摘要
人成纤维细胞生长因子9（FGF9）是一种强大的有丝分裂原，参与许多生理过程。尽管功能梯度9信使RNA（mRNA）在胚胎中广泛表达，FGF9蛋白表达普遍较低，仅限于少数成年器官。FGF9的异常表达通常会导致包括癌症在内的人类恶性肿瘤，但其机制在很大程度上尚不清楚。在这里，我们报告了FGF9蛋白，而不是mRNA，在缺氧时增加。两个序列元件，上游开放阅读框（uORF）和内部核糖体进入位点（IRES），在FGF9公司mRNA。功能分析表明，FGF9蛋白的合成通常由uORF介导的翻译抑制控制，这使该蛋白保持在较低水平，但通过转换到IRES依赖的翻译控制，在缺氧反应中上调。我们的数据表明FGF9公司IRES作为细胞开关，在缺氧时“启动”FGF9蛋白合成，这可能是肿瘤细胞中FGF9过度表达的机制。最后，我们提供证据表明低氧诱导的翻译激活促进结肠癌细胞中FGF9蛋白的表达。总之，这种动态工作模式可能为抗肿瘤治疗和癌症干预提供新的方向。
简介
成纤维细胞生长因子（FGF）家族包括至少24种不同的多肽，分子量从17到34 kDa不等，序列同源性为13–71%(1). 许多哺乳动物的FGF以特定的空间和时间模式大量表达，并实质上参与许多细胞过程，包括发育(2)和血管生成(三). 人成纤维细胞生长因子9(FGF9公司)（MIN#600921）位于人类染色体13q11–q12上，由三个外显子组成(4). FGF9是一种高度保守的蛋白质，与爪蟾、小鼠、大鼠和人类(5,6)这表明FGF9在进化上很重要，可能在物种间具有类似的功能。以前的报告表明，FGF9对许多不同类型的细胞（如神经元）起着自分泌和/或旁分泌生长因子的作用(6,7)，子宫内膜基质(8,9)和成纤维细胞(10). 此外，FGF9对许多关键过程至关重要，包括肺的发育(11)和骨头(12)以及出生后Leydig细胞中的类固醇生成(13).
尽管FGF9公司信使RNA（mRNA）在胚胎中广泛表达(14,15)在正常生理条件下，人FGF9蛋白的表达水平相对较低，仅限于少数成人器官，如大脑、肾脏(5)和子宫(8). 研究表明FGF9在胶质瘤中表现出有丝分裂活性(16)上皮细胞和成纤维细胞(17). FGF9在NIH3T3成纤维细胞中的过度表达具有转化潜能(5)刺激上皮细胞和内皮细胞的侵袭。这表明FGF9过度表达可能导致细胞增殖失控和恶性肿瘤。FGF9的异常表达与几种人类癌症（17-20）和子宫内膜异位症有关(21). 这些研究表明，必须严格控制FGF9的表达，以维持其体内平衡。我们之前的研究表明，FGF9的表达在多个水平上受到严格调控，包括转录前(22,23)和转录后水平(24,25). 然而，FGF9蛋白在癌细胞中升高的机制在很大程度上仍然未知。
与转录调控相比，现有mRNA的翻译控制允许编码蛋白的细胞浓度发生更快的变化。这为维持细胞生理学中的内稳态提供了动态控制(26). 事实上，蛋白质合成的失调与许多病理状况有关，如癌症和几种神经系统疾病(27). 虽然癌细胞是异质的，但众所周知，缺氧是所有癌细胞都会遇到的一种常见压力。此外，有充分的证据表明，缺氧诱导许多应激反应基因的翻译激活。因此，我们开始测试以下假设：癌症发展中的微环境变化（即缺氧）会触发FGF9蛋白表达，并且过度表达的FGF9会促进肿瘤进展。这里，我们报告了位于5’UTR上的两个功能元件的标识FGF9公司mRNA控制FGF9蛋白表达。当上游开放阅读框（uORF）在正常生理条件下将FGF9蛋白合成维持在较低水平时，内部核糖体进入位点（IRES）增加FGF9蛋白质合成以应对缺氧应激。这些数据支持这样的假设，即肿瘤细胞中FGF9蛋白的过度表达是由低氧诱导的翻译激活介导的。
材料和方法
细胞培养
人类胚胎肾293（HEK293）细胞常规保存在Eagle的最低必需培养基中，该培养基补充有10%热灭活的特定马血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素（这三种试剂来自美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的Invitrogen Life Tech）和1.0 mM丙酮酸钠（西格玛-阿尔德里希，圣。Louis，MO，USA）在5%CO的气氛中237°C时。对于缺氧处理，将细胞在37°C、含1%O的缺氧室中孵育3、6、9、12、24或36小时2.
