rAAV衣壳突变体消除用于同源重组的DNA供体模板的漏表达

摘要

通过结合CRISPR/Cas系统和重组腺相关病毒（rAAV）提供的同源定向修复（HDR）供体模板进行精确的基因组编辑是一种强有力的方法。然而，有效抑制rAAV载体泄漏转录的挑战仍然存在，这是一种与细胞毒性相关的现象。在这项研究中，我们证明了各种同源臂和反向末端重复序列（ITR）的启动子活性显著。为了解决这个问题，我们发现了一种新的rAAV变体Y704T，它不仅产生高矢量量，而且有效抑制顺式由强健的启动子驱动的mRNA转录。Y704T变异体在受体相互作用、细胞内运输、核进入、脱膜和第二链合成中保持正常功能，同时在转录中表现出特异性缺陷。重要的是，这种抑制作用与ITR、启动子类型和RNA聚合酶无关。机制研究揭示了含缬氨酸蛋白（VCP/p97）参与衣壳介导的转录抑制。值得注意的是，Y704T变体在不影响DNA复制能力和同源重组效率的情况下提供HDR供体模板。总之，我们的发现增强了对衣壳蛋白调节转录的理解，并为rAAV-CRISPR/Cas9系统在人类基因治疗中的应用开辟了新途径。

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介绍

CRISPR/Cas作为一种革命性的基因编辑工具的兴起，深刻影响了基因治疗的前景。目前使用CRISPR/Cas的临床试验主要集中于解决各种遗传疾病，如大疱性表皮松解症、神经退行性疾病、听力损失等(1–3). 实现CRISPR/Cas精确编辑的一个重要里程碑是英国和美国批准CasgevyTM治疗镰状细胞病(4).

CRISPR/Cas系统包括Cas核酸酶、合成导向RNA（gRNA）、同源定向修复（HDR）供体模板，通常利用病毒载体传递DNA(5). 该系统面临的一个常见挑战是基因表达的不完全抑制，通常称为“漏表达”。例如，CRISPR干扰（CRISPRi）电路对gRNA的转录泄漏高度敏感，促使反义螯合的发展以减轻其影响(6). 此外，Cas的泄漏表达常常导致不受控制的基因组突变(7). 另一个担忧与供体DNA模板质粒的泄漏表达有关，理想情况下，在没有Cas的情况下，应完全抑制其表达(8). 此外，载体中残留的病毒元件可能通过泄漏表达导致细胞毒性(9). 尽管备受关注，但病毒传递的HDR供体模板泄漏表达的挑战依然存在。

重组腺相关病毒（rAAV）载体的安全性证明已通过全球8种药物的成功部署得到验证(10,11). 因此，rAAV载体被广泛认为是在基因组编辑中传递HDR供体模板的最受欢迎的系统(12). 值得注意的是，携带鸟氨酸转氨酶（OTC）的rAAV8载体被用于纠正新生小鼠的OTC缺乏症(13)和rAAV9载体被用于处理小鼠中的Lama2基因突变，为先天性肌营养不良1A型提供治疗益处(14). 唯一相关的病毒DNA元件是载体基因组末端的反向末端重复序列（ITR）。ITR在基因组复制、包被、单链基因组向转录竞争性双链形式的转换以及rAAV基因组的分子间和分子内同源重组中发挥着关键作用(15,16). 然而，ITR表现出内在转录活性，促进转基因表达在体外和体内(17–19). AAV2 ITR中RNA合成的确切起始位点仍不清楚，建议在核苷酸109和145之间存在潜在位置(18). 特别是Keiser等。(20)确定非人类灵长类动物的小脑毒性与通过rAAV载体传递miRNA有关，并将其归因于ITR启动子活性。

尽管在基于rAAV的基因编辑方面取得了显著进展，但来自载体传递的HDR供体模板的“基因”意外泄漏表达仍然是一个尚未完全解决的挑战。早在2006年，人们就认识到rAAV衣壳内的一个氨基酸残基在载体组装、稳定性和转导中的关键作用(21). Srivastava博士的团队强调了用苯丙氨酸残基（F）取代氨基酸704上的酪氨酸残基的重要性，从而显著增强rAAV的转导(22). 随后，Muzyczka博士的团队提出，相同位置和附近2倍界面的突变可能会影响载体转录(23,24). 在这项研究中，我们研究了rAAV提供的HDR供体模板和进一步工程化的Y704T突变体在不同rAAV衣壳上的mRNA水平。这些衣壳突变体不仅增加了rAAV载体产量，而且在载体-受体相互作用和细胞内运输方面表现出类似的能力。此外，它们通过以下途径显著抑制了载体基因组的转录顺式-监管机制。值得注意的是，我们的研究表明，rAAV-Y704T载体可以有效地消除HDR供体模板中的泄漏表达在体外和体内同时，同源重组效率在体外没有受到影响。这些发现突出了工程化rAAV-Y704T载体的关键作用，证实了它们对提高基因编辑疗法的安全性和有效性的重要贡献。

