非模板引物延伸与潜在益生元核苷酸混合物对RNA出现的限制

摘要

RNA在早期地球上的出现可能受到化学和物理过程的影响，这些过程过滤出各种替代核酸。例如，UV光稳定性被认为有利于规范核苷酸的存活。在最近一项关于RNA构建块的益生元合成的提案中，核糖核苷酸与阿拉伯糖核苷酸和苏氨酸核苷酸共享一条共同的途径。因此，我们研究了这些替代核苷酸的2-氨基咪唑活化形式的非模板化引物延伸，以确定第一个寡核苷酸的合成是否偏向于RNA。我们表明，非模板化的引物延伸主要通过5′-5′咪唑桥联二核苷酸发生，与模板定向引物延伸机制相呼应。核糖核苷酸和阿拉伯核苷酸的非模板引物延伸率和产率相当，而苏氨酸的反应性较低。竞争实验证实了对苏氨酸掺入的偏见。在引物末端加入阿拉伯核苷酸可起到链终止剂的作用，并阻止随后的延伸。这些偏差，再加上潜在的选择性益生元合成，以及已知有利于核糖核苷酸结合的模板复制，为从原始寡核苷酸中有效排除阿拉伯核苷酸和苏氨酸提供了一个合理的模型。

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介绍

RNA被认为是原始遗传聚合物的一个有前途的候选者，因为它在编码遗传信息和催化反应方面具有双重作用(1–3). 然而，如何从益生元混合物中提取RNA仍然是一个悬而未决的问题。已经提出了潜在的益生元合成途径，其中核糖核苷酸、阿拉伯糖核苷酸和苏氨酸核苷酸将共享共同的前体(4–6)（图1). 在这些建议的途径中，氰胺和乙醇醛反应生成2-氨基恶唑（2AO），然后与甘油醛反应生成核糖氨基恶唑啉（RAO）和阿拉伯糖氨基恶唑啉（AAO），它们分别是五碳糖核糖核苷和阿拉伯糖嘧啶核苷的前体(4). 虽然核糖和阿拉伯核苷在拟议的合成途径中具有共同的早期步骤，但阿拉伯核苷的合成需要较少的步骤，在更大的pH范围内发生，并且可以在水中进行(5). 2AO可以与第二乙醇醛反应形成苏糖氨基恶唑啉（TAO），它是四碳糖苏氨酸嘧啶核苷的前体(6). 由此产生的嘧啶核苷可以通过磷酸化生成核苷酸(7–9)，然后可以被激活为咪唑啉(10,11). 然后，这些高活性的单核苷酸可以参与非模板聚合，生成寡核苷酸，在随后的非酶模板定向复制反应中用作引物和模板。

活性单核苷酸的非模板聚合已在蒙脱石等矿物表面得到证实(12)也处于冰共晶相(13). 蒙脱石固定寡核苷酸，并能连续添加活化的单核苷酸，从而在没有模板的情况下增加引物的伸长(12). 冰共晶相也会浓缩溶质，实现非模板聚合，而低温会减缓水解(13). 早期对这些过程的研究使用了咪唑活化的单核苷酸。最近的研究表明，2-氨基咪唑（2AI）激活的核苷酸可以增强非酶模板复制(14)因为它们自发形成高度活性的5′-5′咪唑桥联二核苷酸(15)它们是模板定向引物延伸的主要途径的底物(16). 此外，活化基团2AI与核苷酸合成前体2AO共享一条共同的潜在益生元合成途径(17).

在通往RNA世界的途中，活性核苷酸原始池中糖异质性的影响仍然是一个需要解决的主要问题。通过动力学和晶体学研究，模板定向复制化学已被证明有利于RNA合成(18–20). 引物3′末端核苷酸的构象和传入桥联二核苷酸的同一性是模板定向引物延伸动力学的主要决定因素。然而，在产生第一个原始模板所必须发生的非模板反应中，很少研究糖的异质性。如果非模板化反应不受模板结合的限制，那么这种反应是否有选择性？核糖、阿拉伯糖和苏氨酸之间的结构差异会影响它们的反应性，从而形成益生元低聚物的组成吗？我们试图通过与核苷酸底物混合物的竞争实验来模拟这些条件，从而深入了解寡核苷酸产品的可能分布。

在本研究中，我们首先研究了非模板化引物延伸的机制，并确定咪唑啉桥联二核苷酸是最具活性的底物。随后使用2AI-活化的核糖核苷酸、阿拉伯糖核苷酸和苏核苷酸进行的动力学分析表明，核糖核苷酸和阿拉伯糖核苷酸以相似的速度并入生长引物中，而苏核苷酸的反应性较低。然后我们结合这些核苷酸来反映异质的益生元环境，并使用LC-MS研究非模板引物延伸的产物。同样，阿拉伯核苷酸和核糖核苷酸的结合程度相似，而三核苷酸的竞争程度更高。然而，在引物末端掺入阿拉伯核苷酸会阻止进一步的延伸。我们的研究结果表明，在非模板聚合过程中，阿拉伯和苏氨酸的结合存在固有的偏差。

材料和方法

一般信息

材料

试剂和溶剂来自Fischer Scientific、Sigma-Aldrich、Alfa Aesar、Acros Organics，除非另有说明，否则使用时无需进一步净化。RNA和DNA寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies或使用Expedite 8909 DNA/RNA合成器在内部合成。有关寡核苷酸合成的更多信息，请参阅补充数据.