计算分析FGF9公司5'UTR序列
的序列FGF9公司从NCBI下载人类（D14838.1）、黑猩猩（XM_001150741.1）、猪（NM_213801.1）、马（XM_001489697.2）、狗（XM_844845.1）、小鼠（NM_013518.3）和大鼠（NM_012952.1）物种的5'UTR，并使用多序列比对程序进行比对(http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-arign.html). 使用BOXSHADE输出多序列比对图像(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html). 此外，保守顺式-的元素FGF9公司使用UTRdb筛选5'UTR(28)，UTR扫描(29)和RegRNA(网址：http://rechna.mbc.nctu.edu.tw/) (28,30).
质体构筑
所有构造都是基于人类最初提交的序列FGF9公司cDNA序列（D14838.1）。利用pcDNA3.1 myc/His A+（Invitrogen）、pGL3-P和pRL-TK（Promega，Madison，WI，USA）克隆载体构建重组克隆。此外，含有双荧光素酶报告基因的pRF和phpRF载体由英国莱斯特MRC毒理学部门的A.E.Willis博士提供(31). 全长功能梯度95’UTR（FGF9-FL.nt.1-178）、预测IRES（FGF9-IRES，nt.84-178）和IRES缺失（FGF9-ΔIRES，nt.1-125）是用合适的引物集从人类基因组DNA中扩增的聚合酶链反应（PCR）（补充表S1），并亚克隆到三种载体之一：pGL3-P、pRF或phpRF。为了构建uORF突变，两个上游AUGFGF9公司5'UTR突变（mATGI:1stA类TG→T型TG；马特基：第二名A类TG→T型TG；dmATG:1档和2档A类TG→T型TGs）使用适应性诱变PCR(32). 此外，终止密码子FGF9公司uORF发生突变（mTGA:T型GA→G公司GA）和一个额外的1碱基缺失突变体（mTGA-Infra）被生成以纠正下游ORF的阅读框。用于双顺反子质粒构建，全长FGF9公司将5'UTR（pRF-FL和phpR-FL；nt.1-178）、预测IRES（pRF-IRES和phpRF-IRES；nt.84-178）和IRES缺失（pR-ΔIRES和phpR-ΔIRES；nt.1-94）插入雷尼利亚（Rluc）和萤火虫（Fluc）荧光素酶编码序列。在进一步使用之前，对本研究中使用的所有结构进行排序以确认其真实性。
瞬时转染和荧光素酶报告分析
HEK293细胞接种在24孔组织培养板（2.5×10）的每个孔中5细胞/孔）（TPP-AG，Trasadingen），并用每个质粒构建物（0.5µg）和携带雷尼利亚荧光素酶作为内部控制。用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行转染。将细胞培养24小时，并通过添加100µl报告裂解缓冲液（荧光素酶检测系统；Promega）收集细胞。萤火虫的活动雷尼利亚细胞裂解液中的荧光素酶是使用双荧光素报告酶分析系统（Promega）和特纳生物系统公司的TD20/20光度计测量的。使用β-半乳糖苷酶测定系统（Promega）测定β-半乳糖苷酶活性。荧光素酶活性归一化为β-半乳糖苷酶活性。结果是相对于由空启动子驱动的归一化发光给出的，并随着倍数的增加而报告。联合转染靶向雷尼利亚荧光素酶编码区、双顺反子报告质粒500ng和30pmol雷尼利亚使用Lipofectamine 2000转染荧光素酶siRNA（Dharmacon，Lafayette，CO，USA）。所有实验均一式三份，并独立进行至少三次。
核糖体复合物下拉分析
为了研究翻译活性，使用了核糖体复合物下拉分析(33). 简单地说，将环己酰亚胺（CHX）（100µg/ml）和甲醛（1%）添加到HEK293细胞中。五分钟后，在磷酸盐缓冲液中收集细胞，然后造粒并悬浮在裂解缓冲液中（10 mM HEPES，100 mM KCl，5 mM MgCl2、1%Triton-X 100、0.5%脱氧胆酸钠、10 U/ml RNaseOUT、100µg/ml CHX和1×蛋白酶抑制剂混合物）。将细胞置于冰上10分钟，将裂解液以8000 rpm离心10分钟，并将上清液保存为细胞质裂解液。将核糖体蛋白S6抗体（2µg）（Santa Cruz Biotechnology）添加到200µg细胞质裂解液中，并在4°C下培养过夜。将蛋白A/G琼脂糖（Sigma）添加到混合物中，以拉下核糖体复合物。与核糖体复合体结合的mRNA被提取（Qiagen）和反转录（Applied Biosystems）。用实时定量PCR（RT-qPCR）或slot-blot分析进一步分析cDNA。
定量实时PCR
的RT-qPCRFGF9公司β-actin在实时PCR系统（StepOne™；Applied Biosystems）中使用TaqMan分析（应用生物系统）。的级别FGF9公司mRNA用2-ΔΔCt方法并归一化为β-actin的表达水平。
酶联免疫吸附试验
HEK293细胞在六孔板中以等密度放置，并在处理后的每个时间点收集上清液。根据我们之前的研究，总蛋白的浓度通过Bradford法测定，FGF9蛋白通过酶联免疫吸附试验（英国牛津郡R&D Systems）测定(25).
