为了深入了解某些第二位点抑制突变拯救肿瘤抑制蛋白p53大量癌症突变功能的机制，我们测定了四种p53核心域变体的X射线晶体结构。其中包括一个致癌突变体V157F、两个单位点抑制突变体N235K和N239Y，以及被拯救的癌症突变体V157/N235K/N239Y。V157F突变用疏水核心链S4内的较大疏水性苯丙氨酸替代较小的疏水性缬氨酸。这种癌症突变株的结构在p53核心结构域的整体折叠中没有显示出明显的结构变化，只是蛋白质疏水核心内的侧链发生了轻微的重排。根据生化分析，这些小的局部扰动导致蛋白质不稳定，使自由能增加3.6 kcal-mol−1（15.1千焦摩尔−1). 进一步的生物化学证据表明，每一个抑制突变N235K或N239Y单独作用于恢复V157F的热力学稳定性，两者结合起来比单独作用更有效。在允许温度下评估时，发现所有获救突变体都具有野生型DNA结合活性，因此指出热力学稳定性是关键的潜在变量。有趣的是，热力学分析表明，虽然N239Y证明野生型p53核心结构域稳定，但N235K不稳定。这些观察结果表明了不同的救援结构机制。在N235K和救出的癌症突变结构中发现Lys235和Glu198之间的一个新的盐桥，这表明救出机制依赖于稳定β-三明治支架。另一方面，取代N239Y在该酪氨酸的芳香环和相邻的Leu137之间创造了有利的疏水接触。令人惊讶的是，与野生型p53相比，被拯救的癌症突变体显示出比仅癌症突变体更大的结构偏差。这些抑制突变似乎通过产生新的稳定核心结构域的结构域内相互作用来拯救p53功能，从而补偿失稳的V157F突变。
