摘要
小RNA(sRNAs)和核糖开关代表不同类别的RNA调节器,它们在感知代谢或环境变化时控制基因表达。虽然sRNAs和核糖开关通过影响mRNA和蛋白质水平来调节基因表达,但现有研究仅限于孤立地描述每个调节系统的特征,这表明sRNA和核糖切换针对不同的mRNA群体。我们报告称btuB(英国)在里面大肠杆菌由腺苷钴胺(AdoCbl)核糖开关调节,也受小RNA OmrA和OmrB(在较小程度上)控制。引人注目的是,我们发现核糖开关和sRNA通过不同的途径降低mRNA水平。我们的数据表明,当核糖开关触发Rho依赖性转录终止时,sRNA依赖于降解体调节mRNA水平。重要的是,OmrA与btuB公司mRNA通过其中心区域,在OmrB中不保守,这表明这两种sRNA除了共同的调节子外,还可能具有特定的靶点。与经典的sRNA调节相反,我们发现OmrA对btuB(英国)使用mRNA结合缺陷的Hfq变体丢失。总之,我们的研究表明核糖开关和sRNA调节btuB(英国)表达式,提供以下示例顺式-和反式-基于RNA的调节系统维持细胞内环境稳定。
介绍
细菌通过调节mRNA和蛋白质水平的基因表达来适应环境变化(1,2). 非编码RNA参与多种细菌调节过程,已被证明是适应性反应的关键因素(2). 其中,核糖开关是RNA调节器,通常位于5′非翻译区(5′UTR),通过结构改变调节基因表达(三,4). 这些代谢结合RNA调节剂在转录终止、翻译起始或mRNA衰变水平上控制基因表达(三). 在一些案例中,与核糖开关结合的代谢物被证明影响多种调节过程,这表明这些RNA元件协调复杂的调节途径。例如,赖氨酸与溶血素C核糖开关通过引导核糖核酸酶E裂解下调基因表达溶血素CmRNA和通过抑制翻译起始(5). 此外溶血素C最近研究表明,核糖开关可以调节Rho依赖的转录终止(6–8)这表明赖氨酸核糖开关可能控制至少三个调节过程,以确保严格的基因调控。另一个涉及基因调控的多种机制的例子也被描述为谷氨酸棒杆菌其中黄素单核苷酸(FMN)核糖开关控制核糖核酸酶E/G裂解活性和Rho依赖性转录终止(9). 虽然这种涉及多种调节因子的复杂系统预计将被细菌大量使用,但很少有研究涉及它们在调节过程中是如何协调的,即,监管活动是否独立进行,或是否需要任何层级秩序来实现及时和适当的监管。
小RNA(sRNAs)是调节元件,经常参与细胞适应反应(2). 与核糖开关相反,sRNAs通常通过与靶向mRNAs的分子间碱基配对来控制基因表达,并可能涉及RNA伴侣,如ProQ或Sm-like蛋白Hfq,以促进mRNA识别(10–13). sRNAs通过识别位于非翻译或编码区的序列来控制转录终止、翻译起始和mRNA降解(2). 由于sRNA通常使用有限的碱基配对互补性结合mRNA序列,这使得给定的sRNA能够调节多个mRNA靶标,从而实现全局调节反应。令人惊讶的是,尽管核糖开关和sRNAs主要通过靶向mRNA非翻译区或早期编码序列来调节基因表达,但缺乏两种效应器控制相同mRNA表达的证据,这意味着sRNAs和核糖开关调节机制可能是相互排斥的,它们可能针对全球不同的mRNA群体。
这个大肠杆菌btuB核糖开关调节调节维生素B等类胡萝卜素内流/外流的BtuB膜转运蛋白的合成12(14,15). 与腺苷钴胺素(AdoCbl)结合后,腺苷钴胺是维生素B的活性形式之一12-AdoCbl核糖开关可防止btuB(英国)通过在干环结构中隔离Shine-Dalgarno(SD)序列来启动翻译(图1安培) (6,16–18岁). 发现编码序列开始时的假定衰减器是转录抑制所必需的(19,20)这表明mRNA水平被抑制是翻译抑制的结果。重要的是,以前的微阵列数据(21)建议btuB公司表达也受到两种高度相似的sRNA的抑制,即OmrA和OmrB,它们的基因在原子吸收光谱和加仑基因间区大肠杆菌(图1安培) (21). 这些sRNA具有几乎相同的5′端和3′端(补充图S1A)并预计会表现出特定的二级结构(补充图S1B). 它们是编码外膜蛋白和参与生物膜形成和细胞运动的蛋白的基因的负调控因子(21–27). 所有先前验证的靶点都是通过OmrA/B保守的5′端区域与其mRNA的结合来调控的。总的来说,OmrA和OmrB似乎对在酸性或高渗压环境中重组细菌表面很重要,即在EnvZ-OmpR双组分系统通过转录控制表达的条件下(21,28,29). 像几个已知的OmrA/B目标,例如cirA公司,f欧洲中央银行和fepA公司,btuB(英国)编码TonB依赖性受体。然而,目前没有任何可用数据表明OmrA和OmrB是否直接或间接监管btuB(英国)表达及其细胞功能如何与AdoCbl核糖开关的调节活性相协调。
![OmrA和OmrB sRNA调节btuB的表达。(A) btuB核糖开关和OmrA/B的基因组位置。左边的插图分别显示了游离或结合到腺苷钴胺(AdoCbl)时的ON和OFF核糖开关状态。虽然OFF状态通过隔离Shine-Dalgarno(SD)区域阻止翻译启动,但ON状态通过形成由反SD(蓝色)和反SD(黄色)序列形成的螺旋来释放SD序列,从而实现高效翻译。OmrA和OmrB分别以红色和蓝色显示。(B–D)表达OmrA或OmrB时btuB mRNA水平的Northern blot分析。实验在大肠杆菌野生型(WT)(B)、Δhfq(C)和rne131(D)菌株中进行。用0.1%阿拉伯糖诱导OmrA或OmrB后,在(0)或(2、5、7和10分钟)前的指定时间提取总RNA。pNM12是这些实验中使用的空矢量控制。使用特定探针检测btuB、OmrA或OmrB。在监测btuB或OmrA/B的表达时,分别使用16S和5S rRNA作为负荷对照。(E) 添加5µM AdoCbl后,对WT、Δhfq和rne131大肠杆菌菌株中btuB mRNA水平进行Northern blot分析。16S rRNA用作负荷对照。](https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/nar/52/10/10.1093_nar_gkae347/1/m_gkae347fig1.jpeg?Expires=1721158029&Signature=ZqqRYkNU3~dUfLRkxdQKxmWLVlh9B-jpLwhTzXjEJ7BV3Y-j9R5lQH4NA8OvdtTByp~j~lw4nufog7bQZUD0lX22yY-bo-AzA0xE09jIkGZ0s132o4kMPVtHCQQx1BqP~6K7sxXO7UhsvHvjZzehySNQ8iihzCq1GS3OJ9cmULb4~dZK1Dxl-h6WS7k35kz7tusOI6BLtwONvYWdYQdAFQvQI9bvjzh0yYJZijySAOmwzTZhK2AsxTVeARIgg3xqZOsO9s4ULlLemVxan8HLqaiVY53piAKvhHrJcP9pXrmwULW2MdPePQXJESJmGxVXjM~1gald-9v0~mH2S73H6Q__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA)