插槽杂交
通过下拉试验分离核糖体相关RNA，然后在室温下进行RNase one（1 U/ul）消化30分钟以去除未结合RNA。核糖体关联RNA制成的cDNA使用随机素标记试剂盒进行生物素标记（Pierce，Rockford，IL，USA）。探针的设计是为了补充整个FGF9公司5'UTR和部分编码序列（补充表S1）。对于slot-blot杂交，使用0.5 M NaOH和1.5 M NaCl等量稀释3.2µg寡聚物，然后通过煮沸变性5-10 min。将样品置于冰上，并通过添加0.5 M Tris和1.5 M氯化钠（pH 8.0）进行中和。将一微克寡聚物探针在带正电荷的尼龙膜上进行槽印迹（Hoefer PR 648槽印迹仪；Thermo Fisher Scientific，新加坡）。使用真空交联（1200 J，2 min）将探针固定在膜上，并在42°C下将膜与生物素标记的cDNA寡核苷酸杂交12–16 h，然后进行信号检测（Pierce）。使用凝胶记录系统（AlphaImager、Alpha Innotech）的点密度函数量化信号强度。
蔗糖颗粒离心和多聚体剖面
在裂解之前，用CHX（100µg/ml，Sigma）预处理细胞5分钟，并收集在含有100µ/ml CHX的磷酸盐缓冲盐水中。所有后续步骤均在4°C下进行。将细胞在含有10mM Tris-HCl、pH 7.4、3mM MgCl的RSB-150缓冲液中在冰上裂解10分钟2、150 mM NaCl、100µg/ml CHX、40µg/ml洋地黄素（Calbiochem，加州圣地亚哥，美国）、20 U/ml RNasin（Promega）和蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Scientific Inc.，德国不来梅）。在冰上孵育后，细胞通过26号针头传代5到6次而被破坏。细胞裂解物在微型离心机中以3000×克2分钟，并在11000×克将样品加载在15–40%蔗糖的线性梯度上15分钟，并在贝克曼SW41转子中以38000 rpm在4°C下离心3小时。离心后，使用分馏系统在254nm处监测多聚体剖面（ISCO，Lincoln，NE，USA）。蔗糖梯度被分成11个亚组分，从1（顶部）到11（底部）。总RNA通过苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀分离。丰富的FGF9公司用RT-qPCR检测单个组分中的β-actin mRNA。翻译效率计算为多核糖体相关的比率FGF9公司或β-actin mRNA（组分7-11）与总mRNA（所有组分）之比。
免疫组织化学
使用抗FGF9（Sigma F1672，1:500）和抗缺氧诱导因子（HIF）-1α（Novus，NB100–105，1:250）抗体进行免疫组织化学染色。免疫组织化学染色程序如前所述(8). 切片用苏木精复染。使用Historquest软件（Tissue Gnostics，维也纳，奥地利）进一步量化HIF-1α和FGF9阳性细胞的图像分析。
临床样本
配对正常和肿瘤标本取自54例结直肠癌（CRC）患者，这些患者在国立成功大学医院接受手术。病理学家对每个肿瘤的分期进行分类并进行组织学确认（补充表S2）。这项研究得到了国家成工大学医学中心临床研究伦理委员会的批准，每个患者都给予了知情同意。
统计分析
所有实验数据均使用GraphPad Prism 5.0（GraphPad-Software，San Diego，CA，USA）进行分析。所有数据均为平均值±标准误差（SEM）。还使用t吨-方差检验或单向分析；纽曼-基尔斯事后的，事后的适当时进行测试。重要性设置为P（P）< 0.05.