核磁共振（NMR）

¹H和³¹P核磁共振波谱在瓦里安牛津AS-400核磁共振波谱仪上获得（400 MHz用于¹H、 162 MHz用于³¹P） 温度为25°C。¹使用2,2-二甲基-2-硅烷基-5-磺酸钠（DSS）作为内标物（25°C时为0 ppm）参考H NMR光谱。

低分辨率质谱（LRMS）

在分析之前，将所有样品在50%（v/v）乙腈中稀释至200μM。光谱是通过在Esquire 6000质谱仪（Bruker Daltonics）上直接注入获得的，该质谱仪在交替离子模式下工作。

高分辨率液相色谱-质谱（HR-LC-MS）

使用Agilent 1200高效液相色谱（HPLC）和配备二极管阵列检测器的Agilent 6230飞行时间质谱（TOF MS）对洗脱样品进行分离和分析。样品通过IP-RP-HPLC在粒径为3.5μm的100 mm×1 mm（长度×内径）Xbridge C18柱上分离（Waters，Milford，MA）。样品在2.5和15%甲醇和200 mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇中用1.25 mM三乙胺在pH 7.0下洗脱16 min，50°C下流速为0.1 ml/min。样本在239年的阴性模式下进行分析米/z（z）至3200米/z（z）扫描速度为1频谱/s。

2-氨基咪唑活化单核苷酸和5′-5′咪唑桥联二核苷酸的合成与表征

阿拉伯糖鸟苷核苷（araG）磷酸化

吉川方法用于磷酸化araG核苷的5′-羟基(21). 至9-（β）预冷混合物-d日-磷酸三甲酯（OP（OMe）中的阿拉伯呋喃糖基）鸟嘌呤（araG，1当量）_三，相对于核苷0.1 M）添加磷酰氯（POCl_三，4当量）和微量H₂O（7.5μl）。使所得混合物在0°C下搅拌。核苷完全溶解后N、 N个-每隔20分钟逐滴添加二异丙基乙胺（DIPEA，0.5当量）。通过LRMS监测反应。一旦起始材料消失，使用1M三乙胺碳酸氢盐（TEAB，5体积，pH 7.5）的水溶液猝灭反应。使用少量乙腈将淬火后观察到的任何沉淀物重新溶解。使用50 g C18Aq柱通过反相快速色谱纯化产物。在流速为40 ml/min的2 mM TEAB水溶液缓冲液（pH 7.5）中，将所需产物与其他化合物分离，分离体积超过0–15%乙腈的10个色谱柱（CV）。收集含有产物的部分，并在室温下在高真空水平下冻干。9-（β-d日-阿拉伯呋喃糖基）鸟嘌呤单磷酸用于活化，无需进一步纯化。

三色胞苷核苷（tC）磷酸化和去保护

2′-羟基和胺上的苯甲酰保护基团可使3′-羟基选择性磷酸化。反应概述见补充方案S1.共沸干燥（甲苯3×，每个2.5 ml）tC（1当量）和双（2-氰基乙基）-N个,N个-在乙腈（0.1毫升，1.25当量）中滴加5-（乙硫基）-1H-四唑（ETT，2.5当量）在乙腈中的溶液。将混合物搅拌1 h。通过薄层色谱（TLC）监测反应。添加间氯过氧苯甲酸（mCPBA，3.0当量），并将混合物搅拌5分钟，并通过TLC进行监测。用15 ml DCM稀释反应混合物，转移到分液漏斗和10 ml碳酸氢钠水溶液（NaHCO_三)已添加。用二氯甲烷（DCM）提取水层两次，并用盐水清洗组合的有机提取物。用硫酸钠干燥提取物并用旋转蒸发器浓缩。将化合物溶解在0.5 ml水中。添加20 mg mCPBA后，反应混合良好。8 ml氢氧化铵（NH₄然后添加OH）。通过LRMS监测脱保护反应的进展。使用热风枪蒸发氨，然后在旋转蒸发器中浓缩产品。将干燥的化合物溶解在5 ml 200 mM TEAB中，pH值为9，并使用50 g C18Aq柱通过反相快速色谱纯化。在流速为40 ml/min的2 mM TEAB缓冲液（pH 7.5）中，通过10 CV的0–5%乙腈将所需产物与其他化合物分离。收集的馏分通过LRMS测量并冻干以进一步活化。

2-氨基咪唑活化单核苷酸（*N）的合成与表征

NMP的激活遵循先前报告的程序(14). 苏糖胞苷和单磷酸鸟苷（tCMP和tGMP）的活化与上文详述的NMP活化类似，但以下步骤除外：（i）将tCMP或tGMP（1.0当量）、2AI·HCl（10当量）和TPP（0.5当量）悬浮在30ml二甲基亚砜中Ar和（ii）在冻干之前，用1M NaOH将收集的部分pH值调节至9。详细的表征（NMR和HRMS）包括在补充数据.