材料和方法

质粒的构建

为了产生rAAV2的Y704突变体以及rAAV3和rAAV6的Y70 5T和Y70 5F突变体，质粒pAAV2、pAAV3及pAAV6按照制造商的方案，使用中国南京Vazyme的C214-01试剂盒进行了定点突变。使用Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶和两个包含突变位点的部分反向互补引物扩增整个目标载体。随后，扩增产物经过DpnI处理以消化亲本DNA模板，所得DNA片段被循环在体外使用Exnase MultiS酶。使用Sanger测序确定所需的点突变。通过从pAAV载体（pAAV-CMV-hrGFP）中移除CMV启动子和hrGFP表达盒，生成pAAV-FBL-mCherry质粒。将AAVS1-SA-puro片段（由复旦大学生命科学学院王永明教授提供）插入pAAV载体中的反向末端重复序列（ITR）之间，代替CMV-hrGFP盒，构建pAAV-AAVS1-SA-puro质粒。使用含有两种版本ITR的载体生成无CpG的ITR质粒，这些载体是从密苏里大学医学院东升段实验室收到的礼物。构建过程中使用的所有引物均列于补充表S1.

细胞培养

人类胚胎肾细胞系293（HEK293）、上皮癌细胞系HeLa和HeLaRC（HeLa细胞的稳定衍生物，每个细胞含有一到两个rep-cap基因拷贝）购自美国类型培养收藏中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）。人肝癌细胞系Huh7来自中国科学院上海细胞生物学研究所。所有细胞系均在37°C、含5%CO的湿润空气中，在完全的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中培养，补充10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/s）₂.

rAAV载体的生产和纯化

将HEK293细胞接种在15厘米的培养皿中，携带AAV2 ITR的rAAV基因组通过细胞的三重转染进行包装，当它们达到80-90%的融合率时。此过程涉及使用顺式-质粒、包含感兴趣基因的质粒和嵌合包装结构，其中AAV2 rep基因与来自不同AAV血清型的cap基因以及腺病毒辅助质粒融合。用于这三种质粒的DNA量分别为15μg顺式-含有感兴趣基因的质粒和质粒，以及用于嵌合包装构建的30μg(25). 转染72小时后，收集细胞并在RBTMS缓冲液中溶解，然后通过离心去除细胞碎片。通过三轮冻融获得原始载体，然后在37°C下用苯甲酸酶（50 U/ml，美国诺瓦根）消化1 h。随后，使用碘克沙醇梯度离心和离子交换柱色谱法（5 ml HiTrap Q HP，GE Healthcare）纯化rAAV载体。最后，将纯化的载体与PBS交换，并使用具有150K分子量截止值（MWCO）的离心自旋浓缩器进行浓缩。用定量PCR（qPCR）检测纯化rAAV载体株的物理基因组滴度。

DNA和RNA的分离和定量

用PBS清洗细胞一次，然后使用基因组DNA提取试剂盒（中国上海青科）提取基因组DNA。用qPCR测定100 ng总DNA中目标基因的含量。按照制造商的说明，使用TaKaRa MiniBEST通用RNA提取试剂盒（日本TaKaRa）提取RNA。用随机引物反转录cDNA合成后，用qPCR分析100 ng总RNA中目标基因的mRNA水平。对于microRNA 122分析，在反转录期间添加特定的静态环引物。qPCR分析是根据MIQE指南进行的http://rdml.org/miqe.html。qPCR引物列于补充表S2循环条件包括在95°C下进行1分钟的初始步骤，然后使用CFX Connect仪器（Bio-Rad，CA，USA）在95°C下进行40次循环10 s、60°C下进行10 s和72°C下进行10 s。

萤火虫荧光素酶测定

为了进行启动子分析，将携带萤火虫荧光素酶盒上游各种HR臂的质粒转染到接种在12孔板中的HEK293细胞中，每孔1μg质粒。转导72小时后，用PBS清洗细胞一次，并在冰上的细胞裂解缓冲液中裂解30分钟。然后将所得裂解产物与Beyotime Biotechnology（中国上海）的荧光素底物结合，并使用多功能酶标仪（SynergyTM2，BioTek，Winooski，VT，USA）进行分析。

为了评估rAAV-CMV-fluc转导效率，将HEK293细胞接种在96个平板中，并用rAAV载体以5000 vg/细胞的MOI进行转导。检测在转导后72小时进行。

对于BRD4770、CPI-455、5-AZ和DBeQ分析，HeLa细胞接种在96个平板中。第二天，在添加rAAV载体之前，分别用浓度为10μM、15μM、5 mM和3.3μM的BRD4770、CPI-455、5-AZ和DBeQ预处理细胞2 h。rAAV Y704T突变体在50 000 vg/细胞的MOI下转导，而rAAV Y 704F突变体在5000 vg/电池的MOI上转导。转导72小时后进行检测。

流式细胞术

用携带FBL的rAAV1-rAAV10载体转导HEK293细胞-m樱桃色MOI为10000 vg/cell。在另一个实验中，用rAAV2-FBL转导HEK293细胞-m樱桃色10 000 vg/cell或50 000 vg/cell，单独或与Ad5组合使用（MOI=10）。72小时后，收集细胞并悬浮在PBS中。使用Gallios流式细胞仪（BD Biosciences，San Diego，CA，USA）进行流式细胞术分析，以量化m樱桃色-FL3通道中的阳性细胞。使用FlowJo软件（美国俄勒冈州阿什兰市FlowJoLLC）进行数据分析。