结果
缺氧诱导内源性FGF9蛋白合成
为了研究缺氧是否可以调节FGF9的表达，我们测量了在常氧或缺氧条件下培养的HEK293细胞在不同时间点的内源性FGF9 mRNA和蛋白水平。FGF9蛋白水平增加，并在缺氧开始后9小时达到峰值，而正常氧细胞中的水平没有随时间变化(图1A；P（P）< 0.01–0.001). 有趣的是FGF9公司mRNA在缺氧细胞中减少，并且始终低于正常氧细胞(图1B类；P（P）<0.05–0.001）。为了测试低氧的净效应是否归因于翻译效率的增加，将FGF9蛋白水平标准化为同一时间点的mRNA水平。蛋白质与信使核糖核酸的比率在正常氧下36小时内没有变化(图1C；P（P）=0.42），但缺氧细胞中FGF9蛋白水平升高(P（P）< 0.001). 最大比率出现在缺氧治疗后9小时，并至少再维持25小时。这一结果支持了以下观点：缺氧促进的FGF9蛋白合成是由翻译控制介导的。
图1。
FGF9蛋白表达在低氧反应中翻译性增加。(A类和B类)内源性表达水平FGF9公司在不同的时间点测量了HEK293细胞暴露于缺氧或常压时的mRNA（A）和蛋白质（B），并显示出正常化至0小时后的相对增加*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; 和***P（P）<0.005。(C类)FGF9的相对翻译效率以FGF9蛋白/mRNA的比率表示。条形代表平均值±SEM(n个= 3). *P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
人类FGF9公司5'UTR包含翻译调控相关元素
为了研究低氧条件下翻译效率提高的机制，我们首先试图鉴定5’UTR区的序列元件FGF9公司这可能涉及翻译控制。生物信息学分析表明，至少有两种元素，即具有两个潜在起始位点的uORF[uORFs:NCBI登录D14838.1，核苷酸（nt）25和nt 34]和IRES（IRES；D14838.1nt 84-178），位于FGF9公司5英尺UTR(图2A） ●●●●。预测的元素在哺乳动物物种中表现出高度保守的特征，总体相似性>86%。高度保守的序列(图2B） 提示这两种元素在FGF9蛋白合成中具有重要的功能。
图2。
FGF9公司uORF抑制下游编码序列的表达。(A类)对应于5’UTR中uORF和IRES的预测序列元素FGF9公司ATG核苷酸序列是翻译起始密码子。(B类)人类、黑猩猩、猪、大鼠和小鼠的交叉谱比对显示，5’UTR的总体一致性为86%。(C类)pGL3-SV40-5’-UTR-Fluc报告结构的示意图。构建了6个uORF起始（mATGI和mATGII）和终止（mTGA）密码子突变的质粒，2个上游ATG位点（dmATG）的双突变体和1个mTGA碱基缺失突变体（mTGA-infr）。显示了起始密码子和终止密码子的相对位置以及每个突变质粒的碱基组成。(D类)构造的荧光素酶活性如图3将C转染到HEK293细胞中，归一化为pGL3-p，并显示为平均值±SEM(n个= 3). **P（P）<0.01***P（P）< 0.001.
确定是否FGF9公司uORF作为控制FGF9蛋白合成的调节元件发挥作用，使用FGF9公司5'UTR序列。全长FGF9公司5’UTR或uORF突变的5’UTR-被克隆到Fluc基因上游。两个起始密码子和一个终止密码子是点突变的(图2C） ●●●●。结果表明，与野生型相比，起始密码子突变结构的荧光素酶活性增加了一倍(图2D） ●●●●。当两个上游AUG都发生突变（活性增加三倍）时，发现了更强烈的影响。相反，在终止密码子突变的结构中发现了显著的减少，因为这个长mRNA的翻译改变了下游荧光素酶基因的阅读框架(图2D） ●●●●。在这个结构中引入一个额外的碱基缺失，修正了阅读框并恢复了荧光素酶的活性(图2D） ●●●●。这些结果表明FGF9公司可能通过抑制翻译效率降低下游基因的表达(34).