5′-5′2-氨基咪唑桥联二核苷酸（N*N）的合成与表征

N*N的合成遵循先前报告的方案(22). 详细的表征（NMR和HRMS）包括在补充数据.

水相中的非模板底漆延伸反应和³¹P NMR水解实验

非模板底漆延伸

设计引物是为了避免模板定向引物延伸的可能性。在pH 8.0和50 mM MgCl条件下，对1μM引物、20 mM活化单核苷酸、200 mM HEPES进行非模板引物延伸反应₂在每个时间点，将1μl反应样品加入到19μl含有7M尿素、1×TBE和100mM EDTA的猝灭缓冲液中。

不同末端核苷酸的非模板引物延伸

将引物与7.5倍过量的互补寡核苷酸混合在退火缓冲液中，浓度为最终浓度的2.2倍。含有2.2μM底漆（XJ-FAM-12mer或XJ-15，补充表S1)，16.3μM互补低聚物（XJ-16，补充表S1)在95ºC下加热30 s，然后在热循环机中以0.1ºC/s的速度缓慢冷却至25ºC。然后将退火产物稀释到引物延伸反应缓冲液中，得到最终浓度的1μM引物、7.5μM互补寡核苷酸、200 mM HEPES（pH 8.0）和50 mM MgCl₂.

尿素-PAGE分析

利用荧光团标记的引物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）观察引物延伸。引物长度为12或6核苷酸。在1×TBE凝胶流动缓冲液中，用20%PAGE和7M尿素溶解引物延伸产物。对于使用6聚体引物的延伸反应，使用C18 ZipTip移液管尖端（Millipore，Billerica，MA）通过离子配对反相（IP-RP）纯化对反应进行脱盐，以避免PAGE中的条带弄脏。用100%（v/v）乙腈润湿尖端，并在样品结合之前用100 mM TEAA平衡。用100 mM TEAA进行大量洗涤，然后用LC-MS级水进行洗涤，然后在50%（v/v）乙腈中洗脱。在离心真空浓缩器中干燥洗脱液以去除乙腈，然后在10μl 7 M尿素和1×TBE中重新悬浮以装载样品。增加丙烯酰胺浓度（22%）用于改进较小分子的分离。

使用Amersham Typhoon RGB生物分子成像仪（GE Healthcare Life Sciences）对凝胶进行扫描，以可视化荧光标记的引物和延伸引物带。使用ImageQuant TL软件量化相对谱带强度。延伸率由数据的线性最小二乘拟合确定。

³¹P NMR水解实验

水解实验在活性物质（活性单核苷酸或桥联二核苷酸）、50 mM MgCl的各自浓度下进行₂，200 mM HEPES，pH 8.0，10%（v/v）D₂O、 在室温下培养。产生的结果³¹使用MestRNova软件（v14.2.0）处理P NMR光谱。已知溶液中的总核苷酸浓度为20 mM，将核磁共振波谱的峰值积分转换为单个物种的浓度。

自发空气干燥实验、竞争实验和后续LC-MS分析

自然空气干燥实验

在pH 8.0和50 mM MgCl条件下，用20 mM活化的单核苷酸、100μM 6 mer引物、200 mM HEPES制备含有10μl非模板引物延伸反应的PCR管₂。允许反应在环境空气中自然干燥，从而产生清晰的糊状物(补充图S1). 然后，通过在pH 8.0下添加58μl含有100 mM EDTA的淬火缓冲液，在24小时内对反应浆料进行淬火。自然风干显著加快了非模板化引物的延伸，从而产生了足够的引物+1产物，用于后续的LC-MS实验。

互补低聚物存在下的自发空气干燥实验

将引物与7.5倍过量的互补寡核苷酸混合在退火缓冲液中，浓度为最终浓度的2.2倍。含有217μM底漆（XJ-8，补充表S1)，1630μM互补低聚物（XJ-6mer-rc，补充表S1)在95ºC下加热30s，然后在热循环机中以0.1ºC/s的速度缓慢冷却至25ºC。然后将退火产物稀释到引物延伸反应缓冲液中，得到最终浓度的100μM引物、750μM互补寡核苷酸、200 mM HEPES（pH 8.0）和50 mM MgCl₂.