图1。
OmrA和OmrB sRNA调节btuB(英国). (A类)基因组位置btuB(英国)核糖开关和OmrA/B。左边的插图分别显示了游离或结合到腺苷钴胺(AdoCbl)时的开启和关闭核糖开关状态。虽然OFF状态通过隔离Shine-Dalgarno(SD)区域阻止翻译启动,但ON状态通过形成由反SD(蓝色)和反SD(黄色)序列形成的螺旋来释放SD序列,从而实现高效翻译。OmrA和OmrB分别以红色和蓝色显示。(B–D)Northern blot分析btuB(英国)表达OmrA或OmrB时的mRNA水平。实验是在大肠杆菌野生型(WT)(B类),Δhfq(C类)以及内131(D类)菌株。用0.1%阿拉伯糖诱导OmrA或OmrB后,在(0)或(2、5、7和10分钟)前的指定时间提取总RNA。pNM12是这些实验中使用的空矢量控制。使用特定探针检测btuB(英国)、OmrA或OmrB。16S和5S rRNA被用作负荷对照,用于监测btuB(英国)或OmrA/B。(E类)Northern印迹分析btuB(英国)WT中的mRNA水平,Δhfq和rne131大肠杆菌菌株,添加5µM AdoCbl后。16S rRNA用作负荷对照。
在这里,我们描述了AdoCbl核糖开关和OmrA/OmrB对btuB公司表达式。我们的数据表明btuB(英国)通过促进Hfq伴侣与btuB(英国)翻译起始区域。这种sRNA控制btuB(英国)不仅独立于核糖开关调节,而且通过一种独特的机制发生,尽管这两种调节器都主要针对btuB(英国)翻译启动。据我们所知,我们的研究提供了第一个通过核糖开关和sRNA控制实现基因表达调控的机制示例。
材料和方法
细菌菌株和质粒
本研究中使用的细菌菌株和质粒在补充表S1细胞在含有0.2%葡萄糖的M63最小培养基中生长,用于调节AdoCbl浓度的实验(图1和2),在CAG介质中(最低A盐(30),0.5%(w/v)甘油,0.25%(w/v)酪蛋白氨基酸,1 mM MgSO4)用于荧光测量(图5)或其他实验的LB。这些培养基根据需要补充抗生素、AdoCbl、阿拉伯糖或IPTG(参见补充信息详细信息)。
![sRNAs和核糖开关调控依赖于btuB mRNA的不同区域。(A)显示btuB基因的OmrA结合位点(顶部)、翻译(左下)和转录(右下)融合的示意图,包含不同长度的btuB编码区(btuB’)。用阿拉伯糖诱导型(PBAD)或组成型(PLtetO-1)启动子表达这些结构。显示Shine-Dalgarno(SD)和AUG。在OmrA(B)、OmrB(C)或AdoCbl(D)存在的情况下,对翻译(trL)BtuB-LacZ和转录(trX)BtuB-LacZ融合进行(B–D)β-半乳糖苷酶分析。btuB CDS的核苷酸数量表示为每个结构。将数值标准化为在没有sRNA(pBR,空载体)或没有AdoCbl的情况下获得的活性。平均值和标准偏差是从三个独立的实验中获得的。(E) 对不稳定茎P13和P14的选定btuB突变体进行β-半乳糖苷酶分析。在OmrA或AdoCbl存在下,使用BtuB81-LacZ平移融合进行实验。右侧显示了包含茎P13和P14的区域的预测二级结构,并指出了EP1、EP2和EP3突变。SD序列(GGA)和AUG为灰色白色。](https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/nar/52/10/10.1093_nar_gkae347/1/m_gkae347fig2.jpeg?Expires=1721158029&Signature=qkuB7xlMsGZBw5X7YUzdr6Nzv91rJ95hjghz9Kdm0QvLdr0THnOVrPgz2bQSx6wBaWg8p1SdDBvgFBHcIJuAGEmag244DzhaG1XNElEiw08OgvBwWU70~~FIzufqvU6m9OjXmdrV1peraR3VPwzhzeY83yTE7-W40W6SEPixo3LnD23B31LxU~~w-QEjiaXz~2WZnpgXT8RQ44yond-uwG-tuHeMIET441g0Xspkrz~Xx0MeogKBlx9fei1L3qf4G54f3z8YmvB5WBlAkN2XOzS~j~bdrWAFJ3SInAK~RraeVAKuT~RmHk20r5qh0W40NBog120q~kHSkmAvkdtZ6g__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA)
图2。
sRNAs和核糖开关调节依赖于btuB(英国)mRNA。(A类)显示的示意图btuB(英国)OmrA结合位点(顶部)、翻译(左下)和转录(右下)融合的基因,包含不同长度的btuB(英国)编码区(btuB'). 阿拉伯糖诱导物(P坏)或组成型(P左旋-1)启动子用于表达这些结构。显示Shine-Dalgarno(SD)和AUG。翻译(trL)BtuB-LacZ和转录(trX)的(B–D)β-半乳糖苷酶分析btuB-lacZOmrA存在下的融合(B类),OmrB(C类)或AdoCbl(D类). The number of nucleotides of thebtuB(英国)每个构造都指示了CDS。将数值标准化为在没有sRNA(pBR,空载体)或没有AdoCbl的情况下获得的活性。平均值和标准偏差是从三个独立的实验中获得的。(E类)选定的β-半乳糖苷酶测定btuB(英国)突变体破坏茎P13和P14的稳定性。使用BtuB进行实验81-OmrA或AdoCbl存在下的LacZ平移融合。右侧显示了包含茎P13和P14的区域的预测二级结构,并指出了EP1、EP2和EP3突变。SD序列(GGA)和AUG为灰色白色。
基因融合到拉奇或mCarlet汽车利用携带mini-λ-Tet和cat-sacB电缆等位基因上游拉奇或mCarlet汽车基因。这些受体菌株是PM1205(用于构建P坏-被驱动的拉奇融合),MG1508(P左旋-1-被驱动的拉奇保险丝),OK868(P左旋-1-被驱动的拉奇融合在Δ花边::FRT上下文)和OK510(mCarlet汽车融合)。删除omrA公司,omrB公司或者两者都是通过重组卡那霉素抗性盒制造的,nptI标准,进入omr公司位点;这些突变以及Δ高频q和rne131型如有必要,通过P1转导转移等位基因。不同的高频q从D.Schu和N.Majdalani(NIH,Bethesda)获得点突变体,并通过P1转导进行移动,如补充信息.