FGF9公司IRES驱动细胞中cap依赖性翻译起始
确定是否预测FGF9公司IRES元素启动cap-independent转换，即FGF9公司将5'UTR或部分5'UTR-（IRES和ΔIRES）克隆到雷尼利亚双报告系统中的荧光素酶（Rluc）和Fluc基因（pRF系列；图3A） ●●●●。Rluc和Fluc的活性分别代表帽依赖性和帽非依赖性的翻译效率。在Rluc基因（phpRF）上游引入一个稳定的RNA发夹（ΔG=−55 kcal/mol），以阻断cap依赖机制中的大多数扫描核糖体，从而确定cap依赖和cap依赖机理对FGF9表达的相对贡献（phpRF系列；图3A） ●●●●。虽然相对Rluc活性（即cap依赖性翻译）在pRF结构和phpRF结构之间没有差异，但与载体对照组相比，在含有IRES的pRF结构中检测到相对Fluc活性（即ap-依赖性翻译(图3B、，P（P）pRF-FL<0.05，pRF-IRES<0.01）。当发夹结构减少cap依赖性翻译时，在phpRF结构中的影响更大(图3B、，P（P）phpR-FL<0.01，phpR-IRES<0.001）。然而，当没有FGF9公司结构中的IRES序列（pR-ΔIRES和phpR-△IRES；图3B） 。为了计算IRES活性，Fluc活性被归一化为Rluc活性，并表示为相对于空载体（pRF和phpRF；图3C） ●●●●。
图3。
的IRESFGF9公司通过cap依赖性翻译调节FGF9蛋白表达。(A类)双报告结构的示意图表示包含功能梯度95’UTR、IRES或ΔIRES。使用了在Rluc编码序列上游5'处具有（phpRF）和不具有（pRF）额外发夹环结构的双顺反子系统。(B类)萤火虫（白色方块）和雷尼利亚（黑方）荧光素酶显示为pRF标准化后的倍数增加。条形图表示平均值±SEM(n个= 3). *P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; 和***P（P）< 0.001. (C类)相对IRES活性通过Fluc/Rluc的比率计算，并表示为空载体（pRF或phpRF）的倍增。条形代表平均值±SEM(n个= 3). **P（P）<0.01***P（P）< 0.001. (D类). 抑制萤火虫和雷尼利亚Rluc siRNA（黑方块）共转染的荧光素酶活性显示为标准化pRF（白方块）的倍增。条形图表示平均值±SEM(n个= 3). ***P（P）< 0.001. (E类)抑制萤火虫和雷尼利亚通过共同转染Rluc siRNA（黑方块）的荧光素酶活性显示为通过归一化为pRF-FL（白方块）的倍增。条形图表示平均值±SEM(n个= 3). ***P（P）< 0.001. 萤火虫荧光素酶活性和雷尼利亚荧光素酶显示，这两种酶都来自相同的双顺反子mRNA。
为了测试细胞中萤火虫荧光素酶蛋白的存在是否通过双顺反子构建物的IRES翻译，我们使用siRNA靶向雷尼利亚敲低Rluc活性的编码区(35). 理论上，如果Fluc是从同一份转录本翻译过来的，那么它会按比例减少，但如果是从单独的转录本派生出来的，则不会受到影响。双顺反子结构pRF共转染细胞内(图3D） 或pRF-FL(图3E） 和雷尼利亚siRNA，我们发现Fluc的减少与雷尼利亚荧光素酶，这表明这两种酶都是从同一双顺反子mRNA翻译而来的。总的来说，这些数据表明功能梯度95'UTR是一个功能元素，可以提高翻译效率在体外.
缺氧诱导IRES介导的FGF9公司信使核糖核酸
为了确定IRES活性升高是否会增加低氧时FGF9蛋白的合成，我们首先使用含或不含FGF9-IRES的结构物测量低氧时的报告活性。缺氧6小时后，报告者检测显示，含有IRES的构建物中Fluc活性增加，但IRES缺失的构建物没有变化(图4A；P（P）< 0.001). 低氧条件下荧光素酶活性与正常氧条件下的荧光素酶活性标准化，以表示相对低氧诱导的翻译(图4B） 。有趣的是，转染含有FGF9-uORF基序的ΔIRES构建物的细胞表明，缺氧条件下不会诱导该mRNA的表达。这意味着FGF9-uORF不受缺氧影响。全长（Wt）和双上游AUG突变体（dmATG）构建物中的荧光素酶活性在缺氧和常压下均未表现出可检测到的差异（补充图S1），这支持了这些结果。综上所述，这些数据表明缺氧诱导FGF9公司IRES活动体外试验。
图4。
FGF9公司IRES在缺氧时被激活。(A类)缺氧诱导IRES介导的FGF9公司HEK293细胞中的mRNA。Reporter用全长构造FGF9公司5’UTR（FL；左），FGF9公司IRES（IRES；中间）和FGF9公司无IRES基序的5’UTR序列（ΔIRES；右）在常氧（白色方块）或缺氧（黑色方块）条件下转染HEK293细胞，荧光素酶活性在0 h归一化为常氧时的相对倍数增加。条形代表平均值±SEM(n个= 3). ***P（P）< 0.001. (B类)中显示的构造图4A在HEK293细胞系中表达。在转染后24小时以及缺氧和常压暴露的不同时间点测量Fluc活性。条形代表平均值±SEM(n个=3）在0小时时，随着FL的折叠增加*P（P）< 0.05; ***P（P）< 0.001. (C类)在Fluc构建的转染细胞中，使用S6-IP来降低核糖体mRNA复合物。使用RT-qPCR定量S6-IP富集的mRNA水平，并表示为翻译效率。条形代表平均值±SEM(n个=3）随着FL的折叠增加**P（P）<0.01***P（P）<0.001。(D类)多聚体相关转录物FGF9公司或β-肌动蛋白用RT-qPCR定量。翻译效率FGF9公司低氧暴露的β-肌动蛋白在正常氧下的转化效率正常化(n个= 3). *P（P）< 0.05.