将HEK293、Huh7和HeLa细胞接种在96 well板中，所有rAAV载体在10000 vg/细胞的MOI下转导。此外，用rAAV载体分别以2000、20000和20000 vg/cell的MOI处理HEK293细胞。然后收集细胞并将其悬浮在PBS中，并使用Calibur流式细胞仪（美国Beckman Coulter）进行流式细胞术分析，以量化FL1通道中绿色阳性细胞的数量。使用CellQuest™软件（BD Biosciences，San Diego，CA，USA）进行数据分析。

病毒结合、内化、贩运、亚细胞分布和脱外壳研究

为了评估病毒结合，HEK293细胞接种在12孔板中，密度为1×10⁶细胞/孔，实验前24h。细胞在4°C下预冷30分钟，然后用rAAV-CMV转导-绿色荧光粉载体的MOI为5000 vg/细胞，温度为4°C，持续1h。转导后，用冷PBS轻轻清洗细胞三次，以去除未结合的病毒。从细胞中提取基因组DNA，并使用针对绿色荧光粉转基因和宿主β-actin基因。

为了进行病毒内化评估，在去除未结合的病毒后，细胞继续在37°C的温热完全DMEM中培养4小时。然后添加胰蛋白酶以分离细胞表面结合的病毒，然后用PBS进行三次洗涤。如上所述提取并测定基因组DNA。

在病毒贩运研究中，细胞接种在12孔板中，然后与rAAV载体和肝素钠（100μg/ml）的预混料孵育2小时，第二天细胞融合率达到80-90%。在转导后48小时提取基因组DNA。此外，在其他小分子药物实验中，用茉莉花碱内酯（JAS）预处理细胞，5-(N个-乙基-N个-在添加rAAV载体之前，分别以1μM、10μM、200 nM和10μM的浓度对异丙基）氨氯（EIPA）、巴非霉素A1（BFA1）和MG132进行1h的处理。转导48小时后检测到转基因DNA。

为了评估病毒在亚细胞隔室中的分布，在转导前24小时将细胞接种在6孔板中。随后，以5000 vg/细胞的MOI用rAAV载体转导细胞。在5天的转导期后，根据制造商的说明，使用NE-PER试剂盒（美国Thermo Fisher公司）收集细胞质和核组分。用ddH将细胞质部分和细胞核部分分别调节至200μl₂O.随后，这两个组分都进行了qPCR，以量化每个隔室中存在的载体基因组数量。

为了确定未涂布效率，将核部分一分为二。其中一半用苯甲酸酶处理，用于病毒DNA提取，以分离未涂层（DNA酶敏感）基因组。剩下的一半进行了直接病毒DNA提取，以确定细胞核中的病毒基因组总数。通过将前者除以后者来计算细胞核中未包被基因组的百分比。

复制分析

HeLaRC细胞接种在6孔板中，第二天以10 000 vg/细胞的MOI添加rAAV2-Y704T或-Y705F突变体，以及rAAV6-Y705 T或-Y705F突变，添加或不添加Ad5（MOI=10）。同时，将HEK293细胞接种在6孔板中，转染无质粒或含有rep2和cap2的质粒pAAV2，以及携带腺病毒功能的pHelper。16小时后，以10 000 vg/细胞的MOI添加rAAV2-Y704T或-Y704突变体和rAAV6-Y705T或-Y 705F突变体。在转导后72小时收集基因组DNA，并使用针对绿色荧光粉转基因，并使用rAAV基因组上针对CMV启动子的探针进行Southern blot。

为了进行Southern杂交，病毒DNA在50 V的0.8%琼脂糖凝胶上分离6 h。随后，用变性溶液（0.5 N NaOH，1.5 M NaCl）处理凝胶30分钟，然后在中和溶液（1.5 M NaCl，0.5 M Tris–HCl（pH 7.2），1 mM EDTA）中培养两个30分钟。使用毛细管法将DNA转移到尼龙膜（美国GE Health公司）上，并通过紫外线交联固定到膜上。然后将膜与生物素标记的CMV探针杂交，并根据制造商的说明使用试剂盒（Thermo Fisher，USA）进行检测。

蛋白质印迹

使用RIPA缓冲液从细胞中提取总蛋白。将由BCA蛋白检测试剂盒（中国上海贝尤蒂姆生物技术有限公司）测定的等浓度蛋白裂解物与5倍负载缓冲液混合并煮沸5分钟。随后，在7.5%SDS-PAGE凝胶上分离样品，并将其转移到PVDF膜上，如前所述(26). 然后在4°C下将膜与多种主要抗体孵育过夜，包括抗VP（APR B1，1:2000）、抗LaminB1（CST，13435S，1:1000）、抗GAPDH（Origene，TA802519S，1:5000）、抗AAVR（abcam，ab105385，1:1000。随后，用与辣根过氧化物酶结合的二级抗体（山羊抗鼠或兔，Beyotime A0216或A0208，1:5000）孵育细胞膜1小时。最后，使用增强化学发光底物对斑点进行可视化，并使用凝胶Doc XR+系统（美国BioRad）成像。