OmrA和OmrB sRNA由pNM12-或pBRplac衍生物质粒过量产生,其中它们的表达分别在阿拉伯糖或IPTG诱导型启动子的控制下。通过诱变引物扩增,将突变引入pBRplacOmrA质粒,Dpn公司我消化转化为NEB-5lacI公司q个菌株,并对产生的质粒进行测序。
本研究中使用的DNA寡核苷酸序列如下补充表S2.
ß-半乳糖苷酶分析
转录或翻译的β-半乳糖苷酶活性btuB-lacZ从P表达的融合坏启动程序(图2)如前所述,在动力学分析中测量(5). 简单地说,细菌培养物在M63 0.2%甘油最小培养基中培养过夜,并稀释50倍至新鲜培养基中,然后在37°C下培养至OD600结果为0.1。然后添加阿拉伯糖(0.1%)以诱导拉奇构造。当需要时,添加AdoCbl(5μM)和/或IPTG(1 mM)以允许从pBR质粒诱导OmrA/B。使用双环霉素(BCM;25μg/ml)时,在3 ml培养基中进行分析。其他药物的β-半乳糖苷酶活性拉奇融合(图4和补充图S6)使用标准Miller分析进行测量。简单地说,过夜培养物在新鲜LB-Tet-IPTG 100μM培养基中稀释500倍,细胞生长到中指数期。接下来,将200μl等分样品与800μl Z缓冲液混合,并按照前面所述测量活性(31)细胞用氯仿和SDS溶解后。
Northern印迹分析
如前一段所述,使用热酚法从生长至对数中期的细胞中提取总RNA,如(32). 当细胞在LB中生长时,650μl细胞培养物直接与苯酚混合,而在M63或CAG中生长的细胞首先在相同体积的无菌水中再次悬浮,然后与苯酚混合。在一次苯酚/水和两次苯酚/氯仿萃取后,RNA沉淀并重新悬浮在水中。在1%琼脂糖凝胶上分离等量的总RNA,并通过毛细作用转移到Hybond N+(Amersham)膜上以检测btuB(英国)mRNA。为了检测OmrA、OmrB和Spot42 sRNAs,在5%聚丙烯酰胺凝胶上分离总RNA,并将其电泳到Hybond N+膜上。使用放射性标记探针检测btuB(英国)图中的mRNA和OmrA/B sRNA1如中所示(5)图中使用生物素化探针检测OmrA、OmrB或Spot424和5如前所述(25).
mScarlet荧光测定
荧光测量协议详见补充数据和这个mCarlet汽车轨迹如所示补充图S15简单地说,将饱和培养物在200μL CAG培养基中稀释500倍,该培养基补充有四环素和IPTG 250μM,置于底部清晰的96 well深色平板中。然后用50μl矿物油覆盖微孔,在16小时的动力学过程中每12分钟观察一次细菌生长和荧光,其中平板在37°C下培养,在CLARIOstar Plus平板阅读器中以500 rpm的速度摇晃。在600 nm处跟踪吸收率,并使用560 nm的激发波长和600 nm(15 nm带宽)的发射测量荧光。系统地进行了三次测量,并将其归一化为600 nm处的吸光度。Northern blot分析高频q突变体(图第五版和F类),总RNA是从与荧光相同的菌株和生长介质中提取的,但在Erlenmeyer烧瓶中而不是在96 well板中生长到中指数期。
体外转录
体外转录反应如前所述进行(5). 简言之,PCR产物被用作DNA模板,并含有T7 RNA聚合酶启动子。转录反应在37°C下孵育3小时后,用乙醇沉淀RNA产物,并在含有8M尿素的变性8%丙烯酰胺凝胶上纯化。将含有RNA的丙烯酰胺切片在4°C的水中洗脱过夜,然后通过沉淀回收。
醋酸铅探测分析
5′-放射性标记btuB(英国)RNA(相对于AUG从−80到+161)(10 nM)与Hfq浓度增加(0、1、2.5、5、10和20 nM)一起培养。按照之前的描述进行了实验(33).
电泳迁移率变化分析(EMSA)
用于评估btuB公司-Hfq复合物,放射性标记btuB(英国)在蛋白质缓冲液(50 mM Tris–HCl pH 7.5,1 mM EDTA,250 mM NH)中,在没有或存在Hfq六聚体(2.5,5,10,25,50和100 nM)的情况下培养RNA(10 nM)20分钟4Cl和10%甘油)。用于评估btuB(英国)-在蛋白质缓冲液中不存在或存在Hfq(10 nM)的情况下,在37°C下孵育OmrA-Hfq复合物、放射性标记OmrA(10nM)10分钟。然后在37°C下将反应培养20分钟btuB公司Afonyuskin缓冲液中的RNA(10 mM Tris–HCl pH 7.5,5 mM醋酸镁,100 mM NH4Cl和0.5 mM DTT)。EMSA反应在5%天然丙烯酰胺凝胶上在4°C TBE 1×下进行。
Toeprint测定
这个btuB(英国)将RNA(0.5 pmol)与放射性标记DNA(3995JG;10 nM)混合,并在37°C下孵育5分钟。将退火缓冲液添加到反应中并培养5分钟。如有指示,将OmrA(250 nM)和/或Hfq(250 nM)添加到混合物中。接下来,添加30S核糖体亚单位(100 nM)和tRNA-fMet(250 nM),并在37°C下培养10分钟。通过添加dNTPs(每个500μM)和M-MulV-RT(10 U)启动反转录步骤,并在37°C下培养15分钟。反应产物在8%变性聚丙烯酰胺-尿素凝胶上分解。
结果
OmrA/B sRNA和依赖AdoCbl的核糖开关负控制btuB(英国)mRNA水平
研究OmrA/B效应的分子基础btuB(英国)表达,我们首先通过northern blot分析内源性btuB(英国)从使用阿拉伯糖诱导启动子的质粒表达OmrA或OmrB的菌株中的mRNA(P坏). 我们在WTΔ中进行了这些实验高频q和内131突变株,其中最后一株含有缺乏C末端结构域的核糖核酸酶E变异体。这种突变阻止了RNA降解体复合体的组装(34)并被发现强烈降低OmrA/B靶向的几个mRNA的调节(22). 在WT菌株中,OmrA的诱导导致btuB(英国)mRNA水平(图1B年),与之前的微阵列数据一致(21). OmrB的诱导也导致btuB(英国)mRNA(图1B年). 相反,btuB(英国)在Δ高频q(图1摄氏度)以及内131突变菌株(图一维)表明Hfq和RNA降解体对OmrA/B调节btuB公司mRNA水平。值得注意的是,OmrA/B sRNA水平在高频q零应变((22,24),见下文),这可以解释Δ中的监管缺失高频q背景。这些结果表明,OmrA和OmrB在较小程度上减少了btuB(英国)mRNA水平,并依赖Hfq和RNA降解体实现mRNA水平的遗传调控。