为了排除缺氧期间FGF9表达增加是由于蛋白质稳定性的可能性，我们使用核糖体复合物下拉S6抗体测试翻译活性，然后进行RT-qPCR分析(25). 这些程序表明缺氧增加了核糖体结合FGF9公司含FL的mRNA增加1.1倍(P（P）<0.05）和1.3倍（在含有IRES的细胞中(P（P）<0.01），而下拉没有差异FGF9公司转染缺乏IRES质粒的细胞中常氧和缺氧之间的mRNA（ΔIRES；图4C） ●●●●。接下来，我们进行了15–40%蔗糖梯度分馏连续分析，以测量在常氧和缺氧条件下多胞体组分中特异性mRNA的分布。翻译效率以多聚体相关mRNA的百分比计算，然后通过RT-qPCR检测特定mRNA的水平（补充图S2）。与前面章节的结果一致，多糖体分析显示FGF9公司mRNA在缺氧期间从36.6%增加到48.1%(P（P）=0.03；图4D、 左），而β-actin mRNA的翻译效率没有改变，甚至略有下降(图4D、 右侧）。总之，这些数据证实，缺氧通过增加IRES激活的翻译效率促进FGF9蛋白表达。
低氧诱导的翻译开关促进FGF9蛋白表达
为了确定FGF9表达翻译调控的机制，并研究对FGF9翻译有明显相反影响的两种功能元件的生物学意义，我们通过免疫沉淀核糖体-mRNA复合物，然后用核糖核酸酶消化未保护区域，改进了传统的核糖体分析程序。然后纯化受保护的RNA片段，并使用斑点杂交进行检测。杂交中使用的10个互补探针设计用于覆盖FGF9公司5’UTR和部分编码序列(图5A） ●●●●。slot-blot显示核糖体与uORF的起始密码子结合FGF9公司常氧和缺氧条件下的编码序列（CDS）(图5B和补充图S3）。虽然核糖体结合RNA在uORF起始密码子位置显著减少，但在CDS起始密码子的位置（插槽2和8，图5B和C；P（P）< 0.001). 在FGF9公司CDS在常压下，可能通过再激发机制（插槽9和10；图5B、 顶部）。值得注意的是，尽管由于组间差异较大，核糖体结合RNA水平没有达到统计学意义，但缺氧后CDS区域的核糖体连接RNA水平较高（第9和第10时隙；图5B和C）。这些数据强烈表明，在缺氧期间，核糖体启动复合物从uORF转换为IRES的机制，从而促进翻译活性并增加FGF9蛋白表达。
图5。
缺氧诱导FGF9翻译。(A类)探针位置示意图FGF9公司5'UTR和部分CDS，用于slot-plot杂交。(B类)纯化缺氧或常压下细胞的保护性RNA片段，并通过斑点杂交检测。“+”和“−”分别是来自β-actin 5’UTR和FGF9 3’UTR探针的信号，在本研究中用作阳性和阴性对照。(C类)条形图表示平均值±SEM(n个=4）点密度定量图5B*P（P）<0.05。这表明FGF9的翻译效率在缺氧时增加。
FGF9蛋白在结肠癌中过表达，而不是mRNA
为了探讨低氧调节FGF9翻译开关的生物学意义，我们评估了FGF9公司RT-qPCR和免疫组织化学染色分别检测40对正常和癌变结肠组织中的mRNA和蛋白表达（补充表S2）。与正常细胞相比，癌细胞中FGF9蛋白水平显著升高(图6A） ●●●●。相比之下FGF9公司mRNA在正常细胞和癌细胞之间没有差异(图6B） 。为了证明结肠癌细胞中FGF9蛋白的升高是由于低氧介导的翻译上调所致，我们在相同的40对样本中对缺氧细胞标记物HIF-1α进行染色，发现HIF-1在结肠癌细胞内上调(图6C） ●●●●。相关分析表明FGF9水平与HIF-1α水平呈正相关(图6D、，R（右）= 0.758,P（P）<0.0001），表明低氧诱导结肠癌细胞中FGF9的异常表达。虽然临床病理分析显示FGF9蛋白水平与疾病分期无关（数据未显示），但我们确实发现，在同一患者的原发性肝转移性CRC中，FGF9的表达显著高于复发性肝转移CRC(图6E、，P（P）< 0.01). 总之，这些结果表明FGF9通常在结肠癌细胞中过度表达，并提示FGF9介导的信号传导是CRC肿瘤发生的重要机制。
图6。
