G9a/GLP使低氧诱导因子-1α甲基化抑制HIF-1转录活性和细胞迁移

摘要

低氧诱导因子1（HIF-1）是低氧反应的主要转录调节因子，其转录活性对癌细胞的迁移至关重要。在这里，我们为调节HIF-1转录活性和HIF-1依赖性胶质母细胞瘤细胞迁移的新表观遗传机制提供证据。赖氨酸甲基转移酶G9a和GLP直接与HIF-1（HIF-1α）的α亚基结合，并催化HIF-1在赖氨酸（K）674下的单甲基化和双甲基化在体外和体内K674甲基化抑制HIF-1转录活性及其下游靶基因的表达PTGS1、NDNF、SLC6A3、和林肯01132在人类胶质母细胞瘤U251MG细胞中。K674甲基化对HIF-1的抑制是由于HIF-1α反式激活域功能降低，而不是HIF-1蛋白降解增加或HIF-1与缺氧反应元件结合受损。K674甲基化显著降低低氧条件下U251MG细胞的HIF-1依赖性迁移。重要的是，我们发现胶质母细胞瘤中G9a被缺氧下调，这与PTGS1型胶质母细胞瘤患者的表达和生存。因此，我们的发现揭示了低氧诱导的负反馈机制，该机制维持人类胶质母细胞瘤中HIF-1的高活性和细胞流动性。

简介

缺氧诱导因子1（HIF-1），由O组成₂-调节HIF-1α亚单位和组成性表达的HIF-1β亚单位是后生动物对氧可用性降低的转录反应的主要调节器(1). HIF-1反式激活数百个下游靶基因，其蛋白质产物控制癌症生物学的许多方面，包括血管生成、代谢、pH稳态、干细胞多能性、免疫逃避和细胞迁移/侵袭(2). 因此，HIF-1的转录活性对癌症的发展至关重要。

HIF-1α蛋白与多种翻译后修饰紧密结合，在调节HIF-1转录活性中起关键作用。泛素化是HIF-1转录活性间接调节的最佳研究机制(三,4). 在氧合良好的细胞中，HIF-1α通过脯氨酸羟化酶在脯氨酸402和564上羟基化(5–7). 羟化脯氨酸残基是von Hippel-Lindau（VHL）/Cullin-2/Celongin-B/C泛素E3连接酶复合物的对接位点，它介导HIF-1α泛素化和随后的蛋白酶体降解(7,8). 我们以前的研究表明，泛素E3连接酶CHIP的HIF-1α泛素化介导VHL非依赖性HIF-1β蛋白的衰变，并在长时间缺氧条件下抑制HIF-1转录活性(9). 其他翻译后修饰，如乙酰化和磷酸化，影响HIF-1α泛素化途径，改变HIF-1β蛋白的稳定性和活化(10,11). HIF-1α在赖氨酸（K）674处由乙酰转移酶p300/CBP相关因子（PCAF）乙酰化，并由脱乙酰酶Sirtuin 1脱乙酰化(12). Sirtuin 2还可以使HIF-1α的K709去乙酰化，增加HIF-1的泛素化和降解，从而抑制HIF-1转录活性(13). 最近的研究已经确定，通过SET7/9，K32的单甲基化（me1）和HIF-1α的K391的二甲基化（me2）被赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）抵消(14–16). 尽管SET7/9降低HIF-1转录活性，其潜在机制仍存在争议(14,15). 然而，大多数研究都关注翻译后修饰在HIF-1α蛋白稳定性中的作用。然而，赖氨酸甲基化是否发生在HIF-1α的反式激活域以直接调节癌细胞中HIF-1的转录活性，目前尚不清楚。

赖氨酸甲基转移酶G9a是Suv39h家族的成员，通过诱导组蛋白H3（H3K9）上K9的甲基化来介导基因沉默(17). 大量基因被G9a抑制，导致对增殖、自噬、上皮-间质转化和癌症发展的影响(18–20). 除了甲基化组蛋白外，G9a还甲基化非组蛋白，包括p53、WIZ、CDYL1、ACINUS、Reptin、Pontin和自身(21–23). G9a-甲基化的Pontin和Reptin对HIF-1活性具有不同的作用(22,23). 甲基化的Pontin通过增加乳腺癌细胞中p300的募集来刺激HIF-1转录活性，而Reptin甲基化抑制HIF-1的转录活性(22,23). 最近的一项研究发现，G9a蛋白通过低氧稳定并介导低氧诱导的乳腺癌细胞转录抑制(24). 然而，G9a在HIF-1转录活性中的确切作用尚不清楚。

在本研究中，我们发现G9a及其副产物G9a-like蛋白（GLP）与HIF-1α相互作用，并直接催化HIF-1的K674me1/2在体外在人类细胞中。G9a/GLP介导的K674甲基化降低了多形性胶质母细胞瘤（GBM）细胞中HIF-1转录活性和HIF-1下游靶基因子集的表达，导致GBM细胞迁移受到抑制。G9a在慢性缺氧的GBM细胞和人类GBM组织中下调，其表达与HIF-1靶基因表达以及GBM患者的临床结果呈负相关。这些发现共同揭示了GBM中HIF-1转录活性的新负反馈机制。

材料和方法

质体构筑

分别从FLAG-G9a和FLAG-G9（H1113K）质粒中通过PCR扩增出人全长G9a及其催化死亡突变体（H1113K）cDNA，并将其亚克隆到pcDNA3.1-V5-His载体（Invitrogen）或慢病毒cFugw-FLAG载体中。通过PCR从FLAG-HIF-1α质粒中扩增出人HIF-1亚结构域cDNA，并将其亚克隆到pGex-6P-1（GE Healthcare）中。将全长HIF-1αcDNA亚克隆到慢病毒cFugw-FLAG载体中。通过定点突变PCR产生HIF-1α突变体（K625R、K629R、K636R、K649R、K674R和K674Q）。通过在线CRISPR设计程序设计人HIF-1α、HIF-2α、G9a和GLP sgRNAs(http://crispr.mit.edu)，退火并克隆到lentCRISPRv2载体（Addgene#52961）。sgRNA寡核苷酸序列列于补充表S1.pSG5-GLP-HA是程晓东（UT MD Anderson癌症中心）赠送的礼物。其他质粒如前所述(25,26). 所有质粒均经DNA测序证实。

