本，如中讨论的结果所证明的那样第3节并在支持信息中报告。

3合成数据集评估

在本节中，我们评估了GcoPS在不利和噪声环境下对2D和3D数据集的性能，并将其与竞争性Costes方法进行了比较(成本等., 2004)，生物成像中最常用的基于强度的方法，以及拉加什等. (2015)这取决于对里普利十字架的分析-功能。我们的模拟结果详见支持信息。总之，我们评估了以下方面：

• (1)

  2D、2D+时间和3D数据中的计算时间。

• (2)

  模拟2D图像上的性能可能受到噪声和空间偏移的影响。

• (3)

  对图像分割的敏感性。

• (4)

  对物体形状和比例的敏感度。

• (5)

  每个图像中存在不同光学分辨率时的性能。

• (6)

  模拟3D图像上的性能。

图三显示了我们用每种方法评估的图像对的示例。该图显示了所考虑情况的多样性。注意，显示的图像对来自独立的通道，但我们显然也考虑了每种情况下的相关通道。在每种情况下，都模拟了1000个图像对来评估这些方法。有关图像生成器的详细信息、更多图片和详细评论，请参阅支持信息。

简言之，我们的模拟研究表明，Costes方法的主要缺点是由于其蒙特卡罗步骤而导致的计算时间，这对于2D+时间和3D图像来说可能很麻烦，以及太多的假阳性决策（平均12%，高达25%，而不是当测试水平固定为0.05时预期的5%）。另一方面，基于对象的方法的主要缺点是拉加什等. (2015)缺乏对共定位的敏感性。这一点在存在大型物体时明显出现（如图中行最右边的图三)将每个对象缩减为一个点是不合适的。该方法对初始分割步骤也非常敏感。特别是，它完全无法检测过度分割图像的同位化（如图的右上角图所示三). 反过来，GcoPS也没有上述缺点：（a）速度快；（b） 它很好地控制了假阳性的概率；（c） 它对共定位非常敏感；并且（d）它对分割、对象的形状和大小以及每个通道中可能的不同光学分辨率都是鲁棒的。

GcoPS在大对象中的良好性能的一个重要结果是，该方法可以应用于图像中的小窗口。事实上，将图像划分为子区域就像放大对象一样，GcoPS处理得很好。这为准确定位共定位提供了可能性。此外，GcoPS在每个图像中存在不同光学分辨率时的鲁棒性（如图的最左行所示三)结果表明，GcoPS还能够有效地处理使用不同显微镜技术检测每种分子的图像。

4在真实生物成像中的应用

4.1 3d-TIRFM中Langerin和Rab11a的时空配色

在第一个实验中，使用3D-TIRFM进行了时间采集(Boulanger公司等., 2014)使用转染Langerin-m-Cherry和Rab11a-GFP的野生型RPE1细胞，得到35帧大小等于像素。支持信息中提供了数据准备的详细信息。图1描述了当时获得的两幅图像（即第一帧）以及它们的叠加，一旦沿着-轴。图中再次显示了相同的叠加4A级.测试统计值无论序列中考虑的帧是什么，在整个单元格上计算的命题1（我们也可以将其命名为共定位得分）的值都非常大（大约28），表明两个通道之间存在明显的共定位。然后我们在当时处理了一个密集的同位映射（见图4B类)，通过计算同位化得分窗口大小的中等平面上每25个像素体素。共定域分数的空间密度是通过应用全局带宽等于5的高斯核密度方法计算的。这种表征有利于区分不同程度的共定域，因为共定域越大，共定域得分越高。

最后，我们将GcoPS逐帧应用于整个Langerin-m-Cherry/Rab11a-GFP图像对序列，以获得共定位得分的分布⁠接下来，我们将帧在两个通道之间移动，并将Langerin-m-Cherry作为参考，应用GcoPS将帧从–20移动到+20。图中报告了每个时间偏移的平均共定位得分及其分布4摄氏度。与负时间偏移相比，正时间偏移的同位化分数斜率更陡，这表明在全球范围内，Rab11a在Langerin之前可见，这与之前的观察结果一致(吉东等., 2012;布朗格等., 2014).