竞争性实验

在竞争实验中，将未标记的引物与活化的核糖核苷酸、阿拉伯核苷酸和苏氨酸按指定比例混合，并自然风干（反应条件如自然风干实验所述）。对于等摩尔混合物（*rC:*araC:*tC=1:1:1），20 mM活化单核苷酸的总量由6.7 mM的*rC、*araC和*tC组成。对于*rC:*araC:*tC=10:1:1的比率，20 mM活化单核苷酸总量由16.7 mM*rC、1.7 mM*araC以及1.7 mM*tC构成。对于图中所示的实验4，引物为XJ-5(补充表S1)和用于图形6是XJ-10(补充表S1).

竞赛实验的初级设计

为了改进LC-MS中的产物分离，我们使用了一个6 nt长的5′-OH引物代替荧光标记引物。在离子对液相色谱法（IP-LC）中，分离是通过带电分子对带电固定相的静电亲和力的差异来实现的(23). 然而，分离相同长度的RNA寡聚物可能具有挑战性。为了分离以核糖、阿拉伯糖或苏氨酸结尾的+1产物，我们使用了总电荷较低的较短的RNA寡聚物。此外，用未标记的引物替换荧光标记引物可以降低总电荷，并改进了相同长度RNA寡聚物与不同末端核苷酸的分离。

LC-MS样品制备

将要进行LC–MS分析的反应混合物在pH 8.0下用100 mM EDTA猝灭。如前所述，将猝灭反应（60μl）分为10μl组分，通过C18 ZipTip吸管尖端（Millipore，Billerica，MA）上的离子配对反相（IP-RP）纯化进行脱盐。将洗脱液合并到HPLC小瓶插入物中，并在离心真空浓缩器中干燥。在注入HR LC-MS之前，将样品重新悬浮在LC-MS级水中。

LC-MS分析

使用安捷伦MassHunter定性分析软件（B.07.00）生成提取的化合物色谱图。对于竞争实验，生成的化合物列表与所有可能的+1非模板引物延伸产物及其盐加合物的计算质量相匹配。相关产品的观察和计算质量见表S2和S3。为了进行此分析，我们假设以不同末端糖结尾的相同长度的低聚物具有等效的电离效率。

结果

非模板化底漆延伸机理

我们假设非模板化引物延伸有两条不同的途径：一条是通过活化单核苷酸的直接反应（图2安培)另一种通过咪唑啉桥联二核苷酸（图2B型). 当引物的末端羟基（3′-OH或2′-HO）攻击激活单核苷酸的磷原子，取代2-氨基咪唑（2AI）作为离开基团时，激活的单核苷酸途径继续进行（图2安培). 相比之下，桥联二核苷酸途径的特征是羟基攻击咪唑桥联二酸的磷原子，取代活化的单核苷酸作为离开基团（图2B型). 这些高活性二核苷酸是由两个活化的单核苷酸反应自发形成的(24,25). 桥联二核苷酸被认为可以驱动模板化非酶复制(16)由于缺乏与模板的稳定碱基对相互作用，它们在非模板引物延伸中的作用尚不清楚。

为了阐明非模板化引物延伸的机制，我们使用活性胞苷单核苷酸（*rC）或5′-5′咪唑啉桥联二核苷酸（rC*rC）对引物延伸反应进行了比较动力学分析（图2摄氏度). 与20 mM预先形成的纯化桥联rC*rC反应迅速开始（图二维)，但随后减速（图第二版)可能是由于水解和接近*rC和rC*rC的稳态平衡混合物。相比之下，与20 mM*rC的反应开始得很慢，但随着时间的推移而加速，这也可能是由于*rC和rC*rC形成了平衡混合物。因为*rC可以自发反应形成桥联二核苷酸就地，我们在含有*rC的反应中添加过量的2AI，以减少桥联二核苷酸的积累(15)导致引物延伸速度持续缓慢（图二维——G公司). 为了获得反应速率与*rC和rC*rC的有效比较，我们首先用20 mM rC*r测量初始速率(k个 = 2.5(1)× 10⁻²小时⁻¹)和20 mM*rC(k个 = 5(2) × 10⁻³小时⁻¹). 为了消除在与*rC反应中rC*rC形成的影响，我们测量了在过量2AI存在下20 mM*rC的反应速率，并观察到更低的延伸速率（<0.2×10⁻³小时⁻¹)（图2楼). 我们观察到与激活的鸟苷核苷酸有类似的反应模式(补充图S2). 桥联二核苷酸在非模板引物延伸中的主要作用从我们的观察中可以明显看出，与桥接二核苷酸形成最少的反应混合物（*rC+2AI）相比，在含有桥联二核酸的反应混合物中（rC*rC和*rC单独），初始反应速率显著提高（图二维,F类). 反应性差异源于桥接二核苷酸不需要离开基团的质子化（图2B型)，而活化的单核苷酸需要质子化(16)（图2安培). 这与它们水解速率的比较一致：rC*rC的水解速率为0.105（7）h⁻¹而在1.96（6）×10时，*rC的水解显著降低⁻³小时⁻¹pH值8.0(补充图S3). 我们进行了非模板引物延伸实验，作为pH值的函数，以确定在较低pH值下增加剩余基团的质子化是否会加快反应速度。我们的结果表明，在pH 7、8和9下，涉及5 mM*rG和25 mM2AI的反应速率为1.9（3）×10⁻⁴, 5.3(6) × 10⁻⁴和8.1（4）×10⁻⁴小时⁻¹分别为(补充图S4). 在较低pH下反应速率的降低可能是由于引物的3′-OH去质子化的减少。