FGF9蛋白在结肠癌中上调，并与HIF-1α水平相关。(A类)左：典型图像显示配对的人类正常结肠组织（Nor）和结肠癌（Ca）中的免疫反应性FGF9蛋白。右：54对正常（Nor）和癌症样本中FGF9阳性细胞的百分比***P（P）< 0.0001. (B类)FGF9公司通过RT-qPCR对正常结肠组织（Nor）和结肠癌中的mRNA进行定量(n个=40），归一化为18S核糖体RNA，并表示为与18S的比值。数据以平均值±扫描电镜表示(C类)左：典型图像显示配对的人类正常结肠组织（Nor）和结肠癌（Ca）中的免疫反应性HIF-1α蛋白。右：54对正常（Nor）和癌症样本中HIF-1α阳性细胞的百分比***P（P）< 0.0001. (D类)显示正常和癌症样本中FGF9阳性和HIF-1α阳性细胞百分比之间的相关性(n个= 54).R（右）= 0.758,P（P）< 0.0001. (E类)左：代表性图像显示人类结肠癌和肝转移结肠癌细胞中的免疫反应性FGF9蛋白。一： 原发性结肠癌，Ⅱ：原发性结肠癌肝转移；三： 复发性结肠癌肝转移；四： 正常肝脏作为阴性对照，比例尺=100μm。右：癌细胞中相对FGF9蛋白表达（按HIF-1α表达水平标准化）。数据来自3例D期CRC患者，这些患者有原发性肝转移和复发性肝转移的肿瘤组织。结肠：原发结肠癌，肝转移：原发性结肠癌肝转移，肝复发：复发性结肠癌肝癌转移**P（P）< 0.01.
讨论
FGF9是一种强大的有丝分裂原，参与许多生理过程。尽管我们和其他人之前的研究表明(22,23)和转录后水平(24,25)FGF9蛋白在各种癌细胞（17–20）中经常被观察到过度表达。虽然已知FGF9的异常表达可促进包括结肠癌（36-38）在内的许多癌症的进展，但FGF9蛋白在癌细胞中升高的机制尚不清楚。由于翻译控制为细胞提供了可塑性和灵活性，以应对环境的快速变化，我们假设FGF9蛋白的增加是由于癌细胞对微环境变化（即缺氧）的反应。在本研究中，我们发现FGF9的表达通常由uORF介导的翻译抑制控制，以保持低水平的蛋白质合成；但通过转换到IRES依赖的翻译控制，在低氧应激反应中上调。我们的发现证明了一种分子机制，可以解释结肠癌细胞中FGF9蛋白的异常表达，而不是mRNA的异常表达。然而，应该注意的是，非癌细胞系用于在体外本研究中的分析不能完全排除其他机制的参与。
大约50%的mRNA被预测为uORF调节(39). 事实上，包含20 383 uORF基序的93 205’UTR目前位于UTRdb中(网址：http://utrdb.ba.itb.cnr.it/). 尽管uORF在结构特征和监管功能上都极为不同(40)，uORF通过建立扫描起始前核糖体的屏障，在介导主要蛋白编码序列的翻译抑制中的功能是众所周知的，并已在约100个真核转录物中进行了实验验证(41). 另一方面，已知IRES与特定的交易因子相互作用，在特定的生理条件和应激（例如，凋亡、细胞周期、分化、缺氧、氧化应激和ER应激）下，进行cap依赖性翻译启动蛋白质合成（42–44）。米切尔等。(45)估计约10%的mRNA在其5'UTR中含有IRES。此外，IRES在癌基因和其他参与细胞生长和分化控制的基因中很常见(26,34,46). 综上所述，这些研究表明，当细胞处于应激状态时，依赖IRES的翻译对调节蛋白质表达至关重要。
大量证据表明，许多含有uORF和IRES元件的基因参与细胞生长和分化，如血小板衍生生长因子(47)，血管内皮生长因子A(VEGFA（血管内皮生长因子）) (48),GATA-6协议(49)和精氨酸/赖氨酸转运蛋白(第1类) (50). 此外，在8231个含有5'UTR的IRES中，一半以上（4423,53.7%）与uORF基序相关（补充表S3；UTRdb数据）。尽管潜在的机制尚不清楚，但大量的关联性指出了结合两种不同的调控机制来控制蛋白质合成的重要性。费尔南德斯等。(50)表明诱导Cat-1表达需要在第1类IRES打开抑制性“拉链”结构并诱导IRES活性。此外，IRES中的uORFVEGFA（血管内皮生长因子）(48)和GATA-6协议(49)控制来自给定基因生成的普通mRNA的特定蛋白亚型的表达。我们怀疑这两个元素之间的距离在5'UTR内可能会导致不同的结果。