细胞培养、转染和缺氧

将HeLa、HEK293FT、LN-229、U87MG和U251MG细胞培养在37°C、5%CO、补充有热灭活10%胎牛血清（FBS、Sigma）的高糖DMEM（Sigma₂/95%空气培养箱。所有细胞系均无支原体，并已通过STR DNA分析鉴定。根据制造商的说明，使用PolyJet（SignaGen）或FuGENE 6（Promega）转染细胞。用sgRNA载体转染U251MG或HeLa细胞，然后用嘌呤霉素处理，产生CRISPR/Cas9敲除（KO）细胞。选择单个KO细胞，并通过基因分型和免疫印迹分析进行验证。对于缺氧，将细胞置于37°C的模块化室（比卢普斯-罗森伯格）中，用含有1%O的气体混合物冲洗₂，5%一氧化碳₂和平衡N₂.

慢病毒的制备

慢病毒是通过转染HEK293FT细胞、转染转染载体和包装载体psPAX2（Addgene#12260）和pMD2.G（Addgene#12259）产生的。转染48小时后，收集含有病毒颗粒的上清液，过滤并转染到U251MG细胞。

免疫沉淀（IP）和免疫印迹分析

细胞在溶解缓冲液[10 mM Tris–HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5%NP-40和蛋白酶抑制剂混合物]中冰上溶解30分钟，然后在13000℃下离心克在4°C下保持15分钟。全细胞裂解物（WCL）在4°C下与一级抗体在蛋白G磁珠（Bio-Rad）存在下孵育过夜，以进行IP处理。用裂解缓冲液大量洗涤后，结合蛋白在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸洗脱，并通过免疫印迹分析进行分析。用于IP和免疫印迹分析的抗体如下：抗甲基赖氨酸（ab23366，Abcam；NB600-824，Novus Biologicals）；抗HIF-1α（sc-10790，圣克鲁斯；610959，BD Biosciences）；抗HIF-2α（A300-286A，Bethyl Laboratories）；抗G9a（G6919，Sigma）；抗GLP（A301-642A，Bethyl Laboratories）；p300（NB500-161，Novus Biologicals）；抗JMJD2C（NBP1-49600，Novus Biologicals）；anti-Pontin（12300S，细胞信号技术）；抗Reptin（8959S，细胞信号技术）；防FLAG（F3165，Sigma）；抗-V5（R96025，Invitrogen）；抗HA（H9658，西格玛）；抗单甲基和抗二甲基HIF-1αK674抗体（Novus Biologicals）。

体外甲基化检测

甲基转移酶G9a[210–1210氨基酸（aa）]、GLP（32–1298 aa）、SET7、SMYD2和SET8在Sf9细胞中表达并如前所述纯化(26). GST-HIF-1α蛋白在大肠杆菌BL21-Gold（DE3）并通过结合谷胱甘肽-Sepharose珠进行纯化（GE Healthcare）(25). 将纯化的甲基转移酶（200 ng）与GST-HIF-1α蛋白在30°C的甲基化反应缓冲液[40 mM Tris–HCl（pH 8.5）、100 mM NaCl、30 mM KCl、6%甘油和55μCi/ml中孵育1 hS公司-腺苷-L-（甲基-^三H） 蛋氨酸(^三H-SAM）或100μM未标记SAM（PerkinElmer）]。通过加入SDS-PAGE样品缓冲液并煮沸2分钟来终止反应。通过放射自显影、质谱或用抗单甲基或二甲基HIF-1αK674抗体的免疫印迹分析来测定HIF-1α甲基化。

质谱（MS）分析

纯化的GST-HIF-1α（576–680 aa）蛋白与纯化的G9a（210–1210）在在体外甲基化分析，SDS-PAGE分离，考马斯蓝染色。去除染色的GST-HIF-1α（576–680）蛋白，用DTT（Sigma）还原，用碘乙酰胺（Sigma-）烷基化，并用内蛋白酶Arg-C（Sigma.）消化。使用绿洲HLB板（Waters）进行固相萃取净化后，使用Q Exactive HF质谱仪（Thermo）结合Ultimate 3000 RSLC-Nano液相色谱系统（Dionex），通过LC/MS/MS注入并分析产生的肽。样品在75μm i.d.、50-cm Easy Spray柱（Thermo）上分离，并以400 nl/min的流速从1–28%缓冲液B（80%（v/v）乙腈、10%（v/v）三氟乙醇和0.08%甲酸）中梯度洗脱60 min。质谱仪在正离子模式下运行，源电压为2.2 kV，毛细管温度为275°C，S透镜射频水平为55%。质谱扫描的分辨率为120000，对于电荷为2–8的离子，使用高能碰撞诱导离解（HCD）获得的每个全谱，可获得多达20个MS/MS光谱。原始MS数据文件转换为峰值列表格式，并使用中央蛋白质组学设施管道（2.0.3版）进行分析。使用串联和开放MS搜索算法搜索引擎对Uniprot的人类蛋白质数据库进行肽鉴定，附加常见污染物和反向诱饵序列。规定了20ppm和0.5Da的碎片和前体公差，允许三次遗漏劈理。半胱氨酸的甲酰胺甲基化被设定为固定修饰，蛋氨酸的氧化和赖氨酸的单、二和三甲基化被设为可变修饰。每个蛋白质还需要两个独特的肽序列用于蛋白质鉴定。手动验证甲基化肽。

萤光素酶报告基因测定

将亲代或HIF-1αKO-HeLa细胞接种于48周板上，转染HIF-1荧光素酶报告子p2.1质粒或pG5E1bLuc和pGalA报告子质粒；对照报告菌pSV-Renilla质粒；以及编码野生型（WT）或催化死亡突变体（H1113K）G9a、GLP、WT或K674R FLAG-HIF-1α或空载体（EV）的表达载体。转染后18小时，细胞暴露于20%或1%的O₂24小时。萤火虫和Renilla荧光素酶活性通过双荧光素素酶测定系统（Promega）测量。

定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）分析

用Trizol（Invitrogen）分离总RNA并用DNase I（Ambion）处理。使用iScript逆转录试剂盒（Bio-Rad）逆转录1μg不含DNA-的总RNA，并使用iTaq Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad）实时qPCR对所得cDNA进行稀释和分析。引物序列列于补充表S2目标mRNA转录水平标准化为18S公司rRNA及其缺氧引起的倍数变化基于阈值周期（Ct）计算为2^{-Δ（ΔCt）}，式中ΔCt=Ct_目标–Ct（立方厘米）_{18S公司rRNA}且Δ（ΔCt）=ΔCt_1%氧气–ΔCt_20%氧气(25).