先前的研究表明,AdoCbl感应btuB(英国)核糖开关调节两种翻译起始(6,14,17,35)和mRNA水平(14,19). 与此一致,AdoCbl的加入促进了btuB(英国)WT菌株中的mRNA水平(图1E级). 与OmrA/B调节相反,我们发现在Δ高频q或内131突变菌株(图1E级)表明Hfq和降解体不参与核糖开关的调节。这些数据表明,AdoCbl核糖开关依赖于与OmrA/B不同的分子机制来调节btuB(英国)mRNA。使用BtuB-mCarlet荧光报告融合作为btuB(英国)表达式(稍后用图描述5)我们还发现,删除降解体的组成部分3′-5′外核糖核酸酶PNPase的基因,导致OmrA介导的BtuB-mScarlet控制减少,因为抑制作用从WT菌株的2.5倍下降到WT菌株中的1.4倍pnp公司突变体,尽管突变体中的OmrA水平明显增加(补充图S5,面板A–C)。这与其他一些sRNA-依赖性法规对PNPase的已知要求一致(36,37). 相反,1μM或5μM AdoCbl的调节在WT中约为5倍,在pnp公司突变体(补充图S5,面板D–F),从而确认sRNA和核糖开关控制btuB(英国)这是由于不同的机制造成的。
sRNAs和核糖开关调节需要不同区域的btuB公司信使核糖核酸
为了进一步描述btuB(英国)通过OmrA/B,我们接下来采用了平移BtuB-LacZ融合(图2安培看看补充图S2用于构造的详细视图)包含完整的btuB(英国)5′UTR和增加部分btuB(英国)编码序列(CDS)在帧中融合到拉奇这些融合在P坏阿拉伯糖诱导的启动子,以确保观察到的效应不来源于内源性启动子控制。在这些实验中,OmrA/B从带有IPTG诱导启动子的质粒中过度表达。我们的数据显示,OmrA抑制包含81个或更多CDS核苷酸(nt)的翻译融合表达至少50%(图第2页和补充图S3A). 当btuB(英国)使用CDS:BtuB的表达120-、BtuB210-和BtuB420-LacZ融合分别减少了~6倍、~5倍和~5倍(图第2页),表明全面监管要求超过btuB(英国)CDS。OmrB的过度生产也表现出类似的趋势,但效率较低,因为BtuB的最大抑制率仅达到50%120-、BtuB210-和BtuB420-LacZ平移融合(图2摄氏度和补充图S3B). 采用类似的策略,我们接下来调查了btuB(英国)通过转录调节信使核糖核酸水平所必需的btuB-lacZ融合(图2安培). 这些构造的设计区域与btuB(英国)mRNA,随后是以UAA终止结束的四个密码子,并融合到拉奇包含自己的翻译起始信号。我们观察到,只有携带420 nt CDS的最长融合受到OmrA和OmrB的轻微影响(减少拉奇表达分别为~33%和~20%),而短融合均未被sRNA抑制(图第2页和C类). 总之,这些数据证实了OmrA抑制btuB(英国)表达效率高于OmrB,与它们对btuB(英国)信使核糖核酸水平(图1摄氏度). 此外btuB(英国)与转录融合相比,CDS需要控制翻译融合的表达。这些结果强烈表明,这些sRNAs主要作用于翻译水平btuB(英国)mRNA可能是由核糖体缺失的信使核糖核酸酶E裂解所致,信使位于btuB(英国)CDS。
我们还确定了最小值btuB(英国)核糖开关调节所需的区域。我们的报告基因检测显示,只有18和210 ntbtuB(英国)CDS足以分别触发对翻译或转录结构的强烈依赖AdoCbl的调节(图二维和补充图S3C)与之前的研究完全一致(14). 这些结果表明,核糖开关控制需要更小的区域btuB(英国)CDS比sRNA控制并证实核糖开关的调节不依赖于sRNA。我们进一步研究了几个5′-UTR二级结构元件对核糖开关和OmrA介导的调控的重要性。因为这两种调节器都调节翻译型BtuB的表达81-LacZ融合(图第2页和D类),我们使用这个结构来表征两个结构元件(螺旋P13和P14)的作用,这两个结构元素参与了核糖开关依赖的翻译调控(14,16,17,38). 虽然螺旋P13是位于核糖开关适配体结构域中的假结结构的一部分,但螺旋P14直接调节核糖体进入SD的途径(图第二版) (39). 正如预期的那样,AdoCbl强烈抑制了WT融合(97%,图第二版),并且当假结通过EP1突变体被破坏稳定时,这种调节丧失。相反,OmrA的抑制在EP1突变体中没有受到影响,因为它仍然减少btuB(英国)约50%的表达,如WT所观察到的(图第二版). 同样,P14干细胞(EP2和EP3突变体)的失稳导致AdoCbl依赖性的丢失或减少btuB(英国)基因抑制同时保持OmrA调节(图第二版和补充图S4A). EP2突变体中AdoCbl依赖性抑制的部分缺失很可能是由P14茎结构扰动程度较低引起的。在EP1和EP3突变转录结构的背景下未观察到AdoCbl依赖性调节(补充图S4B),表明mRNA水平也不受影响,这与作为翻译效应的结果的核糖开关的转录效应一致。总之,这些结果清楚地表明OmrA的调节活性并不依赖功能性核糖开关来抑制btuB(英国)表达式。
OmrA和AdoCbl效应器依赖不同的调节机制