针对不同细胞系内源性位点的基因组

用携带AAVS1-SA-puro的rAAV6-Y705T或-Y705 F载体转导HEK293和HeLaRC细胞，并用pX601质粒亚转导。在转导后6天从细胞中提取基因组DNA，并进行两轮PCR以估计5′连接的比例。第一轮引物是围绕AAVS1基因中的目标整合位点设计的，而第二轮引物则是分别用于扩增基因组DNA和SA-puro盒中HR臂以外的区域。AAVS1产品的大小为959 bp。

动物

雄性C57BL/6小鼠，年龄4-6周，购自上海思莱克实验动物有限公司，饲养于复旦大学动物生物安全二级设施。复旦大学生命科学学院动物伦理委员会批准了所有动物程序和协议（#2022JS0055）。在最初的动物实验中，含有FBL的rAAV载体-m樱桃色或CMV-绿色荧光粉以2×10的剂量注入小鼠胫骨前肌¹¹或2×10¹⁰使用Hamilton注射器在50μl PBS缓冲液中每TA的vg。给药1个月后，处死小鼠，解剖TA，分析病毒DNA、mRNA和绿色荧光蛋白。在随后的动物实验中，小鼠接受了PBS、rAAV6-Y705T CMV的腹腔注射-流体或rAAV6-Y705F CMV-流体剂量为2×10¹¹在注射后3周获得小鼠的全身生物发光图像。在注射前和注射后三周通过面部静脉穿刺收集血样，并通过离心（3000rpm，RT，10分钟）分离血清。使用Autobio公司的生化试剂盒分析丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶的水平。在第三个动物实验中，小鼠通过尾静脉注射分别以0.22、0.66和1.28μg/g的浓度给予DbeQ。同时，rAAV6-Y705T-CMV-流体以2×10的剂量注入小鼠胫骨前肌¹¹在注射后一个月定量相对mRNA表达水平。

统计分析

数据表示为平均值±标准偏差。使用双尾非配对方法评估两组之间的差异t吨-对三个或更多组进行了单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。使用GraphPad Prism 8.2.1软件（美国加利福尼亚州圣地亚哥GraphPat）进行图形和统计分析。所有实验都是在至少n个=3个生物独立样本。P（P）值<0.05被认为是显著的。P（P） < 0.05 (*),P（P） < 0.01 (**),P（P） < 0.001 (***). ns在统计学上不显著。

结果

rAAV载体传递的HDR供体模板导致漏mRNA表达。

在最初的实验中，我们使用了FBL-m樱桃色-FBL（M）供体构建（图1安培)专门设计用于将mCherry盒与人类纤维蛋白（FBL）基因的最后一个外显子融合，以及m樱桃色只有在成功敲入后才能表达(27). 将不同rAAV血清型的病毒基因组导入HEK293细胞（图1B年，顶部）。即使在没有CRISPR/Cas9切割的情况下，在转基因细胞中也可以从供体DNA模板中检测到泄漏的mRNA表达（图1B年，底部）。rAAV4-M组中观察到的相对较低的mRNA表达可能归因于DNA进入细胞的限制。同时，流式细胞术测定了m樱桃色-阳性细胞，显示0.5–3.3%的红细胞（图1摄氏度).

鉴于5型腺病毒（Ad5）估计在约80%的人群中流行，并且Ad5作为rAAV的辅助病毒发挥着关键作用(28,29)，我们进一步证实了Ad5对HDR供体模板泄漏转基因表达的影响。携带无启动子的rAAV2载体绿色荧光粉基因，a绿色荧光粉由肝癌特异性AFP启动子或普遍存在的CMV启动子驱动的基因被用于转导带有或不带有Ad5的HEK293细胞(补充图S1A). 值得注意的是，在Ad5存在的情况下绿色荧光粉在强健的CMV启动子的驱动下增加了13.51倍。甚至包括绿色荧光粉由AFP启动人或无启动人驱动绿色荧光粉当Ad5存在时，HEK293细胞中的表达量显著增加(补充图S1B). 此外，在存在或不存在Ad5的情况下，用rAAV2-M载体以10000或50000 vg/细胞的MOI转导HEK293细胞，然后用流式细胞术检测红细胞。值得注意的是，即使在没有任何启动子的情况下，Ad5的存在也大大增加了红细胞的百分比，使其超过33%（图一维).