我们通过以下方法跟踪了在引物延伸反应条件下活性单体和桥联二核苷酸随时间的分布³¹核磁共振波谱(补充图S5). 在最初含有20mM桥接二核苷酸的反应混合物中，桥接二核苷酸的浓度由于水解而下降，半衰期为7小时(补充图S3A). 相反，仅用20 mM的*rC引发的反应表明，rC*rC的浓度最初迅速增加，达到约3 mM的预期平衡值，然后在8小时内缓慢下降至2.5 mM。相比之下，20 mM*rC与100 mM 2AI的混合物始终含有<0.25 mM的桥联二核苷酸。在所有情况下，活化单核苷酸的浓度随时间缓慢下降，估计半衰期为～350小时(补充图S3B). 在这些不同的反应混合物中，桥联二核苷酸的浓度与桥接二核苷酸或活性单核苷酸引发的反应中引物延伸的初始速率密切相关。在初始平衡期后，桥联二核苷酸水解为活性单核苷酸和非活性核苷酸单磷酸导致反应速率缓慢下降（图第二版，G）。因此，动力学和核磁共振数据支持桥联二核苷酸是非模板引物延伸的主要底物的结论。

非模板引物延伸与活性核糖、阿拉伯糖和苏核苷酸的比较

鉴于核糖、阿拉伯糖和苏核苷酸可能都是在益生元环境中合成的，我们想评估这些核苷酸类似物之间的内在化学和结构差异是否会影响它们并入寡核苷酸。为了实现这一点，我们分别向引物中添加活性核糖、阿拉伯糖和苏氨酸单核苷酸（*rC、*araC和*tC）（图3A级). 我们使用活性单核苷酸是因为它们自然形成桥联二核苷酸，并且在较长的时间内，它们的反应速度仅略低于纯桥联二核酸(k个 = 4.4(4) × 10⁻³小时⁻¹与1.2（1）×10⁻²小时⁻¹). 使用*rC的非模板引物延伸率在1.9（1）×10时稍快⁻³小时⁻¹比仅使用*araC时观察到的延长率高，为1.5（1）×10⁻³小时⁻¹（图第3页,C类). 然而，*tC没有产生可检测的延伸。活性核糖、阿拉伯糖和苏氨酸单核苷酸（*rG、*araG和*tG）也观察到类似的趋势（图三维——F类). *rG导致最快的延伸率为2.2（1）×10⁻³小时⁻¹紧随其后的是1.8（1）×10的*araG⁻³小时⁻¹.*tG的伸展速度最慢，为3.6（8）×10⁻⁴小时⁻¹，比使用*rG的速度慢约6倍（图3英尺).

阿拉伯核苷酸在结构上与核糖核苷酸相似，唯一的区别是糖2′-OH基团的立体化学。基姆等。(18)结果表明，在引物延伸条件下，这种差异不会影响桥联二核苷酸的稳定性或形成。桥联核糖核苷酸（rA*rA）和阿拉伯核苷酸（araA*araA）的水解速率相似k个=0.31小时⁻¹和k个=0.33小时⁻¹分别是。另一方面，苏氨酸缺乏核糖核苷酸中的5′-亚甲基碳，导致骨架重复单元，即TNA中比RNA中短一个原子。此外，桥联苏氨酸（tC*tC）的形成速率为8.8×10⁻⁴小时⁻¹毫米⁻¹(20)而桥联核糖核苷酸（rC*rC）为4.5×10⁻³小时⁻¹毫米⁻¹(15). 与容易形成5′-5′咪唑桥联核苷酸相比，3′-3′咪唑桥连核苷酸的形成受到空间位阻的阻碍(补充图S6). 这种增加的空间位阻解释了所观察到的桥联苏氨酸形成速率减少5倍的原因。在非模板引物延伸反应中，桥联苏氨酸的形成速度较慢，桥联二核苷酸的稳态水平较低，预计会导致引物延伸速度较慢。

活性核糖、阿拉伯糖和苏氨酸混合物的非模板引物延伸

为了模拟早期地球上可能共存的各种活性核苷酸的化学池，我们继续使用活性核糖、阿拉伯糖和苏氨酸的混合物研究非模板引物延伸的产物。为了分析这些竞争反应的产物分布，我们使用了液相色谱-质谱（LC-MS）。为了区分其他等压核苷酸和阿拉伯核苷酸，我们使用了稳定同位素标记(¹³C、，¹⁵N） 核糖核苷酸。