我们接下来评估了OmrA是否与btuB(英国)mRNA可能干扰AdoCbl核糖开关的调节。为此,我们雇佣了81 ntbtuB-lacZ转录融合,其表达不受OmrA调节,但被AdoCbl有效抑制(图第2页和D类). 值得注意的是,当OmrA过度表达时,AdoCbl的作用被完全消除(图3A级)表明OmrA结合阻止了核糖开关调节81 nt的mRNA水平btuB-lacZ转录融合。然而,当使用更长的btuB(英国)210 nt的转录融合,添加AdoCbl降低了融合的表达,即使存在OmrA(图3A级). 这些结果表明btuB(英国)位于CDS第81和210位之间的序列元件使AdoCbl核糖开关能够更有力地调节mRNA,而不再受OmrA的影响。因此,我们调查了该地区发挥作用的监管机制。我们推断,除了已知的翻译抑制外,这种调控还可能涉及转录终止因子Rho,正如之前对几个核糖开关所确定的那样(6),以及建议的btuB(英国)通过在体外化验(40). 因此,我们监控了btuB(英国)使用转录表达btuB-lacZRho抑制剂双环霉素(BCM)存在下的融合(41). 我们发现,虽然BCM没有干扰81 nt结构的AdoCbl调控,但它在210 nt融合中将AdoCbl-依赖性抑制减轻了约4倍(图第3页). 描述btuB公司通过Rho,我们还使用了R66S Rho突变株。这个版本的Rho在转录终止方面有缺陷(6,8,42). 与BCM分析类似(图第3页)我们发现,与WT相比,R66S菌株的AdoCbl依赖性调控效率更低,尤其是对于携带210 nts或更多btuB(英国)编码序列,而ρ在81 nt融合中,突变体不太明显(图3C公司). 这支持Rho调节210nt(及更长)结构的想法。此外,为了确定RNA降解体是否参与了核糖开关调节机制,我们在内131降解体组件中有缺陷的菌株(5,34). 在这种情况下,WT和rne131型菌株(补充图S4C)表明RNA降解体不参与这些结构的调控。因此,我们的结果表明,继AdoCbl依赖性翻译抑制之后,Rho可以靶向btuB(英国)ORF终止转录。这些结果与最近的结果完全一致在体外实验表明Rho转录终止早在btuB(英国)ORF公司(40). 有趣的是,这个+81到+210区域btuB(英国)以富C和贫G层序为特征(图三维)这通常与Rho利用率的存在有关(车辙,车辙)站点(43,44). 总之,我们的结果表明,AdoCbl核糖开关和OmrA调节btuB(英国)利用不同机制开发特异性mRNA水平btuB(英国)允许Rho依赖性转录终止的序列(用于核糖开关控制),以及RNase E和降解体介导的RNA衰变(用于sRNA控制)。
![核糖开关调节依赖Rho调节btuB。当使用btuB81-和btuB210-lacZ转录融合时,在没有和存在AdoCbl的情况下进行(A,B)β-半乳糖苷酶分析。实验在表达OmrA(A)或添加双环霉素(BCM)(B)时进行。(C) 在WT和rhoR66S菌株中使用btuB81-、btuB210-和btuB420-lacZ转录融合时,在不使用AdoCbl和使用AdoCbl的情况下进行β-半乳糖苷酶分析。(D) 胞苷(%C)和鸟嘌呤(%G)在btuB序列中分布的序列分析。使用25 nt的扫描窗口确定C和G的出现次数,作为AUG起始点位置的函数。灰色区域突出显示残基81和210之间的btuB区域。](https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/nar/52/10/10.1093_nar_gkae347/1/m_gkae347fig3.jpeg?Expires=1721158029&Signature=nFY1BkEF8oewbuoMztX4Y7IEpX-H4OXxCGcnIboLT37F7r2TSNr46zq8fOi4t92vThG2UvgPcV8iHTz6QChhlhUS3f8s-ZT7qsIalsX~9BeAf1rL7qmdds4uedZoVPGUsalOtscX0VgMWpubhRvZ3moq0a1uHb1Eszt8SkKdwYNO8juHxAbFy3uHmSmc6K5tUK8TDBvKBcksNRCQcXIucGxTphu3sDYYDXs8MEHB3gtS5nSxOkBhJOOij6VXW4uPqcLqHRcQ4YqOTqGU2j-vTzzbgHq3UtzF7TTYLfyEEdu5FQ4XeCq~UEhKC06s0gDYGnC6zpM866CMOVu~6-SXCg__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA)
图3。
Riboswitch监管依赖Rho进行监管btuB(英国)在使用btuB(英国)81-和btuB(英国)210-lacZ公司转录融合。实验在表达OmrA时进行(A类)或添加双环霉素(BCM)时(B类). (C类)使用btuB(英国)81-,btuB公司210-和btuB(英国)420-lacZ公司WT和rhoR66S型菌株。(D类)胞苷(%C)和鸟嘌呤(%G)分布的序列分析btuB(英国)序列。使用25 nt的扫描窗口确定C和G的出现次数,作为AUG起始点位置的函数。灰色区域高亮显示btuB(英国)残基81和210之间的区域。
OmrA识别btuB(英国)mRNA通过其特定的中央区域
破译OmrA如何控制btuB(英国)表达,我们使用IntaRNA生物信息学预测工具(45)搜索OmrA和前100 ntbtuB(英国)CDS,并使用Unafold和RNAfold的二级结构预测扩展了预测(46,47)和手动(图4A级). 这个btuB(英国)–OmrA相互作用预计主要依赖于OmrA的中心区域,该区域偏离OmrB序列,与两种sRNA的不同调节效率完全一致(图1B年,第2页和C类). 为了验证这一预测,OmrA和btuB公司mRNA区域(−240至+99),然后是拉奇配对预测(BtuB)下游仅几个nts的编码序列99-LacZ)。这种融合是从组成性表达的P转录而来的左旋-1发起人。我们首先发现OmrA(OmrAM9*突变体)的突变位置26-36对调控产生了负面影响,因为OmrA对WT融合的抑制作用(5倍)比OmrAM9(1.6倍)更有效(图4B类). 同样,变异btuB(英国)位置+71至+78(btuB(英国)M9突变株)强烈削弱了WT-OmrA序列的控制(1.2倍的抑制),这与该序列对OmrA识别很重要的情况一致。然而,将OmrAM9*和btuB公司M9突变体恢复预测的OmrA-btuB(英国)与突变融合/WT-OmrA对相比,相互作用仅略微改善了抑制(1.7倍),并且与WT融合/OmrAM9*对相比,没有导致显著的调节增益(图4B类). 这可以通过OmrA中存在未配对残基32–34和38–41来解释(图4A级)与M9*变体中的突变位置相邻,可能不利于补偿。与此一致,在OmrAM9*上下文中删除这些未配对的核苷酸恢复了对btuB(英国)M9变体(参见补充图S6).