HDR左臂和rAAV2 ITR都有助于泄漏mRNA的生成。

为了阐明启动子活性的起源，我们最初预测了几种常用HDR左臂中的许多转录因子结合位点（TFBS），包括小鼠凝血因子IX（mF9）、人FBL、人AAVS1和人T细胞受体（TCR），如补充图S2之后，我们将单个HDR左臂插入萤火虫荧光素酶pGL3碱性质粒中的基因。很明显，所有四个HDR左臂都启动了波动基因（图1E级，左）。此外，FBL和mF9 HDR左臂启动的mRNA导致检测到萤火虫荧光素酶蛋白表达（图1E级，右侧）。除了HDR左臂外，无启动子的表达绿色荧光粉（G） 还观察到转基因(补充图S1C)，表明ITR的转录活性。为了深入研究这一现象，我们构建了含有无启动子的质粒流体携带或不携带ITR基因，然后转染到HEK293细胞。结果表明，与不含ITR的质粒相比，含ITR质粒转移的转基因mRNA/DNA比率更高（图1楼). 这些发现表明，rAAV载体基因组中的HDR臂和ITR都可能产生泄漏mRNA。

rAAV-Y704T突变载体存在转录缺陷在体外

我们的目的是确定一种能够传递具有转录缺陷的HDR供体模板的载体。为此，我们在rAAV2-CMV的Y704位点引入突变-绿色荧光粉载体，用其他19种氨基酸替代。随后，对绿色荧光水平进行了评估（图2安培)和mRNA（图2B型)在载体转导的HEK293细胞中。尽管过度暴露，但7个突变体仍无法检测到荧光，mRNA表达显示出相应的相关性。在这7个突变体中，rAAV2-Y704T载体显示出最高的生产滴度，这促使了进一步的研究(补充图S3A). 有趣的是，即使rAAV2-Y704T载体的剂量过大，HEK293细胞也显示出转基因表达完全丧失，与rAAV2-VY704F和WT组中观察到的显著转基因表达形成对比（图2摄氏度). 值得注意的是，rAAV2-Y704T载体不仅在HEK293细胞中，而且在Huh7和HeLa细胞中显示了转录缺陷（图二维和补充图S3B).

我们对常见的10种AAV血清型衣壳的氨基酸序列进行了比对，发现除了AAV7外，704位点的氨基酸序列保持不变(补充图S3C). AAV2衣壳中的Y704相当于AAV3和AAV6衣壳的Y705。然后，我们研究了rAAV3-和rAAV6-Y705T载体是否显示出与rAAV2-Y704T载体中观察到的趋势相似的趋势。数据表明，突变其他血清型中保守的Y704位点也会导致转录缺陷（图第二版). 接下来，我们使用单链（ss）和自互补（sc）rAAV血清型载体进行转导分析，每种载体都含有流体基因和a绿色荧光粉基因。如图所示2楼，Y704T突变体抑制了ss和sc载体的表达，而与rAAV血清型无关，这表明Y704T突变体的转录缺陷与rAAV载体的第二链合成无关。另一方面，病毒基因组分析表明，Y704T和Y704F载体向细胞中输送的rAAV基因组数量与WT载体相似（图2G（2G）).

通过对纯化的rAAV6-WT、-Y705T和-Y705 F载体进行SDS-PAGE凝胶电泳和银染，对突变衣壳的结构进行了表征。在所有三个通道中都观察到了尖锐的VP1、VP2和VP3带，表明载体中衣壳的形成类似(补充图S4A). 三种rAAV载体的透射电子显微镜（TEM）图像显示出预期的球状结构，直径为20至26 nm。在仪器提供的分辨率下，未观察到载体之间的形态差异(补充图S4B). 此外，差示扫描荧光法（DSF）检测显示WT、Y705T和Y705F载体具有相似的热稳定性，表明病毒载体的脱膜效率没有变化(补充图S4C).

rAAV-Y704T突变载体消除HDR供体模板中的mRNA在体外和体内

考虑到Y704T突变在使rAAV载体适合传递具有转录缺陷的DNA方面的重要性，我们设计了rAAV2-Y704T和rAAV6-Y705T载体，专门用于传递HDR供体模板。如图所示3A级-顶部，在用携带FBL的rAAV2 WT、-Y704T和-Y704F载体转导HEK293细胞时-m樱桃色-FBL（M），细胞内HDR供体模板的数量没有显著差异。相反，rAAV2-Y704T载体产生的mRNA几乎无法检测到，与rAAV-WT和rAAV2-VY704F载体产生的不同（图3A级-底部）。即使存在Ad5，rAAV2-Y704T载体也会导致HEK293细胞中检测不到的转录（图第3页).

随后，对携带CMV的rAAV2-Y704T和-Y704载体进行了动物研究-绿色荧光粉（G） 肌肉注射给C57BL/6小鼠，剂量为每只小鼠2E10 vg。注射四周后，对转基因肌肉中每个变体的DNA和mRNA水平进行量化。虽然两组之间的DNA水平没有显著差异，但rAAV2-Y704T组的mRNA表达显著降低了四个数量级（图3C公司). 因此，rAAV2-Y704F载体在胫骨前肌（TA）的冷冻切片中产生显著的绿色荧光，而rAAV2-V704T载体的绿色荧光与PBS的绿色荧光相当（图三维). 在第二组小鼠中，携带FBL的rAAV6-Y705T和Y705F载体-m樱桃色-FBL以每只小鼠2E11vg的剂量进行肌肉内给药。观察到类似的结果，在DNA水平上没有差异，但在mRNA水平上有显著差异（图第三方). 在最后一组小鼠中，rAAV6-Y705T-CMV-流体和rAAV6-Y705F-CMV-流体（五十） 给载体注射通过以每只小鼠2E11 vg的剂量向C57BL/6小鼠腹腔注射。的表达式流体随后在注射后三周对活动物进行评估。如图所示第三层rAAV6-Y705T载体在整个小鼠体内的转基因表达量最小，而rAAV6/Y705F载体在肾脏和肠道中的转基因表达强劲。此外，血清ALT和AST水平在各组之间没有显著差异，表明这两种载体的肝毒性有限（图第三代移动通信). 总的来说，这些结果加强了这样一种观点，即传递HDR供体模板的rAAV载体可以产生可检测的mRNA，而Y704T突变体有望减轻这种不良的mRNA表达。