染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR分析

细胞与1%甲醛交联20分钟，并在0.125 M甘氨酸中淬火。用PBS加蛋白酶抑制剂混合物洗涤后，在裂解缓冲液（50 mM Tris–HCl、10 mM EDTA、1%SDS和蛋白酶抑制剂混合物）中裂解细胞。通过超声波破碎染色质，将其稀释在ChIP IP缓冲液中[0.01%SDS、1%Triton X-100、2 mM EDTA、20 mM Tris–HCl（pH 8.1）、150 mM NaCl和蛋白酶抑制剂混合物]，并在4°C下与蛋白质A琼脂糖珠（预先用鲑鱼精子DNA封闭）孵育过夜，使其经受IP（Millipore）具有以下抗体：G9a（G6919，Sigma）；GLP（A301–642A，Bethyl Laboratories）；p300（NB500-161，Novus Biologicals）；H3K9me2（4658S，细胞信号技术）；兔IgG（2729S，细胞信号技术）。对于FLAG ChIP，根据制造商的协议，使用SimpleChIP试剂盒（#9003，细胞信号技术）制备染色质。简而言之，将细胞重新悬浮在冰上的缓冲液A中10分钟。离心后，将细胞再次悬浮在缓冲液B中，并在37°C下用微量核酸酶消化20分钟，然后用0.5 M EDTA终止酶消化。然后通过离心收集核颗粒，将其重新悬浮在含有蛋白酶抑制剂混合物的1×ChIP缓冲液中，并进行超声处理。在4°C条件下，在鲑鱼精子DNA/蛋白A珠与FLAG抗体（F1804，Sigma）或小鼠IgG抗体（sc-2025，Santa Cruz Biotechnology）存在的情况下，对片段染色质进行过夜IP处理。将沉淀的染色质DNA洗涤、洗脱、在65°C下反向交联4 h，然后在45°C下用蛋白酶K处理1 h，用苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v）纯化，并通过实时qPCR分析进行量化。用于ChIP-qPCR的引物列于补充表S2.根据Ct as 2计算折叠富集度^{-Δ（ΔCt）}，式中ΔCt=Ct_IP（IP）–Ct（立方厘米）_输入且Δ（ΔCt）=ΔCt_抗体–ΔCt_{免疫球蛋白G}.

细胞迁移分析

细胞悬浮在无血清的DMEM中，接种到Boyden室跨阱插入物（Corning）上。将含有10%FBS的DMEM作为化学引诱剂放置在底板上。暴露于20%或1%O后₂将迁移至transwell插入物下侧的细胞在甲醇中固定16h，用0.5%结晶紫染色并计数。

人GBM组织

UT西南医学中心的机构审查委员会在知情同意的情况下批准了该研究。两位经验丰富的病理学家（Kimmo J.Hatanpaa和Jack M.Raisanen）证实了GBM组织的病理学。与GBM相邻的脑组织（<10%的肿瘤细胞）或癫痫患者的脑组织作为正常对照。

统计分析

所有实验至少重复三次。数据以平均值±扫描电镜表示。统计分析采用Student’st吨-两组之间的测试，或使用GraphPad Prism7软件在多组之间进行单向或双向ANOVA。用Pearson相关系数分析基因表达相关性。采用log-rank检验分析Kaplan-Meier生存曲线。P（P）<0.05被认为是显著的。

结果

新型G9a底物HIF-1α的鉴定

为了确定HIF-1α的反式激活区是否在缺氧条件下被赖氨酸甲基化，用FLAG-HIF-1（531-826）载体转染HeLa细胞，并将其暴露于1%的氧气中₂24小时后，使用识别单、二和三甲基赖氨酸的泛甲基赖氨抗体（抗Lys-me），我们发现抗Lys-me抗体（但不控制IgG）沉淀了FLAG-HIF-1α（531-826）（图1安培). 在暴露于1%O的HeLa细胞中，抗Lys-me抗体也能沉淀全长FLAG-HIF-1α₂24小时（图1B年). 这些数据表明HIF-1α在缺氧人类细胞的反式激活域中甲基化于赖氨酸。

为了确定哪些甲基转移酶甲基化HIF-1α，我们进行了小规模的在体外甲基化筛选。G9a、SET7、SET8和SMYD2是已知的非组蛋白甲基转移酶，被选作此筛选。GST-HIF-1α（531-826）在细菌中表达，纯化并与从昆虫Sf9细胞中表达和纯化的G9a（210–1210）、SET7、SET8或SMYD2孵育(26)，在甲基供体存在下^三H-SAM.转让^三通过放射自显影术检测甲基转移酶标记的GST-HIF-1α（531-826）的H标记甲基。如图所示1摄氏度，GST-HIF-1α（531–826）被G9a（210–1210）以浓度依赖的方式甲基化。然而，没有^三当GST-HIF-1α（531-826）与SET7、SET8、SMYD2或单独缓冲液孵育时，检测到H-SAM标记的GST-HIF1α（531–826）（图1摄氏度). 这些数据表明，G9a（而不是SET7、SET8或SMYD2）甲基化HIF-1α的反式激活结构域在体外.