![OmrA通过其中心区域的直接相互作用调节btuB的表达。(A) btuB和OmrA之间的预测基本布线。编号方案与btuB起始密码子和OmrA转录起始位点有关。OmrA和OmrB之间的非连接核苷酸以粗体显示。方框中显示了包含用于研究OmrA-btuB相互作用的突变的区域。灰色阴影表示IntaRNA预测的相互作用(45),而其他碱基对则是通过OmrA-btuB序列的二级结构预测以及Unafold和RNAfold和手动微调来预测的。对携带M9突变(B)或M11突变(C)的BtuB99-LacZ翻译融合,以及不同OmrA变异体过度生产的FepA45-LacZ和CirA30-LacZ翻译融合(E)进行(B,C和E)β-半乳糖苷酶分析。所有融合均由组成型PLtetO-1启动子表达。删除这些分析中使用的菌株的omrA和omrB染色体拷贝。β-半乳糖苷酶的平均值和标准偏差来自三个独立的实验。(D) 使用从用于相应的ß-半乳糖苷酶分析的细胞培养物中提取的RNA对OmrA M9*和M11*变体水平进行Northern blot分析。SsrA RNA被用作负荷对照。(F) LB和LB pH 4.7中OmrA和OmrB水平的Northern blot分析。在携带或不携带染色体omrA和/或omrB基因的细胞中进行实验,并从用于(G)中WT BtuB99-LacZβ-半乳糖苷酶测定的相同培养物中提取RNA。(G) 在LB和酸性LB(pH 4.7)中,对携带或不携带染色体omrA和/或omrB基因的细胞中的BtuB99-LacZ和BtuB996M9-LacZ翻译融合进行β-半乳糖苷酶分析。显示了三个独立实验的平均β-半乳糖苷酶活性和标准偏差。](https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/nar/52/10/10.1093_nar_gkae347/1/m_gkae347fig4.jpeg?Expires=1721158029&Signature=o8fYhxkcqiTsoot8uIErWtX4omNbMxUzGfgEmz1yOgDb-zmUh829IpU1kfmkIaGDOIwZ0x-Rw8rUOmTYJJwvPA7Ydk3Eb8TYA6D~TmPgLqpekcSQAxIebBAXYCPVAdj4KGBKu9lOZCVlm60-mjKu60U4k2GgEMnkpIREKbXkjb4oSvBtphx~OJacXvFPxdP6-xyrmDrmCHoIZcPYO2N0p6bU-GeVMGcd3HXUmGql7ZrwwkLBvC8Xu6GfsCDXLs6HUqxThpbsabe9vEJ9Mlr5w3Wb-OymLnMPsLZNo21V4al8Vhjh0BuP7AJAYijI8USwbCKptmxr88zOV4CCaU3Vvw__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA)
图4。
OmrA调节btuB(英国)通过其中心区域的直接相互作用进行表达。(A类)预测的基本布线btuB(英国)和OmrA。编号方案与btuB(英国)起始密码子和OmrA转录起始位点。OmrA和OmrB之间的非连接核苷酸以粗体显示。包含突变的区域用于研究OmrA-btuB(英国)交互显示在框中。灰色阴影表示IntaRNA预测的相互作用(45)而其他碱基对则是使用OmrA的二级结构预测来预测的-btuB(英国)顺序为Unafold和RNAfold,手动微调。BtuB的(B、C和E)β-半乳糖苷酶测定99-携带M9突变的LacZ翻译融合(B类)或M11突变(C类)和FepA的45-LacZ和CirA30-LacZ翻译融合(E类)不同OmrA变体的过度生产。所有熔合都是由一个组成P表示的左旋-1发起人。删除这些分析中使用的菌株omrA公司和omrB公司染色体拷贝。β-半乳糖苷酶的平均值和标准偏差来自三个独立的实验。(D类)使用从用于相应的ß-半乳糖苷酶分析的细胞培养物中提取的RNA对OmrA M9*和M11*变体水平进行Northern blot分析。SsrA RNA被用作负荷对照。(F类)LB和LB pH 4.7中OmrA和OmrB水平的Northern blot分析。实验在携带或不携带染色体的细胞中进行omrA公司和/或omrB公司从用于WT BtuB的β-半乳糖苷酶测定的相同培养物中提取指示的基因和RNA99-LacZ in(G)。(克)BtuB的β-半乳糖苷酶测定99-LacZ和BtuB99携带或不携带染色体的细胞中M9-LacZ翻译融合omrA公司和/或omrB公司LB和酸性LB(pH 4.7)中的基因。显示了三个独立实验的平均β-半乳糖苷酶活性和标准偏差。
因此,我们使用了一对额外的突变体来评估OmrA–btuB(英国)相互作用(突变体btuB(英国)M11和OmrAM11*,图4A级). 突变btuB(英国)M11不足以阻止OmrA调节,这很可能是因为在这种情况下存在替代配对。尽管如此,OmrAM11*变异体不再抑制WT-BtuB-LacZ融合,但有效调节BtuBM11-LacZ的融合(~2.6倍的抑制,图4摄氏度)尽管OmrAM11*的水平低于OmrA WT(图4D(四维)). 因此,综合起来,M9和M11组突变体强烈支持OmrA中心区域与OmrA残基+66至+79相互作用的假设btuB(英国)客户尽职调查体内.
这种基本路径非常罕见,因为之前报道的所有OmrA/B sRNAs靶点,例如cirA公司,fepA公司,ompR公司,ompT公司,csgD、flhDC,dgcM公司和flgM(飞行高度表)mRNA与OmrA/B保守的5′末端相互作用(22–27). OmrA的这种特异性-btuB(英国)通过比较OmrA 5′末端或中央区域突变的影响,进一步检验了相互作用(图4A级,分别参见M5'和M9*突变体)btuB(英国)或cirA公司和fepA公司,OmrA 5′-末端的两个已知靶点。OmrA M5’突变减轻了BtuB的抑制99-LacZ融合(图第4页)与我们在OmrA M9*中观察到的情况类似。因此,无论是5′端突变还是中心区突变都不能完全取消调控,这可以用OmrA和OmrA之间预测的相互作用长度来解释btuB(英国),也可能涉及OmrA 5′端与btuB(英国)残留物+83至+94(图4A级). 与保守的OmrA/B 5′末端对调控的重要性一致,在OmrB中引入M5'突变可消除btuB公司法规(补充图S6C). 这进一步支持了保守的5′末端或OmrA/B在btuB公司OmrB不受中央区域的调控。
与…对比btuB(英国),翻译融合FepA45-LacZ和CirA30-LacZ被OmrAM9*有效抑制,但不受OmrAM5'的调节(图第4页)与经典OmrA 5′端靶一样。这些数据证实了OmrA特定的中央区域在控制btuB(英国).