这个顺式-rAAV-Y704T突变衣壳对转录缺陷的调节不依赖于ITR、启动子和RNA聚合酶

我们试图验证rAAV-Y704T载体中封装的DNA的转录能力。为了实现这一目的，我们用pAAV2-Y704T或pAAV2-V704F质粒以及pAAV-CMV转染HEK293细胞-绿色荧光粉和pHelper质粒。在转染后72小时，HEK293细胞的一个子集接受Hirt DNA提取，其中提取的DNA经DpnI处理以消除E大肠杆菌-衍生质粒。然后将纯化的DNA转染回HEK293细胞。有趣的是，我们观察到Y704T和Y704F组的绿色荧光水平相当(补充图S5A和B类). 同时，使用一组单独的HEK293细胞生成rAAV2-Y704T-CMV-绿色荧光粉和rAAV2-Y704F-CMV-绿色荧光粉载体，用于转染HeLaRC细胞和Ad5以促进载体基因组复制。从转导的HeLaRC细胞中提取的Hirt DNA随后被转染到HEK293细胞中。我们再次观察到Y704T和Y704F组的绿色荧光水平相似(补充图S5C和第五天). 此外，从HEK293细胞中提取Hirt DNA，这些细胞被转染pAAV2-Y704T或pAAV2 Y704F质粒以及pAAV-CMV-流体和pHelper质粒。一致地，无论转基因的变化如何，都获得了类似的结果绿色荧光粉到流体(补充图S5E和F类). 所有这些结果共同表明，封装在rAAV-Y704T载体中的DNA能够转录。

我们探索了Y704T突变衣壳是否诱导转录缺陷在trans中值得注意的是，VP1和VP2从AAV2中成功表达瓶盖-wt,-y704吨、和-704f年CMV启动子驱动的基因（图第4页). 这些基因与pAAV-EF1联合转染-绿色荧光粉质粒或与rAAV2-EF1联合转导-绿色荧光粉矢量。令人惊讶的是，rAAV2 Cap-Y704T的VP1和VP2蛋白没有阻碍质粒或病毒载体的转基因表达（图4B类). 接下来是rAAV6-WT-CMV-流体载体与模拟、rAAV6-WT、-Y705T或-Y705 F联合转导-绿色荧光粉矢量。如图所示4摄氏度，表达式流体在所有组中一致，表明完整的rAAV6-Y705F衣壳不会阻碍来自另一个rAAV6载体的转基因表达。为了评估ITR在转录缺陷中的作用，AAV2的WT ITR被两个版本的不含CpG的ITR取代，这两个版本最近由段东生博士的团队设计(30)（图4D（四维）). 结果表明，rAAV-Y704T载体的转录缺陷与ITR无关（图第4页). 此外，我们用一个HCC特异性AFP启动子和另一个普遍存在的强EF1启动子替换了常规CMV启动子。在所有组中都观察到Y704T载体的转录缺陷（图4楼). 此外mir122型由U6 RNA pol III启动子驱动的基因在rAAV2-Y704T和-Y704 F载体中进行了测试（图4G网络). 作为控制mir122型和绿色荧光粉这些基因由另一个载体基因组中的CMV启动子驱动。结果表明，这两种蛋白的表达均受到显著抑制mir122型和绿色荧光粉rAAV2-Y704T载体中的基因（图4小时和我). 综上所述，我们确定rAAV-Y704T衣壳在一个-顺式方式，独立于ITR、启动子和RNA聚合酶。

rAAV-Y704T突变载体与rAAV-WT载体具有相似的感染途径。

我们的目的是研究在Y704T突变体的转录缺陷中起重要作用的载体生命周期中的特定步骤。最初，我们确定无论rAAV血清型如何，rAAV-WT、-Y704T和-Y704-F血清型载体与细胞表面的相互作用及其在细胞内的内化都没有改变（图5A级). 此外，我们建立了一个新的过度表达AAVR的HEK293细胞系，AAVR是大多数rAAV血清型载体的通用受体(31). 用不同的rAAV-CMVp处理这些细胞-绿色荧光粉血清型载体（图5亿). 在载体转导后4 h进行内化分析，并在载体转染后48 h测定转基因表达。很明显，AAVR促进了所有rAAV-Y704T突变体的更高载体DNA进入（图5摄氏度)但未能修复其转录缺陷（图第五天). 其次，我们研究了Y704T突变体感染途径的其他早期步骤。针对每个早期步骤选择了特定的抑制剂，包括受体结合抑制剂肝素、内吞抑制剂茉莉酮内酯和EIPA、内体酸化抑制剂巴非霉素A1（BFA1）和蛋白酶体抑制剂MG132(32). 在载体转导之前，将这些抑制剂应用于处理HEK293细胞。在载体转导48小时后分离并比较rAAV2-Y704T和-Y704-F的细胞内载体基因组。尽管各种抑制剂对rAAV转导有不同的影响，但rAAV2-Y704T和-Y704载体之间没有明显的差异（图第五版). 考虑到BFA1和MG132诱导的载体DNA积累增强，我们还评估了这两组的绿色荧光。不幸的是，rAAV2-Y704T载体的转录缺陷仍未被发现（图5英尺).