为了确定G9a的催化活性是否是HIF-1α甲基化所必需的，我们在在体外^三基于H-SAM的甲基化分析。WT G9a（210–1210）诱导GST-HIF-1α（531–826）甲基化（图一维)，验证了屏幕数据（图1摄氏度). 相反，一个催化失活的G9a突变体（H1113K）未能使GST-HIF-1α（531–826）甲基化（图一维). 这些数据表明，G9a通过其甲基转移酶活性直接使HIF-1α甲基化在体外.

确定G9a是否甲基化HIF-1α体内G9a-介导的HIF-1α甲基化是否受O调节₂，我们使用了一个突变HIF-1α（P402/564A），它不受O₂-依赖性蛋白质降解(6)，并比较在常氧和缺氧条件下同样表达的HIF-1α（P402/564A）的甲基化水平。用编码FLAG标记的HIF-1α（P402/564A）和WT或H1113K G9a或EV的载体共同转染HeLa细胞，并暴露于20%或1%的O₂持续24小时，符合在体外结果（图一维)在HeLa细胞中，WT而非H1113K G9a诱导FLAG-HIF-1α（P402/564A）甲基化，其甲基化水平在20%和1%O₂条件（图1E级). 这些数据表明，G9a通过其在O中的甲基转移酶活性使HIF-1α甲基化₂-独立的方式体内.

G9a甲基化HIF-1α（K674）在体外和体内

为了系统地绘制G9a甲基化的HIF-1α结构域，我们进行了在体外^三使用一系列截短的GST-HIF-1α蛋白进行基于H-SAM的甲基化分析。如预期，G9a（210–1210）甲基化GST-HIF-1α（531–826）（图2安培). 相反，G9a（210–1210）未能甲基化GST-HIF-1α（1–80）、（81–200）、（201–329）、（331–427）和（432–528）或GST（图2安培). 已知SET7在赖氨酸32处甲基化HIF-1α(14). 我们的在体外甲基化试验还表明，GST-HIF-1α（1-80）被SET7甲基化（图2安培)，验证我们的实验系统。总之，这些数据表明G9a只甲基化HIF-1α（531-826），而不甲基化其他HIF-1β结构域。

为了鉴定被G9a甲基化的HIF-1α的赖氨酸残基，我们首先将HIF-1β（531-826）分为6个亚结构域。体外^三基于H-SAM的甲基化分析显示，G9a（210–1210）强烈甲基化GST-HIF-1α（576–680）和（576–786），与其对GST-HIF-1α（531–826）甲基化的影响相当（图2B型). 相反，GST-HIF-1α（531–575）、（681–786）和（787–826）未被G9a（210–1210）甲基化（图2B型). 这些数据表明，G9a-甲基化赖氨酸残基位于HIF-1α的氨基酸残基576–680内。HIF-1α（576–680）亚结构域总共包含五个赖氨酸残基。该亚结构域中K674突变为精氨酸（K674R）完全消除了G9a（210–1210）诱导的GST-HIF-1α（531–826）甲基化在体外（图2摄氏度). 相反，其他四个赖氨酸残基的个体突变并没有改变G9a（210–1210）诱导的GST-HIF-1α（531–826）甲基化（图2摄氏度).

为了确认K674甲基化并通过G9a鉴定其甲基化类型，我们进行了MS分析。GST-HIF-1α（576–680）与G9a（210–1210）在SAM存在下孵育，通过SDS-PAGE分离，并进行MS分析。MS鉴定出两种主要的甲基化类型K674me1和K674me2（图二维–F类). 含有K674me1-和K674me2-的肽的百分比分别为18.8%和10.6%（图二维). 相反，检测到少量含有三甲基（me3）K674的肽（2.4%），类似于未甲基化的K649（图二维).

为了进一步验证MS数据，我们开发了特异性识别HIF-1α的K674me1或K674me2的多克隆抗体。体外甲基化分析表明，在G9a存在下，GST-HIF-1α（531-826）在K674处确实是单甲基化和双甲基化的（图2G（2G）). K674R，而不是K625R、K629R、K636R或K649R，完全消除了GST-HIF-1α（531-826）的单甲基化和双甲基化（图2G（2G）).

我们进一步检查了HIF-1α的G9a甲基化物K674me1和K674me2体内.IP分析表明，WT（而非H1113K G9a）在暴露于1%O的HeLa细胞中诱导了FLAG-HIF-1α的K674me1和K674me2₂持续6小时（图2小时). 符合在体外结果（图2G（2G）)，K674R，而不是K649R，消除了缺氧HeLa细胞中由G9a诱导的FLAG-HIF-1α的K674me1和K674me2（图2小时). 总之，这些在体外和体内数据表明，G9a催化HIF-1α的单甲基和二甲基K674。

G9a与内源性HIF-1α相互作用并甲基化体内

上述HIF-1α甲基化数据表明G9a与HIF-1β相互作用。为了测试这种可能性，用FLAG-G9a载体转染HeLa细胞，并暴露于1%的O₂持续6小时。抗-HIF-1α抗体在缺氧HeLa细胞中拉下FLAG-G9a，而对照IgG没有这样做（图3A级). 我们还进行了相互作用的co-IP分析，发现抗G9a抗体（而非IgG）在缺氧HeLa细胞中沉淀FLAG-HIF-1α（图3B公司). 此外，我们发现在暴露于1%氧气的U251MG细胞中，内源性G9a与内源性HIF-1α沉淀，而不是HIF-2α沉淀₂持续6小时（图3C公司). 总之，这些数据表明G9a在人类细胞中与HIF-1α相互作用，但与HIF-2α相互作用。

接下来，我们通过CRISPR/Cas9技术生成G9a KO HeLa细胞，并进行IP分析以确定G9a是否甲基化内源性HIF-1α体内如图所示三维在低氧条件下，抗K674me1抗体强烈沉淀了亲代HeLa细胞内源性HIF-1α，而G9a-KO细胞没有，这表明G9a-KO可以消除K674处HIF-1的单甲基化。同样，在缺氧条件下，G9a-KO-HeLa细胞中检测到极少内源性HIF-1αK674me2（图三维). 这些数据表明，G9a催化人体细胞K674处内源性HIF-1α的单甲基化和双甲基化。