值得注意的是,我们还测试了btuB(英国)M9突变体,发现它没有OmrA的调节作用那么强烈(如果有的话)(补充图S4D:AdoCbl分别将WT或M9融合抑制约7倍和约5倍)。这与以下区域一致btuB(英国)参与sRNA的调控,但不参与核糖开关的调控。相反,损害核糖开关控制的突变体并不影响OmrA/B介导的调控(图第二版和补充图S4A). 这些数据进一步表明,sRNA和AdoCbl控制了btuB(英国)是独立的过程。
OmrA和OmrB的生理水平调节btuB(英国)表达
接下来,我们分析了OmrA/B在btuB(英国)在更多生理条件下的调节,即当sRNAs从其天然染色体位点表达时。对于这些测定,我们遵循BtuB的活性99-LacZ平移融合omrAB公司+应变,或在为删除的应变中omrA公司,omrB公司或两者兼而有之。这些实验是在标准LB培养基(测得的pH值为6.8)或酸化LB(pH值为4.7)中进行的,其中OmrA/B的表达预计会通过OmpR的激活强烈诱导(29,48)经Northern blot证实(图4楼). WT BtuB的表达没有差异99-在标准LB中存在或不存在OmrA和/或OmrB时观察到LacZ融合(图4G网络),与此条件下OmrA/B的相对较低水平一致(图4楼) (29,48). 相反,当在酸化LB中进行这些实验时,WT融合的活性在ΔomrAB和ΔomrA缺失菌株(图4G网络),证实了对btuB(英国)OmrA的生理水平表达。仅删除OmrB未观察到此类影响(图4G网络),进一步支持btuB(英国)优先由OmrA而不是OmrB瞄准。最后,M9突变型BtuB的表达99-未被OmrA/B抑制的LacZ融合在omrA/B公司缺失菌株(图4G网络),与图中所示的直接基本布线交互一致4A级.
Hfq的远端面需要用于btuB(英国)OmrA的规定
假设OmrA配对站点位于btuB(英国)CDS位于翻译起始区(TIR)下游,我们接下来研究了OmrA抑制的分子机制btuB(英国)表达式。我们首先利用Hfq三个不同RNA-结合表面(突变体Q8A)、边缘(R16A)和远端(Y25D)中先前特征化的点突变,分析了Hfq在sRNA调控中的作用(49,50). 近端面和边缘对于与许多Hfq依赖的sRNA(称为I类sRNA)结合很重要,而远端面则与这些sRNA的mRNA靶点中存在的连续A–R–N(R=嘌呤,N=任何核苷酸)基序结合有关(49). 值得注意的是,OmrA和OmrB显示了I类sRNA的特征,因为它们在近端和边缘突变体中的水平显著下降,但在远端面部突变体中没有下降(26).
评估Hfq在调节btuB(英国)我们使用了BtuB210-mScarlet-I(mSc)翻译融合并监测携带以下五种病毒之一的菌株OmrA过度表达后的mSc荧光高频q等位基因:WT hfq,Δhfq、Q8A、R16A或Y25D。作为控制,我们还监控了ompR公司和sdhC公司,由OmrA/B控制(22)和Spot42(51)分别使用同一细胞中的翻译mSc融合高频q背景。重要的是,ompR公司是典型的OmrA/B靶点,因为sRNA配对位点与TIR重叠,很可能与核糖体30S亚单位的结合直接竞争(22). 相反,sdhC公司以非规范方式被Spot42 sRNA抑制:sRNA在TIR上游配对并将Hfq加入TIR,从而允许翻译抑制(51).
在高频qWT背景下,OmrA过度生产时,BtuB-mSc融合的荧光降低了2倍以上,而OmrB的影响较小(~1.3倍)(图第5页和B类和补充图S7). 在相同条件下,OmpR-mSc融合的表达分别减少了3倍和2倍以上(图5摄氏度和补充图S8). 两者的sRNA依赖性调节btuB(英国)和ompR公司在没有总部的情况下被废除或大幅削减(Δhfq)或者当它在近端(Q8A)或边缘(R16A)表面发生突变时(图5亿和C类). 这至少可以部分解释为这些突变体中OmrA/B的积累量低得多(图第五版). 相反,在Hfq远端面部突变体(Y25D)的背景下,OmrA和OmrB积累到较高水平(图第五版)如前所述(26). 在这种情况下,BtuB-mSc融合的表达不再受OmrA或OmrB的调节(图5亿),同时ompR-mSc公司两种sRNA仍然抑制了5倍以上(图5摄氏度). 关于ompR公司在Y25D突变株中表明OmrA/B不依赖Hfq远端面来调节ompR公司,与这些sRNA直接与ompR公司TIR并与30S核糖体亚基竞争(28). 相反,缺乏监管btuB(英国)在中高频qY25D突变体表明OmrA/B在这种情况下可能使用不同的机制,在这种机制中,Hfq需要与mRNA结合。例如,在调节sdhC公司Spot42表达(51)或第个,共个手动X通过SgrS和DicF sRNAs(52),其中sRNA将Hfq募集到TIR用于翻译抑制。有趣的是sdhC公司和btuB(英国)它们各自的sRNAs在所有四种中都同样强烈减少高频q突变体(图5亿和D类和补充图S9)暗示这两种情况下涉及的监管机制可能类似。支持总部在btuB(英国)控制,我们还发现btuB(英国)表达增加Δhfq或在高频qY25D应变(补充图S10),同时高频q质粒的过度表达(53)导致btuB(英国)压制(补充图S11). 同样,通过表达SdhC-mSc公司,而Hfq过表达对OmpR-mSc公司在这些实验中。
![OmrA需要Hfq远端面来控制btuB。(A) OmrA或OmrB在16小时时间窗内过度生产时BtuB210-mCarlet平移融合的代表性荧光测量。所示为归一化荧光,对应于荧光除以600 nm处的吸光度,作为600 nm处吸光度的函数。显示归一化荧光随时间变化的相应图表如补充图S7A所示。使用缺乏荧光结构并携带pBRplac(pBR)空质粒(“无融合”)的等基因菌株进行背景荧光控制。(B–D)OmrA或OmrB过度生产时BtuB210-(B)、OmpR717-(C)和SdhC39-mCarlet(D)平移融合的荧光分析。实验在等基因hfq+(WT)、Δhfq、hfqQ8A、hfqR16A和hfqY25D菌株中进行。测量一式三份,显示荧光归一化为600 nm处的吸光度,600 nm处吸光度接近0.3,并任意设置为1.0,用于用载体控制(pBR)转化的WT菌株。(E,F)Northern blot分析等基因hfq+(WT)、Δhfq、hfqQ8A、hfq R16A和hfqY25D菌株中OmrA、OmrB(E)和Spot42(F)水平。使用5S rRNA和SsrA RNA作为负荷对照。总RNA是从分别用于面板B和D的同一组菌株中提取的。补充图S14中提供了面板E的OmrA和OmrB北部地块的更长采集。]()
图5。
Hfq远端面需要用于控制btuB(英国)由OmrA提供。(A类)BtuB的代表性荧光测量210-mCarlet在16小时时间窗口内过度生产OmrA或OmrB时进行平移融合。所示为归一化荧光,对应于荧光除以600 nm处的吸光度,作为600 nm处吸光度的函数。显示归一化荧光随时间变化的相应图表如所示补充图S7A使用缺乏荧光结构并携带pBRplac(pBR)空质粒(“无融合”)的等基因菌株进行背景荧光控制。BtuB的(B–D)荧光分析210- (B类)、OmpR717-(C类)和SdhC39-mCarlet汽车(D类)OmrA或OmrB过度生产时的平移融合。实验以等基因方式进行高频q+(重量),Δhfq,hfqQ8A型,hfqR16A型和hfqY25D型菌株。测量一式三份,显示荧光归一化为600 nm处的吸光度,600 nm处吸光度接近0.3,并任意设置为1.0,用于用载体控制(pBR)转化的WT菌株。(E,F)OmrA和OmrB水平的Northern印迹分析(E类)和Spot42(F类)等基因的高频q+(重量),Δhfq,hfqQ8A型,hfqR16A型和hfqY25D型菌株。使用5S rRNA和SsrA RNA作为负荷对照。总RNA是从分别用于面板B和D的同一组菌株中提取的。对配电盘E的OmrA和OmrB北部地块的长期收购见补充图S14.