VCP/p97系统部分修复了rAAV2-Y704T突变载体的转录缺陷。

为了确保rAAV-Y704T载体的DNA核传递，我们用载体转导HEK293细胞，5天后进行核分离。Western Blot分析证实了细胞核和细胞质分馏的效率，分别使用LaminB1和GAPDH作为核和细胞质标记（图6A级). qPCR分析用于检测细胞核和细胞质部分的载体基因组，显示Y704T和Y704F突变体的基因组分布相似（图6亿). 此外，在Y704T和Y704F突变载体之间的脱膜效率没有观察到显著差异（图6摄氏度). 为了探讨Y704T突变载体的转录缺陷是否与表观遗传变化有关，我们利用BRD4470，一种抑制组蛋白标记H3K9me3和H3K27me3的抑制剂(33,34). 然而，该抑制剂未能增强Y704T突变载体的转导。相反，CPI-455提高了活性组蛋白标记H3K4me3的全球水平(35)，强烈降低rAAV转导（图第6天). 此外，5-氮杂胞苷（5-AZ），一种抑制DNA甲基化的胞苷核苷类似物，适度增加rAAV-Y704F载体的转基因表达，但对rAAV-Y704T载体的转录抑制没有影响（图第六版). 这些数据表明，Y704T载体的转录缺陷不受组蛋白或DNA甲基化的影响。有趣的是，DBeQ是ATP酶缬氨酸相关蛋白（VCP/P97）的一种选择性抑制剂，它显著改善了rAAV-Y704T突变载体介导的转基因表达（图第6页). 同时，它对rAAV-Y704F突变载体介导的转基因表达没有影响。考虑到VCP/P97系统有助于不同病毒的脱膜和复制(36)，我们进一步验证了体内DBeQ对rAAV6-Y705T突变体转录缺陷的影响。用不同剂量的DBeQ尾静脉注射C57BL/6小鼠。同时，将rAAV6-Y705T-CMV-fluc载体注射到小鼠胫骨前肌（TA）。注射后一个月定量的相对mRNA表达表明，0.22μg/g的DBeQ可以显著提高rAAV6-Y704T突变载体的转录体内（图6克).

rAAV-Y704T突变载体传递的DNA可以复制并进行同源重组

为了研究rAAV-Y704T突变载体传递的DNA的功能，我们首先检测了其在AAV基因和Ad5辅助基因存在下的复制能力。HeLaRC细胞，表达AAV代表和帽子用rAAV-Y704T和-Y704F转导基因-绿色荧光粉血清型载体和Ad5（图第7章). 或者，用rAAV-Y704T和-Y704F转导HEK293细胞-绿色荧光粉血清型载体，然后转染含有AAV的pACG2质粒代表和帽子包含基本Ad5基因的基因和pHelper质粒（图7亿). 载体转导72小时后分离HeLaRC和HEK293细胞的Hirt DNA，用qPCR检测rAAV转导DNA的复制水平绿色荧光粉基因。结果表明，所有rAAV的DNA都能成功复制-绿色荧光粉血清型载体。使用CMV探针进行的Southern blot分析进一步证实了这一点，表明来自Y704T和Y704F突变载体的DNA可以在HEK293细胞中存在pACG2和pHelper质粒的情况下复制（图7摄氏度). 随后，考虑到同源重组效率在基因校正中的重要性，我们评估了rAAV6-Y705T和-Y705 F载体传递的供体DNA模板的HR效率。提取基因组DNA并进行PCR检测。我们的研究结果表明，在HeLaRC和HEK293细胞中，rAAV6-Y705T突变载体在AAVS位点产生靶向整合，与rAAV6/Y705F突变载体相比（图第7天). 因此，我们得出的结论是，Y704T突变载体中的DNA已成功地从其亲本衣壳中脱下，能够复制，并且可能是有价值的基因校正应用工具。

讨论

CRISPR/Cas介导的rAAV递送的HDR供体模板的定点整合在基因和细胞治疗方面具有巨大潜力。然而，我们的研究揭示了一个与rAAV传递的HDR供体模板的非预期表达相关的挑战，通常称为“泄漏表达”。这种泄漏在存在AAV辅助病毒（如Ad5）时尤其明显，源于与ITR和同源重组臂相关的非常规启动子活动。以前的研究表明，这种非常规的启动子功能可能会从rAAV载体中产生非预期的蛋白质(37). 最近的调查结果(20)特别强调了由于rAAV感染的非人类灵长类动物大脑中ITR的启动子活性而导致的转基因表达泄漏所产生的神经毒性作用。我们假设，如果HDR供体模板的泄漏产物表现出毒性或引发强烈的免疫反应，那么它们的持续存在可能会对基因治疗和基因编辑的有效性和安全性产生重大影响。我们正在进行的评估旨在深入探讨这一现象，同时也调查Ad5存在的潜在副作用。有关这些发现的全面数据将在我们即将进行的研究中提供。