GLP与HIF-1α相互作用并使其甲基化

GLP通常与G9a共用相同的底物(17). 因此，我们研究了GLP是否也与HIF-1α相互作用。如图所示4A级低氧条件下，抗GLP抗体（而非控制IgG）同时降低U251MG细胞内源性HIF-1α和GLP，表明GLP与人类细胞中的HIF-1β结合。缺氧U251MG细胞中内源性HIF-2α与GLP没有相互作用（图4A级). 为了确定GLP是否甲基化HIF-1α，我们进行了在体外甲基化分析。与G9a类似，GLP（32–1298）甲基化GST-HIF-1α（531–826），但不仅仅是GST在体外（图第4页). 域映射研究表明，GLP（32–1298）甲基化GST-HIF-1α（531–826）、（576–680）和（576-786），但GST-HIF1α（531-575）、（681–786）和（787–8264厘米). K674R，而不是K625R、K629R、K636R或K649R，消除了GLP诱导的GST-HIF-1α的单甲基化或双甲基化（531-826）在体外（图4D（四维）). 此外，我们发现HA-GLP的异位表达诱导低氧HeLa细胞中FLAG-HIF-1α的单甲基化和双甲基化（图第四版). 符合在体外结果（图4D（四维）)在低氧HeLa细胞中，FLAG-HIF-1α（K674R）未能被GLP单甲基化和二甲基化，而FLAG-HIF1α（K649R）被GLP样的WT FLAG-HIFα完全甲基化（图第四版). GLP诱导的HIF-1α甲基化不受缺氧调节（图4楼). 相反，GLP的CRISPR/Cas9-based KO降低了缺氧HeLa细胞内源性HIF-1α的K674me1或K674me2水平（图4G网络). 这些数据表明GLP在K674催化HIF-1α的单甲基化和双甲基化在体外和G9a一样，在人类细胞中，但程度较小。

G9a/GLP抑制HIF-1转录活性和下游靶基因表达

为了确定G9a/GLP是否调节HIF-1转录活性，我们进行了HIF-1荧光素酶报告子p2.1分析。父母或HIF-1αKO-HeLa细胞与p2.1共转染，p2.1含有来自ENO1公司萤火虫荧光素酶基因上游(27)、控制向量pSV-Renilla和编码WT或H1113K G9a或EV的向量，并暴露于20%或1%的O中₂在24小时内，WT G9a显著降低HIF-1转录活性，这被HeLa细胞中催化不活跃的G9a（H1113K）所逆转（图5A级). WT和非活性G9a均未改变HIF-1αKO-HeLa细胞中p2.1的活性（图5A级)，表明G9a对HIF-1的特异性抑制。WT或H1113K G9a的异位表达并不影响HeLa细胞中HIF-1α的蛋白水平（图2小时)表明G9a介导的HIF-1抑制不是由于HIF-1α蛋白水平降低。同样，GLP的异位表达也显著抑制缺氧HeLa细胞中HIF-1的转录活性（图5亿). 为了进一步确定G9a/GLP是否直接抑制HIF-1转录活性，我们进行了HIF-1荧光素酶报告子GalA分析。HeLa细胞与pGalA共转染，pGalB编码融合到Gal4 DNA结合域的HIF-1α（531-826）(28)，荧光素酶报告质粒pG5E1bLuc，包含五个Gal4-结合位点和萤火虫荧光素素酶基因上游的TATA盒，以及WT或H1113K G9a载体或EV，并暴露于20%或1%的O₂24小时内，WT而非H1113K G9a抑制缺氧HeLa细胞中HIF-1反式激活（图5摄氏度). 在HIF-1αKO HeLa细胞中也观察到类似的结果，因为GalA分析测量的是外源性HIF-1β反式激活结构域的活性，而不是内源性HIF-α（图5摄氏度). 我们还发现GLP的异位表达显著降低了HeLa细胞中HIF-1的反式激活（图第五天). 总之，这些数据表明G9a/GLP通过低氧细胞中的甲基转移酶活性抑制HIF-1转录活性。

为了确定G9a是否抑制HIF-1靶基因的转录，我们通过CRISPR/Cas9技术生成了G9a KO和G9a+HIF-1α双KO（DKO）U251MG细胞（图第五版). 父母、G9a KO、G9a+HIF-1αDKO细胞暴露于20%或1%的O₂24小时的RT-qPCR分析表明，缺氧显著诱导HIF-1靶基因的转录PTGS1、NDNF、SLC6A3、Linc01132、和VEGFA（血管内皮生长因子）在U251MG电池中（图5楼). 低氧诱导的PTGS1、NDNF、SLC6A3、和林肯01132mRNA，但不是VEGFA（血管内皮生长因子）与亲代U251MG细胞相比，G9a-KO U251MG细胞中的mRNA显著增强（图5楼). 正如预期的那样，HIF-1αKO废除了G9a KO诱导的HIF-1靶基因（图5楼)表明这些低氧诱导基因的抑制是由于G9a对HIF-1的特异性抑制。非缺氧和缺氧U251MG细胞中的HIF-1α和HIF-2α蛋白水平均不受G9a KO的影响（图第五版). 为了确定GLP是否具有类似的抑制功能，我们产生了基于CRISPR/Cas9的GLP KO U251MG细胞（图5克). GLP KO显著增加HIF-1靶基因的表达PTGS1型和林肯01132，但不是NDNF、SLC6A3、和VEGFA（血管内皮生长因子），在缺氧条件下U251MG细胞中（图5小时). 这些数据表明，G9a/GLP选择性地抑制U251MG细胞中HIF-1靶基因的表达。

K674甲基化抑制HIF-1转录活性和靶基因表达

我们进行了p2.1报告基因检测，以确定K674甲基化是否抑制HIF-1转录活性。用p2.1、pSV-Renilla和编码WT或K674R FLAG-HIF-1α或EV的载体转染HeLa细胞，并暴露于20%或1%的O₂24小时内，WT FLAG-HIF-1α显著增加了p2.1活性，在非缺氧和缺氧条件下，K674R进一步增强了该活性（图6A级). 这些数据表明，K674甲基化抑制HIF-1转录活性。