为了加速本质上缓慢的非模板化反应，我们使用了一种自发的空气干燥方法，该方法减少了观察可观产品收率所需的时间。自然空气干燥是一种益生元似是而非的情况，由环境因素驱动，如温度和湿度的波动、降水和蒸发、昼夜循环以及热液喷口的存在(26). 在益生元化学领域，干涸被广泛用于模拟潜在的益生元条件(7,27). 我们将反应混合物放在工作台顶部的无盖管中，让水蒸发24小时(补充图S1). 通过这种方法，我们在同一组实验中观察到最小的变化(补充图S7). 然而，值得注意的是，由于环境空气的流速和湿度变化，不同实验组之间的差异可能很大(补充表S4). 与封闭系统或水环境相比，早期地球环境的异质性可能提供更多的可变条件(7). 为了最大限度地增加可用于准确LC-MS表征的+1产物数量，我们筛选了一系列用于空气干燥实验的寡核苷酸浓度，并选择100μM作为自发空气干燥和竞争实验的起始浓度(补充图S8).

在竞争实验中加入核糖、阿拉伯糖和苏氨酸

我们检测了在不同比例的核糖核苷酸、阿拉伯糖核苷酸和苏氨酸存在下非模板化引物的延伸，并通过LC-MS分析了引物延伸的产物（图4A级). 在1:1:1比例（*rC:*araC:*tC=1:1:1）的活化单核苷酸混合物中，我们在总化合物色谱图（TCC）中观察到引物和+1产物（图4B类). 为了区分每个单核苷酸的+1延伸产物，我们使用了预期延伸产物的提取复合色谱图（ECC），并用TCC的+1产物区域覆盖它们（图4摄氏度). 我们确认ECC中的每个峰值对应于预期的+1产品(补充表S2). 我们观察到预期的质量荷电比(米/z（z）)不同的+1产物及其盐加合物(补充图S9)证明每个物种都很容易区分。我们计算了观察到的+1产物中每个核苷酸的百分比（图4D（四维）,补充表S4A)显示阿拉伯核苷酸掺入量最高（44.7±3.5%），其次是核糖核苷酸掺入量（30.9±1.1%）和苏氨酸掺入量（24.4±2.5%）。阿拉伯核苷酸的掺入曲线稍高，不太可能与RNA二聚体（prCprC）的形成有关，因为只有微量（初始输入浓度的1%）可通过³¹反应72小时后的P NMR(补充图S10).

我们以10:1:1的比例对*rC、*araC和*tC进行了额外的竞争实验，以模拟益生元合成过程中核糖核苷酸的富集效果（图1). 已经观察到核糖核苷酸的前体核糖氨基恶唑啉（RAO）可以结晶出来，剩下其他氨基恶唑林在溶液中(28). 来自结晶RAO的核苷酸主要是核糖核苷酸。此外，同手性RAO晶体可以通过磁铁矿（Fe_三O（运行）₄)导致手性对称破坏的表面(29). 对映体纯RAO的结晶反过来触发磁铁矿的雪崩磁化，在手性分子和磁铁矿表面之间形成闭合反馈环(30). 或者，可以使用富含对映体的氨基酸通过物理和化学放大过程获得对映体纯RAO(31). 综上所述，这些现象表明，核苷酸的益生元混合物可能在核糖核苷酸中高度富集。因此，我们试图研究益生元混合物化学计量比的变化，尤其是核糖核苷酸的富集，如何影响下游非模板聚合中产物的组成。

在以10:1:1的比例用*rC:*araC:*tC启动的竞争反应中，我们观察到引物、+1和+2产物（图第四版). 通过将+1产品的TCC与预期产品的ECC叠加（图4楼)，我们发现核糖核苷酸掺入率最高（85.8±1.3%），其次是阿拉伯核苷酸（8.4±0.4%），然后是三核苷酸掺入（5.8±1.6%）（图4G网络,补充表S4A). 在+1产物中，结合的核糖核苷酸与阿拉伯核苷酸的比率为～10比1，而苏氨酸结合稍微不受欢迎。对+2产物的分析表明，主要产物是引物，引物延伸了两个rC核苷酸（83.9±1.1%），接着延伸了rC和araC（11.5±1.2%），然后延伸了rC和tC（4.5±0.1%）(补充表S5). 这些结果表明，非模板延伸产物的组成将近似反映活性核糖、阿拉伯糖和苏氨酸单核苷酸的输入比率，对苏氨酸有适度的选择偏差。