例如，嵌入IRES区域的uORF（例如。第1类和VEGFA（血管内皮生长因子）)以及位于IRES上游的uORF（例如。FGF9公司)表现出不同的行为。前者的调节机制已经阐明，其中uORF的表达需要诱导IRES介导的特定mRNA翻译。我们的研究提供了这种关联的另一个例子。我们的研究结果清楚地表明FGF9公司mRNA通常通过uORF翻译以保持低水平的蛋白质合成。在缺氧等特定环境条件下，通过激活FGF9-IRES实现FGF9的高水平表达，核糖体从uORF的ATG转换为FGF9主要CDS的ATG。因此，数据提示了一种新的模型，即这两种元素在FGF9翻译控制中发挥相反的作用，以微调常氧或缺氧条件下FGF9的表达水平。
众所周知，低氧诱导的能量耗竭通过ATP-依赖性和(51)与ATP无关(52)流程。计算预测表明FGF9 5’UTR的结构是动态的（补充图S4），并表明其构象发生了变化FGF9公司缺氧可能会触发IRES。我们提出了一个缺氧介导的动态诱导模型，以解释FGF9-IRES在FGF9蛋白翻译中“开启”和“关闭”的机制(图7). 我们的模型表明，FGF9-IRES的功能是作为一个细胞RNA开关，感知缺氧触发的低能信号。FGF9-IRES的构象变化吸引了细胞IRES交易因子（ITAF）在其上的结合，进一步稳定了IRES结构，并支持有效的核糖体募集以启动IRES介导的翻译(53). 快速检查已知FGF2 ITAF，hnRNPA1(54)，在FGF9-IRES上没有表现出结合活性（补充图S5），数据表明一种未知的ITAF与FGF9-IR相互作用，并在缺氧应激下控制其表达。由于预计4000个mRNA的5'UTR中同时含有uORF和IRES，RNA开关可能代表了在不断变化的环境中控制蛋白质合成的常见机制。尽管该模型听起来很有希望，但还需要进一步研究以确定IRES结合起始复合物的结构，并寻找特定的ITAF，以确定其构象和相互作用。
图7。
缺氧条件下IRES介导的翻译转换模型。(A–C)正常氧条件下的翻译-延伸构象可通过uORF介导的泄漏翻译实现基础FGF9蛋白的表达。(C类和D类)在缺氧条件下，能量消耗导致FGF9公司mRNA。在FGF9公司IRES结构并促进FGF9蛋白表达（D）。
缺氧抑制经典cap依赖性翻译；因此，具有重要生理功能的转录物需要通过启动IRES依赖性翻译(44)或真核生物翻译起始因子4E2（eIF4E2）依赖方式(55). 为了防止缺氧和凋亡，向血管生成表型的转变是肿瘤生长和肿瘤进展的基本决定因素。因此，缺氧介导的翻译开关似乎是癌细胞在不利条件下生存的重要机制。由于FGF9是一种有效的有丝分裂原和生存因子，诱导其表达为癌细胞在缺氧等不利条件下生存和增殖提供了关键因素。一种类似的机制也被报道用于上调VEGFA（血管内皮生长因子）(56),HIF1-α（57）和功能梯度2(58). 有趣的是，这些低氧诱导的IRES依赖性翻译蛋白的过度表达与癌症恶性相关。综上所述，这些数据表明，缺氧引起的能量耗竭通过IRES的形成选择性地促进翻译转换。最近，有报道称，在IRES介导的设计中，人工核糖开关通过存在特定配体（ON）或不存在配体（OFF）来控制翻译(59). 类似类型的生物传感器可用于控制肿瘤发生过程中异常低氧诱导的IRES介导的翻译。我们相信这将为未来的癌症干预带来新的抗肿瘤治疗和策略。
补充数据
补充数据可在NAR Online上获得。
基金
开放获取费用的资金来源：台湾国家科学委员会[NSC 101-2320-B-006-017-MY2 to H.S.S.]和[NSC 101-2325-B-006-017 to S.J.T.]。
利益冲突声明。未声明。
致谢
作者对国立成工大学生物信息学核心和国立成工学院医院临床医学研究中心人类生物银行分别在计算分析和CRC样本方面提供的帮助表示高度赞赏。他们还感谢蔡健杰博士、萧亚春女士和叶慧娴女士协助图像采集和分析，感谢伊恩·布鲁斯博士批判性阅读和编辑手稿。
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