接下来，我们着手确定K674甲基化是否抑制U251MG细胞中HIF-1靶基因的表达。为了解决这个问题，我们通过CRISPR/Cas9技术生成HIF-1α和HIF-2αDKO U251MG细胞，以及表达WT或K674R FLAG-HIF-16亿). 先前的研究表明K674被PCAF乙酰化(12). 因此，我们还生成了K674乙酰化细胞系HIF-1/2αDKO+FLAG-HIF-1α（K674Q）U251MG（图6亿)，以区分K674乙酰化和甲基化对HIF-1靶基因表达的影响。这些细胞系暴露于20%或1%的O₂24小时，并进行RT-qPCR分析。如图所示6摄氏度–G公司HIF-1靶基因的mRNA水平PTGS1、NDNF、SLC6A3、Linc01132、和VEGFA（血管内皮生长因子）缺氧使U251MG细胞中HIF-1/2αDKO被阻断。WT FLAG-HIF-1α的异位表达部分但显著地恢复了缺氧HIF-1/2αDKO U251MG细胞中这五个HIF-1靶基因的表达（图6摄氏度–G公司). 增加PTGS1、NDNF、SLC6A3、和林肯01132与表达WT FLAG-HIF-1α的HIF-1/2αDKO U251MG细胞（图6摄氏度–F类)表明K674的甲基化而非乙酰化抑制了PTGS1、NDNF、SLC6A3、和林肯01132缺氧U251MG细胞中。相反，K674R或K674Q对VEGFA（血管内皮生长因子）缺氧U251MG细胞中的mRNA表达（图6克). 缺氧条件下HIF-1/2αDKO U251MG细胞中WT、K674R和K674Q FLAG-HIF-1α的蛋白水平具有可比性（图6亿)，排除了PTGS1、NDNF、SLC6A3、和林肯01132由K674R或K674Q引起的FLAG-HIF-1α是由于FLAG-HIF1α（K674R）或（K674 Q）蛋白的高水平所致。因此，这些数据表明，K674表型G9a的HIF-1α突变通过增加U251MG细胞中HIF-1靶基因的表达而丧失功能。

K674甲基化对HIF-1与HRE的结合没有影响

为了确定K674甲基化是否抑制HIF-1α与HRE的结合以抑制HIF-I转录活性，我们进行了ChIP-qPCR分析。用编码WT或K674R FLAG-HIF-1α的载体瞬时转染HIF-1 aKO U251MG细胞，并暴露于20%或1%的O₂24或72小时。如预期，WT FLAG-HIF-1α在HREs处富集VEGFA、PTGS1、SLC6A3、和林肯01132在非缺氧条件下，U251MG细胞缺氧24或72小时后其占有率显著增加(补充图S1A-D). 同样，FLAG-HIF-1α（K674R）也占据这些HIF-1靶基因的HRE，其结合强度与WT FLAG-HIF1α相当(补充图S1A-D). 这些数据表明，K674甲基化未能阻断GBM细胞中HIF-1与HRE的结合。

慢性缺氧降低G9a/GLP与HIF-1靶基因HRE的结合

接下来，我们研究了G9a/GLP是否直接与HIF-1靶基因的HRE结合。用携带WT或K674R FLAG-HIF-1α的慢病毒转导HIF-1 aKO U251MG细胞，并暴露于20%或1%的O₂24或72小时。ChIP-qPCR分析表明，G9a在HREsPTGS1、SLC6A3、Linc01132、和VEGFA（血管内皮生长因子）在20%氧浓度下表达WT FLAG-HIF-1α的HIF-1 aKO U251MG细胞中₂缺氧24h后其富集没有改变，但慢性缺氧72h后显著降低(补充图S2A-D). 表达FLAG-HIF-1α（K674R）的HIF-1 aKO U251MG细胞在HREs的G9a占用强度相似(补充图S2A-D). 这些数据表明，慢性缺氧抑制G9a与HREs的结合，但K674甲基化对HREs处G9a的富集没有影响。同样，我们发现GLP也占据U251MG细胞中的HREs，其占据被慢性缺氧抑制，但不受K674甲基化的抑制(补充图S2E–H). 总之，这些发现表明，在GBM细胞中，G9a/GLP在HIF-1靶基因的HRE处富集，并且在暴露于慢性缺氧的GBM细胞中，G9a/GLP的占有率降低。

已知G9a/GLP甲基化H3K9以抑制基因表达(17). 与G9a/GLP占用一致，H3K9me2在HREs检测到高度富集PTGS1、SLC6A3、Linc01132、和VEGFA（血管内皮生长因子）在表达WT或K674R FLAG的HIF-1αKO U251MG细胞中₂缺氧24小时不会增加其占用率(补充图S3A–D). 这些数据表明，G9a/GLP诱导的H3K9二甲基化并不负责抑制GBM细胞中的HIF-1靶基因。

p300、JMJD2C、Pontin、Reptin、PRDX2和PRDX4不参与K674甲基化介导的HIF-1抑制

接下来，我们研究了K674甲基化是否影响HIF-1辅活化子或辅抑制剂（包括p300、JMJD2C、Pontin、Reptin、PRDX2或PRDX4）向HIF-1α的募集，从而导致HIF-1抑制。HIF-1αKO U251MG细胞表达WT或K674R FLAG-HIF-1₂持续6小时。抗p300抗体对p300的IP下调等量的WT和K674R FLAG-HIF-1α(补充图S4A)表明K674甲基化并不影响GBM细胞中HIF-1α-p300的相互作用。我们进一步进行了ChIP-qPCR分析，以检查K674甲基化对HIF-1靶基因p300募集的影响。低氧增加了HREs的p300占用率PTGS1、SLC6A3、Linc01132和VEGFA（血管内皮生长因子）在表达WT FLAG-HIF-1α的HIF-1 aKO U251MG细胞中(补充图S4B-E). K674R在缺氧条件下没有改变p300的占用率(补充图S4B-E). 同样，我们发现在U251MG细胞中，WT和K674R FLAG-HIF-1α与JMJD2C、Pontin、Reptin、PRDX2-V5或PRDX4-V5的结合相同(补充图S4F–I). 总之，这些发现表明p300、JMJD2C、Pontin、Reptin、PRDX2和PRDX4不参与K674甲基化介导的GBM细胞HIF-1转录活性抑制。