内羟基和末端羟基的非模板反应

图中所示的色谱图4在TCC和ECC中都表现出+1产物的双峰模式。为了追踪色谱图中两个峰的起源，我们考虑了RNA低聚物中所有可能的反应位点。核苷酸包含两个主要的亲核基团，其中2′-羟基比3′-羟基更活泼(32,33). 在用活化物种进行非模板引物延伸的过程中，可以形成具有2′-5′和3′-5′磷酸二酯混合键的寡核苷酸。我们首先通过以1:1和1:10的比例从相应的磷酰胺化合物中共注入由末端3′-5′和2′-5′键合成的寡核苷酸，研究了末端3′-5'和2′-5'磷酸二酯键混合物产生双峰模式的可能性。这些末端连接区域异构体无法通过LC-MS进行解析(补充图S11A、B)表明末端区域异构体不是观察到的双峰模式的原因。

为了缩小双峰模式原因的搜索范围，我们对各种引物结构进行了一系列非模板化反应。我们首先通过用5′-己炔基DNA引物和5′-OH DNA引物进行干涸反应来检测引物的5′-OH基团反应的可能性，每个引物都带有末端双脱氧核苷酸。在这两种情况下，LC-MS均未观察到延伸产物(补充图S11C，D). 这一结果表明，两个HPLC峰中至少有一个可能来自内部2′-羟基的反应。

用改良的RNA引物进行的进一步测试证实，RNA寡聚物中的内部2′-OHs可以与活化的核苷酸反应（图第5页-天,补充图S12)，导致双峰模式。以双脱氧胞嘧啶结尾的5′-己炔基RNA引物非模板化产物的TCC和ECC比较(补充图S12B)和一个全RNA 5′-己炔基引物(补充图S12C)表明内羟基和末端羟基都能在自然空气干燥条件下发生反应。实验观察到的内部反应与末端延伸的比率为～1:1.6（图第五天). 因为有五个内部羟基，但只有两个末端羟基(补充图S12A)平均而言，内羟基的反应性必须仅为末端羟基的～25%(补充表S4B，图第五天). 在存在互补短低聚物的情况下，总内羟基反应性降低到21（1）%（图第五版——H（H）)，对应于10（1）%的内部和终端羟基反应性的平均比率(补充表S4B，图5小时). 这一观察结果表明，寡核苷酸的存在会减少内部2′-OH修饰。

引物3′端阿拉伯核苷酸的作用

鉴于竞争实验中RNA引物+1延伸产物中核糖核苷酸和阿拉伯核苷酸的结合水平相当，我们询问阿拉伯核苷酸的加入是否会影响后续延伸。因此，我们测量了以rC或araC结尾的FAM标记RNA引物的非模板引物延伸率。我们在互补RNA低聚物的存在下进行了这些实验，以尽量减少2′-分支产物的形成（图6A级,补充表S1). rC终止引物延伸率为4.1（2）×10⁻³小时⁻¹而终止于araC的引物的延伸几乎无法检测到（图6亿). 因此，将阿拉伯核苷酸并入生长链中会严重阻碍引物的进一步延伸，类似于模板化引物延伸中的链终止效应(18). 基于这一发现，我们可以推断包含两个核苷酸的多核苷酸延伸产物的并入顺序：rC首先并入，araC其次并入延伸+2产物剖面(补充表S5).

5′-己炔基DNA引物与3′-末端核糖核苷酸的竞争实验

为了研究核糖、阿拉伯糖和苏氨酸特异性地非模板添加到引物末端，我们使用5′-己炔基DNA引物与3′-末端核糖核苷酸进行干涸反应，因此只有末端二醇可用于反应（图6摄氏度). 然后我们分析了观察到的+1产品质量(补充表S3). 这个米/z（z）所有+1产物及其盐加合物的图谱都得到了很好的分离，使我们能够区分不同的物种(补充图S13). 从这些LC-MS数据集生成的ECC在与核糖、阿拉伯糖和苏核苷酸掺入相对应的三个+1产物中的任何一个中均未显示出峰加倍模式，输入比率为*rC:*araC:*tC为1:1:1（图第6天,E类)或10:1:1（图第6页,G公司). 与之前的竞争实验中观察到的趋势一致，在1:1:1的输入比下，修改的引物结果还显示核糖核苷酸和阿拉伯核苷酸的结合水平相当（分别为39.0±1.6%和45.0±2.3%）。与之前一样，苏氨酸掺入显著减少（16.1±2.3%）（图第六版,补充表S4C). 为了模拟益生元混合物中核糖核苷酸的富集，我们再次将*rC:*araC:*tC的输入比率更改为10:1:1。在分析结果+1产物时，核糖核苷酸掺入占主导地位（89.2±0.2%），其次是阿拉伯核苷酸（8.3±0.5%），然后是苏氨酸掺入（2.6±0.4%）（图6克,补充表S4C).