为了解决泄漏表达的问题，科学家们此前报道了各种策略，通常需要复杂的基因组水平的组件设计(8). 相反，本手稿中提出的方法涉及一个氨基酸Y704的突变，该氨基酸在灵长类动物中除D分支（AAV7）外的所有分支中都是保守的。尽管Y704在结构上位于rAAV2衣壳表面的“死亡区”内，但我们的数据表明，将Y704突变为任何其他氨基酸不会影响载体包装效率。值得注意的是，rAAV6-Y705T载体的熔化温度（Tm）与rAAV6/WT载体的熔点相当，这表明载体的结构稳定性和衣壳脱膜方面的变化最小。以前的报道表明，腺病毒可能通过U2 snRNP复合物影响rAAV载体基因组的转录(38). 然而，在我们的实验中，Y704T载体的转录并没有被Ad5共同感染所挽救。在最近的研究中，一些与转录相关的组蛋白H3化学修饰，如H3K9me3、H3K4me3和H3K27ac，被报道可以增加或减少rAAV传递的DNA，并随后影响转基因的转录(39,40). 然而，在我们的实验中，Y704T突变载体的转录缺陷似乎与这些组蛋白标记和DNA去甲基化无关。需要进一步研究，以探索其他表观遗传调控在Y704T突变载体转录缺陷中的潜在参与。不幸的是，我们的观察表明VCP抑制剂DBeQ显著提高了Y704T突变载体的转基因表达在体外和体内与Y704F突变载体相反。VCP/p97系统发挥着多种细胞功能，包括参与泛素蛋白酶体途径、RNA Pol II翻转介导的转录停滞、DNA双链断裂修复、染色质结构调节等(41–44). 我们的实验排除了蛋白酶体降解的参与，如蛋白酶体抑制剂MG132的使用所证明的，以及RNA Pol II的参与，正如与各种RNA聚合酶相关的启动子的使用所表明的。需要进一步研究VCP/p97系统的其他功能在靶细胞中rAAV-Y704T载体转录缺陷中的潜在作用。

除了rAAV载体的靶细胞外，rAAV病毒载体的产生细胞也面临着泄漏表达的挑战。例如，当重组rAAV载体携带编码细胞毒蛋白的基因以破坏肿瘤细胞时，这些基因在产生细胞（如HEK293）中的泄漏表达显著降低了rAAV的载体产量。然而，工程化rAAV-Y704T载体并不能充分解决这个问题。我们的数据表明，rAAV-Y704T载体的衣壳仅选择性地抑制其自身DNA的转录，而不会影响其他载体或质粒的DNA。在我们的实验中，我们将rAAV2衣壳的Y704位点突变为19个其他氨基酸，并产生相应的rAAV2-突变载体。在整个生产过程中，我们没有观察到任何rAAV突变衣壳对rAAV质粒的转基因表达的抑制作用。因此，有必要筛选rAAV2衣壳文库，并开发一种能够抑制rAAV载体产生细胞系中转基因表达的新型AAV突变衣壳。

总之，我们的研究解决了HDR供体模板泄漏表达的问题，并提出了一种利用工程rAAV-Y704T衣壳载体诱导转录缺陷的潜在策略。这项研究不仅提高了我们对rAAV载体中衣壳介导的转录的理解，而且在各个方面都具有很好的意义，特别是在成本效益生产和最小化免疫反应方面，这是基因治疗领域的关键考虑因素。

数据可用性

本文的基础数据可以在文章及其在线补充材料中找到。应合理要求，可从相应作者处获得支持本研究结果的所有其他数据。

补充数据

补充数据可从NAR Online获取。

致谢

我们感谢惠阳博士（中国科学院神经科学研究所）、王永明博士（中国复旦大学生命科学学院）和段东深博士（美国密苏里大学医学院）慷慨提供FBL-m樱桃色-FBL、AAVS1-EF1和CpG-free ITR质粒。我们衷心感谢谢依林女士和谢金燕（中国复旦大学生命科学学院）的技术支持，感谢冯锡林先生（中国烟台复恒生物科技有限公司）对原稿的建设性批评和校对。

基金

国家重点研发计划[2021YFC2301500 to J.L.，C.L.]；上海市细胞与基因治疗重点项目[23J21901100 to C.L.]；复旦大学遗传工程国家重点实验室开放研究基金项目[SKLGE-2311 to C.L.]；温州市重大科技创新项目【ZY2022001至L.Z.】；C.L.得到了上海大学东方学者[GZ2020001]的支持。开放获取费用资助：国家重点研发计划[2021YFC2301500 to J.L.，C.L.]；上海市细胞与基因治疗重点项目[23J21901100 to C.L.]；复旦大学遗传工程国家重点实验室开放研究基金项目[SKLGE-2311 to C.L.，L.Z.]；温州市重大科技创新项目【ZY2022001至L.Z.】；C.L.由上海大学东方学者资助[GZ2020001]。

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