HIF-1αK674甲基化损害GBM细胞迁移

HIF-1通过诱导下游靶基因的表达促进癌细胞迁移(2,29). 因此，我们通过Boyden室迁移实验研究HIF-1α甲基化是否调节GBM细胞迁移。将亲代、HIF-1/2αDKO+EV、HIF-1/2αDKO+WT FLAG-HIF-1α、HIF-1-2αDKO+FLAG-HIF1α（K674R）、HIF-1／2αDKO+FLAG-HIF 1α（K67 4Q）U251MG细胞分别接种于Boyden室跨阱插入物上，暴露于20%或1%的O₂如预期的那样，缺氧显著增加了通过跨孔膜迁移的细胞数量，而跨孔膜被HIF-1/2αDKO阻断（图第7章以及B类). WT FLAG-HIF-1α的表达部分恢复了缺氧条件下HIF-1/2αDKO U251MG细胞的迁移能力（图第7章以及B类). 与WT FLAG-HIF-1α相比，K674R或K674Q FLAG-HIF1α显著增加低氧诱导的U251MG细胞迁移（图第7章以及B类). 这些数据表明，K674甲基化抑制HIF-1介导的GBM细胞迁移。

G9a被慢性缺氧下调，与GBM中HIF-1靶基因表达呈负相关

我们研究了GBM细胞中G9a/GLP蛋白是否受缺氧调节。U251MG细胞暴露于20%或1%的O₂24–72小时。如图所示8安缺氧48h后，U251MG细胞G9a蛋白水平下降。在其他GBM细胞系LN-229和U87MG细胞中也观察到低氧诱导的G9a蛋白下调，且呈时间依赖性（图8B类以及C类). 低氧也下调U251MG和LN229中的GLP蛋白，但不下调U87MG细胞（图8安–C类). 与降低的G9a和GLP一致，U251MG细胞中的HIF-1αK674me1/2因慢性缺氧而减弱（图8安). 此外，U251MG细胞的慢性缺氧也阻断了HIF-1α与G9a的相互作用（图8安). HIF-1α、HIF-2α或两者的KO对低氧诱导的U251MG细胞G9a或GLP下调没有影响（图第8天)表明低氧诱导的G9a和GLP下调独立于HIF-1和HIF-2。

为了研究G9a/GLP是否在含有广泛缺氧区域的人类GBM中发生下调，我们利用癌症基因组图谱（TCGA）的数据分析了G9a和GLP的mRNA水平(30)发现与正常脑组织相比，人类GBM中G9a mRNA显著减少（图8E型). 从其他公开可用的微阵列数据集也获得了类似的结果（图第8页以及G公司) (31,32). 然而，GLP mRNA的表达在不同的GBM数据集中有所不同（图8小时–J型)我们进一步发现，与正常脑组织相比，G9a蛋白在人类GBM组织中趋于减少（图8公里以及L（左）)，但GLP蛋白在人类GBM组织中趋于上调（图8公里以及M（M）). 值得注意的是，HIF-1靶基因PTGS1型GBM上调（图8牛–P（P）)，其表达与G9a mRNA水平呈负相关（图第8季度). 这些数据支持我们的研究结果，即G9a抑制HIF-1转录活性，也表明了由于GBM中G9a的缺失而增强HIF-1反式激活的一般机制。

为了确定G9a下调在GBM患者中的意义，我们使用TCGA进行了Kaplan-Meier分析(30)和GSE4271(33)数据集和PROGgene程序(34)，并发现在两个数据集中，低水平的G9a与GBM患者的高死亡率显著相关（图8R型以及S公司). GLP mRNA水平与GBM患者生存率之间没有显著相关性（图8吨以及U型). 这些发现表明G9a可能是预测GBM患者临床结局的预后因素。

讨论

在本研究中，我们确定了一种新的表观遗传机制，该机制是调节GBM中HIF-1转录活性的基础。赖氨酸甲基转移酶G9a及其同系物GLP催化HIF-1α在K674处的单甲基化和双甲基化。K674甲基化直接抑制GBM细胞中HIF-1转录活性和下游靶基因表达。G9a/GLP选择性结合HIF-1α，但不结合HIF-2α。此外，K674在HIF-2α中不保守，表明G9a/GLP介导的K674me1/2是HIF-1α特有的。这些数据表明HIF-1α是一种新的G9a/GLP底物，并直接证明G9a/GLP抑制GBM细胞中HIF-1转录活性。因此，G9a/GLP是GBM中新型的HIF-1负性协同调节因子。G9a/GLP在常氧条件下HIF-1靶基因的HRE处富集，它们的占有率不受24小时缺氧的影响，尽管它可能因慢性缺氧期间G9a/GLP蛋白水平降低而受到慢性缺氧的损害。同样，我们最近的研究表明，在HIF与HRE结合之前，HIF辅活化子ZMYND8占据HRE并在正常氧条件下构成反式激活复合体(35). 这些发现表明，含有HIF-1共调节因子的HIF-1调节复合物在常氧条件下已在HRE处预组装，并在缺氧条件下一旦HIF-1与HRE结合，就控制HIF-1转录活性，从而使癌细胞能够对缺氧应激做出快速反应。