讨论

潜在的益生元合成路线表明，核糖核苷酸、阿拉伯糖核苷酸和苏核苷酸可能是在地球早期一起合成的。一旦被激活，这些核苷酸可能会共聚形成低聚物，导致链的异质混合物能够参与模板定向非酶复制反应和潜在的复制循环（图7). 尽管非模板聚合在理解益生元混合物中RNA的出现方面具有重要意义，但这一步骤的研究却很少。我们研究了非模板引物延伸的机制及其与活性核糖、阿拉伯糖和苏氨酸的行为。此外，我们以不同的输入比率对这些活性核苷酸的混合物进行了一锅竞争实验，以模拟益生元混合物的含量，并监测产生的非模板引物延伸产物的组成。

与非酶模板定向复制一致，非模板引物延伸主要通过咪唑桥联二核苷酸发生。我们观察到桥接二核苷酸的非模板引物延伸速度比活化单核苷酸快得多（图2楼,G公司). 桥联二核苷酸的优势离开基团使其成为非模板化和模板化引物延伸的主要底物。实际反应速率随时间变化（图二维,E类)由于从单体形成桥联二核苷酸所需的时间以及桥接二核苷酸的水解速度比活化单体快(补充图S3). 在益生元场景中，非模板化齐聚的程度将在很大程度上取决于环境活化化学的有效性，以及会影响活化和水解的环境因素，如pH和温度。

与单个反应性分析相反，相对于核糖核苷酸，苏核苷酸掺入不受6倍因素的影响（图3英尺)，竞争实验显示对苏氨酸的偏见降低（图4,6). 这种差异的一个可能解释是，在混合物中，异桥二核苷酸如rN*tN和araN*tN*(补充表S6)由于a*tN的2AI部分对*rN或*araN核苷酸的磷酸基团的攻击较少，因此比tN*tN更容易形成。通过减轻苏氨酸的空间拥挤性质，异桥二核苷酸的形成可以促进苏氨酸在非模板反应中的掺入。这种机制与激活下游寡核苷酸加速模板定向引物与苏氨酸延伸的观察结果一致(20).

非模板聚合的区域选择性差导致2′-5′键的显著形成(34). 此外，引物中的内部2′羟基可以与活化的核苷酸反应，形成分支结构（图5). 我们的竞争实验表明，混合核苷酸的共聚将增强糖的异质性（图4,6). 然而，在引物的3′端加入一个阿拉伯核苷酸会盖住链并阻止进一步伸长（图6A、 B），潜在地抑制寡核苷酸的形成，其时间足以显示催化功能。此外，在随后的模板定向复制步骤中，这种初始异构性可能会减少。例如，含有2′-5′键的模板以较低的速率复制，但在产品中没有形成可检测的2′-5′键(35). 类似地，在模板定向复制实验中，阿拉伯和苏氨酸被核糖核苷酸竞争(18,20). 此外，抗核抗体不能与互补抗核抗体形成稳定的双链，与互补RNA序列的配对较弱，这可能导致抗核抗体的进一步偏倚(36–38). 另一方面，一定程度的骨架异质性与RNA折叠成功能结构相兼容，也可能有助于通过降低产物双工体的熔化温度来分离链，从而促进后续的引物延伸周期(39,40). 2′-5′分支RNA结构(41)在生物学上形成RNA剪接的落叶松产物(42)这表明分支RNA也可能具有益生元作用。在存在互补低聚物的情况下，内部2′-OH的反应概率显著降低（图5小时,补充表S4B). 虽然分支产品可能不是传播遗传信息的理想工具，但它们仍然可以作为夹板来帮助模板定向复制(43,44)虚拟循环基因组（VCG）模型下的RNA复制(45).

总之，我们的研究加强了我们对导致从益生元混合物中产生RNA的物理化学选择步骤的理解。不同类型核苷酸混合物的共聚产生的延伸产物大致反映了核苷酸的输入比率。尽管核糖核苷酸和阿拉伯核苷酸的存在实际上减轻了对苏核苷酸的固有偏见，但这一过程导致了对苏氨酸并入的适度偏见。阿拉伯核苷酸与生长链的结合抑制了引物的进一步延伸。因此，在非模板聚合过程中，合成过程中有利于核糖核苷酸的偏倚将被保留，然后在随后的模板定向反应中更强烈地增强(18,20). 在连续的物理和化学步骤中选择有利于核糖核苷酸的组合可能会在连续几轮复制后产生富含RNA的低聚物，为复杂功能RNA序列的进化奠定了基础（图7).

数据可用性

本文的基础数据可在文章及其在线上获得补充材料.

补充数据

补充数据可从NAR Online获取。

致谢

作者感谢John C.Chaput教授提供了三个核苷。我们感谢Victor Lelyveld博士、Harry Aitken博士和Seohyun Chris Kim博士的有益讨论和技术援助。我们感谢Victor Lelyveld博士、Saurja DasGupta博士和Filip Bošković博士对手稿的评论。

基金

J.W.S.是霍华德·休斯医学研究所的研究员；西蒙斯基金会[290363]；国家科学基金会[CHE-2104708 to J.W.S.]。开放获取费用的资金来源：霍华德·休斯医学研究所。

利益冲突声明。未声明。

笔记

现住址：Stephanie J.Zhang，美国马萨诸塞州波士顿芬伍德路60号百翰女子医院病理科，邮编02115。

参考文献