4.2 dSTORM中BDNF蛋白和vGlut的克隆化

在第二个实验中，我们在用dSTORM获取的图像上评估了BDNF蛋白和突触前囊泡标记物vGlut之间的共定位(安德烈斯卡等., 2014)（见图2). 虽然使用标准斑点检测器可以直接识别BDNF蛋白，但由于这些标记物不符合规则形状，因此vGlut的分割更加困难。因此，我们通过用三个不同的阈值对图像进行阈值化来执行三个不同的分割，从而得到支持信息中所示的三个二进制图像。这个-使用GcoPS获得的值非常低(⁠ = 0）对于vGlut的三个分段，结果与先前发表的研究一致(安德列斯卡等., 2014)其中BDNF蛋白和vGlut之间的共定位被揭示。基于对象的方法拉加什等. (2015)需要使用高阈值分割vGlut以获得低阈值-价值(⁠ = .005). 阈值较低的分段会产生较大的对象，导致此方法失败(⁠ = .532和.061）。基于强度的方法成本等. (2004)提供-当置换步骤的块大小固定为时，值接近0或或 在两个通道中。这一结果与GcoPS的结论一致。然而，Costes方法需要大约3分钟来处理这对图像，而GcoPS只需要9秒。尽管如此，可以公平地回忆一下，所有这些方法都假设蛋白质在两个通道中的分布是平稳的。这个假设在这里是不满足的，必须仔细考虑前面的结论。

然后，我们将GcoPS应用于大小的窗口像素随机定位在包含分割对象的图像的子区域中，以识别共定位区域（参见图底部的示例5). 图中，GcoPS确定的共定位区域表示为白色圆圈（测试窗口的中心）5。这里选择的窗口大小足够小，可以详细分析本地交互，而对象的大小足够大，可以安全地应用我们的测试程序。请注意，与整个图像中的分布不同，可以更合理地认为这些局部窗口中的蛋白质分布是稳定的。基于在随机定位的窗口上进行的测试，这种共定位点击表示法是图中所示密集共定位图的最快替代方法4，这需要在所有本地窗口上处理测试过程。Icy的GcoPS模块包含两种分析局部相互作用的可能性。

5讨论

我们开发了GcoPS，这是一种新颖、快速和稳健的方法，用于测试和量化分子之间的相互作用。给定一对通过分割输入荧光图像获得的二值图像，GcoPS测试它们在整个图像尺度和图像子区域中是否独立。这个测试过程利用了这样一个事实，即这些二值图像可以被视为随机集的实现。

GcoPS可以被视为基于对象的方法和基于强度的方法之间的折衷。如中总结的模拟研究所示第3节支持信息中详细介绍了这两种方法的优点，同时避免了它们的缺点。实际上，GcoPS对噪声和干扰背景具有鲁棒性，继承了基于对象方法的优点。但是，由于对象不是简单地简化为点，GcoPS适用于任何类型的对象形状和大小。出于同样的原因，与仅基于几个点的点模式方法相比，在细胞的小分区测试共定位更有效。此属性为有效定位细胞内标记之间的共定位提供了可能性。GcoPS还能够评估大对象和小点之间的共定位，如在复合TIRF-PALM实验中。最后，由于随机集的分析归结为二值图像的分析，与空间点处理统计不同，GcoPS非常快速，不依赖于每张图像中的对象数。

一个自然的问题可能是该方法对初步分割步骤的敏感性。事实上，GcoPS对虚假孤立点的存在并不敏感，因为这些孤立点通常是非常小的物体，相对于整个检测到的随机集而言，其体积可以忽略不计。这与基于点的方法形成了对比，对于这种方法，每个伪点的计数与单元中任何其他检测到的对象的计数一样多，并且会错误地影响统计分析。因此，如果任何分割算法能够对标记分子进行生物上合理的分割，则可以使用该算法。我们的仿真研究实际上证实了GcoPS对于分割算法参数的选择是相当稳健的。

对于GcoPS的实际实现，重要的是确定测试窗口的大小与窗口中对象的大小和数量之间的比率。理论上，该比率应尽可能大，以便GcoPS共定位得分按标准高斯定律分布（见命题1）。控制收敛到高斯分布，或者更确切地说，不控制这种收敛，是几乎所有测试过程中的一个常见问题。然而，当对象相对于窗口的大小非常大时，如图中行最右边的图所示三GcoPS仍然表现出令人满意的性能，证明了它对实际图像的小窗口中的共定位检测具有很强的鲁棒性。另一方面，GcoPS（以及其他竞争方法）也假设测试窗口内对象分布的平稳性。这个假设在小窗口中比在大窗口中更容易接受，如第4.2节这句话证实了使用在小窗口中仍然有效的程序（如GcoPS）的重要性。为了安全起见，我们最后建议在比对象平均大小至少大五倍的窗口中使用GcoPS。这保证了可以使用最小的荧光信息来评估共定位，同时允许考虑小的子窗口。

致谢

我们感谢Jean Salamero、Markus Sauer、Soeren Doose、Sarah Aufmolk、Perrine Paul-Gilloteaux和Fabrice Cordelie's在实验方面的帮助以及在手稿准备过程中的有益见解。

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