虽然G9a和GLP都能在20%和1%的氧浓度下使HIF-1α（P402/564A）甲基化₂，内源性HIF-1α蛋白在20%O下不太可能被G9a/GLP甲基化₂因为它是不稳定和退化的。我们发现，在20%O浓度下，G9a和GLP都与HIF-1靶基因的HREs结合₂因此，当HIF-1占据HREs时，G9a/GLP可能在K674使HIF-1α甲基化，从而抵消HIF-1依赖的转录程序。K674甲基化因慢性缺氧期间G9a、GLP和HIF-1α蛋白水平降低而受损。我们发现G9a-KO完全消除了HIF-1α的K674的单甲基化和双甲基化，而GLP-KO部分降低了K674甲基化。这些结果表明，G9a是K674处HIF-1α的主要甲基转移酶，GLP甲基化HIF-1 a的程度较低。根据它们在HIF-1α甲基化方面的差异能力，G9a对K674甲基化介导的HIF-1靶基因的抑制进行了完全表型复制PTGS1、NDNF、SLC6A3、和林肯01132在U251MG细胞中。GLP被抑制PTGS1型和林肯01132，但不是NDNF（神经营养因子）和SLC6A3型因此，G9a可以抵消GLP KO对NDNF（神经营养因子）和SLC6A3型而GLP可能通过G9a功能丧失对HIF-1激活几乎没有抵消作用，这可能是由于其甲基化HIF-1α的能力降低。

以前的研究表明，K674被PCAF乙酰化，K674R减少HIF-1α与p300的蛋白相互作用，从而抑制HEK293T细胞中HIF-1的转录活性(12). 我们这里的数据表明，乙酰化胺突变体K674Q增强了HIF-1靶基因的表达，类似于耐甲基化突变体K694R，这表明K674的甲基化而非乙酰化主要介导GBM细胞中HIF-1转录活性的抑制。最近的研究通过SET7/9确定了HIF-1α的K32me1和K391me2，尽管尚不清楚K391me是否存在于内源性HIF-1(14–16). 线路接口单元等据报道，K32me1可能减弱HIF-1与靶基因HRE的结合(14). 随后的研究表明，K32me1和K391me2降低了HIF-1α蛋白的稳定性，从而抑制了HIF-1的转录活性(15,16). 与K32me1和K391me2相比，K674me1/2直接损害HIF-1α转录激活域活性，但对HIF-1β蛋白稳定性没有影响。K674位于HIF-1αC末端的抑制结构域中，包含多个HIF-1β相互作用蛋白的结合位点，这些蛋白参与抑制HIF-1γ反式激活结构域活性(36,37). 我们发现，包括p300、JMJD2C、Pontin、Reptin、PRDX2和PRDX4在内的几个已知HIF-1协同调节因子与非甲基化和甲基化的K674同样结合，因此它们不太可能参与G9a/GLP介导的HIF-1抑制。需要进一步研究，以调查G9a/GLP引起的K674甲基化是否干扰未知HIF-1协调剂向HIF-1α的募集，从而抑制HIF-1转录活性。我们还发现，K674甲基化未能阻断HIF-1α与HREs的结合，排除了作为K674甲酰化介导的HIF-1抑制的可能机制而受损的HIF-α-DNA结合。然而，K674甲基化代表了抑制肿瘤细胞HIF-1转录活性的一种新机制。

我们发现K674甲基化抑制了PTGS1、NDNF、SLC6A3、和林肯01132U251MG细胞缺氧，抑制HIF-1依赖性GBM细胞迁移。已知PTGS1和NDNF可促进细胞迁移(38,39)表明PTGS1和NDNF在K674甲基化介导的细胞迁移抑制中发挥重要作用。有趣的是，HIF-1靶基因VEGFA（血管内皮生长因子）不受K674甲基化的调控。因此，K674甲基化选择性地抑制HIF-1介导的GBM细胞靶基因的反式激活。HIF-1靶基因的选择性激活或抑制也通过其协调剂在HIF-1活性的许多其他调节途径中发现(22,23,25,36,40).

先前的研究表明，G9a是由小鼠胚胎干细胞中低氧在其转录水平上诱导的(41). G9a蛋白也通过阻断缺氧条件下MCF-7、MDA-MB-231和A549细胞中脯氨酰羟化酶/VHL途径介导的蛋白酶体降解而稳定(24,42). 然而，我们发现GBM中的G9a被慢性缺氧下调，这与HIF-1和HIF-2无关。脯氨酰羟化酶/VHL途径在GBM细胞中起作用，因为其假定底物HIF-1α在这些癌细胞中完全受该途径的调节。因此，细胞类型特异性机制有助于低氧介导的GBM G9a下调。值得注意的是，G9a水平降低与HIF-1靶基因表达增加相关PTGS1型在GBM中，这意味着G9a介导的HIF-1α甲基化缺失导致HIF-1的高度激活和GBM中HIF-1下游靶基因的上调。我们的数据表明GLP在GBM的异质表达。GLP在多大程度上介导人类GBM中的HIF-α甲基化和HIF-1抑制值得进一步研究。总之，我们的发现揭示了一种负反馈机制，该机制维持了GBM中HIF-1的高活性。

研究表明，G9a可介导多种人类癌症的进展，包括乳腺癌、肝癌、肺癌和卵巢癌(43). 通过其小分子抑制剂靶向G9a损害小鼠肿瘤发生(24). 虽然G9a在GBM发展中的确切作用尚待确定，但我们发现低水平的G9a与GBM患者生存率低相关，这表明低G9a的GBM中HIF-1的高激活可能是这些患者高死亡率的原因，G9a可能是GBM发展的负调控因子，不同于它在其他癌症中的作用。HIF-1是GBM生长的关键驱动因素，因此控制G9a诱导的HIF-1αK674甲基化可能有助于GBM治疗。

补充数据

补充数据可从NAR Online获取。

致谢

我们感谢Karen Padgett（Novus Biologicals）为U251MG和LN229细胞系提供抗HIF-1α的单甲基和双甲基K674抗体，以及Sandeep Burma（UT Southwestern）抗体。我们还感谢UTSW蛋白质组学核心的质谱分析。

基金

韦尔奇基金会【I-1903-20160319至W.L.，I-1939-2170325至Y.W.，I-1805至C.-M.C.】；国立卫生研究院[R00CA168746至W.L.，R00NS078049和R35GM124693至Y.W.，CA103867至C.-M.C.]；Susan G Komen【CCR16376227至W.L.】；CPRIT【RR140036至W.L.，RP170671至Y.W.，RP140367和RP180349至C.-M.C.】。W.L.是CPRIT癌症研究学者。开放获取费用的资助：韦尔奇基金会。

利益冲突声明。未声明。

参考文献