总部与btuB公司mRNA并抑制其表达
这些结果促使我们研究Hfq和btuB(英国)mRNA及其在btuB(英国)法规,更详细地使用在体外方法。我们首先进行了醋酸铅足迹实验,以确定Hfq在btuB(英国)mRNA,使用btuB(英国)mRNA片段范围从nts–80到+161。在–8至+12位置之间观察到Hfq依赖性保护btuB(英国)mRNA,因此与btuB(英国)起始密码子(图6A级). 在nts~+45至+50之间观察到一个额外的保护区,表明Hfq可能与非相邻RNA区域结合。由于核苷酸+18到+44之间形成干环结构,这两个保护区可能彼此接近(正如预测的那样生物信息学). 重要的是,−8到+12保护区包含重复的A–R–N基序,这些基序是Hfq远端面部的一致结合位点。因此,我们进行了测试体内消除这些a–R–N基序的突变对OmrA控制的影响。在BtuB的Hfq结合位点引入三对CC99-LacZ融合(图第6页,H1突变体)强烈降低了OmrA的调节,WT和H1突变体的调节分别为约5.8倍和约1.3倍(图6亿)分别是。然而,这种H1变化也强烈降低了BtuB的表达99-LacZ融合。为了排除OmrA对H1突变体的抑制减少可能是由于其低表达所致,我们验证了btuB(英国)例如P基因突变左旋-1启动子(lowPtet),仍允许OmrA调节(图6亿,~4.2倍)。使用携带越来越多部分的平移融合btuB(英国)编码序列,我们接下来研究了btuB(英国)其对于Hfq过表达的抑制是重要的。的表达式btuB(英国)在诱导Hfq过度表达的各种结构中被抑制,当图中确定的两个Hfq结合位点时,效果最强6A级融合时出现:45和99 nt结构分别减少了~2倍和~2.9倍(补充图S12A). 此外,Hfq生产过剩也导致btuB(英国)在缺乏OmrA和OmrB染色体基因的情况下下调,增加了Hfq在btuB(英国)控制(补充图S12A). 此外,H1突变体废除了调控(补充图S12B)与ARN位点对镇压的重要性一致。综合起来,这些数据强烈表明OmrA对btuB(英国)要求Hfq及其在TIR附近的结合抑制btuB(英国).
![btuB mRNA在体外与OmrA和Hfq相互作用。(A) 醋酸铅探针检测Hfq与btuB mRNA的结合。放射性标记的btuB RNA对应于nts–80到+161(相对于起始密码子),并随着Hfq浓度的增加(0到20 nM)进行培养。通道L、T和C分别对应于碱性氢氧化物阶梯、部分RNase T1消化和非反应对照。与AUG相关的位置显示在左侧。(B) BtuB99-LacZ翻译融合物的β-半乳糖苷酶分析,无论是WT还是携带H1突变,还是在OmrA存在下PLtetO-1启动子的弱化版本(lowPtet)。显示了两个独立实验的平均β-半乳糖苷酶活性和标准偏差。(C) 使用放射性标记的btuB RNA进行EMSA分析,并增加Hfq的浓度。凝胶右侧的箭头表示游离btuB RNA和btuB-Hfq复合物。当Hfq浓度增加时,多种物种的存在表明Hfq可能具有多个btuB RNA结合位点。(D) EMSA分析使用放射性标记的OmrA进行,在没有或存在Hfq的情况下,与浓度增加的btuB RNA孵育。右边的箭头显示了自由OmrA和OmrA-Hfq-btuB复合物。(E) Toeprint分析监测Hfq和OmrA对翻译起始复合物形成的影响。实验在没有或存在Hfq、OmrA或30S/tRNA-fMet的情况下进行。车道U、A、G和C表示排序阶梯。完整凝胶如补充图S13A所示。(F) 用Hfq和OmrA表示btuB mRNA的方案。Hfq保护区、Shine-Dalgarno(SD)和AUG如图所示。H1突变体中发生变化的核苷酸显示为蓝色。]()
图6。
btuB(英国)mRNA与OmrA和Hfq相互作用在体外. (A类)醋酸铅探测Hfq与btuB公司mRNA。放射性标记btuB(英国)与nts–80至+161(相对于起始密码子)相对应的RNA与Hfq浓度增加(0至20 nM)一起培养。通道L、T和C分别对应于碱性氢氧化物阶梯、部分RNase T1消化和非反应对照。与AUG相关的位置显示在左侧。(B类)BtuB的β-半乳糖苷酶测定99-LacZ翻译融合要么是WT或携带H1突变,要么是P的弱化版本左旋-1OmrA存在下的启动子(lowPtet)。显示了两个独立实验的平均β-半乳糖苷酶活性和标准偏差。(C类)使用放射性标记的EMSA分析btuB(英国)增加Hfq浓度的RNA。凝胶右边的箭头表示免费btuB(英国)RNA和btuB(英国)-Hfq复合物。当Hfq浓度增加时,多种物种的存在表明Hfq可能有多种btuB(英国)RNA结合位点。(D类)使用放射性标记的OmrA进行EMSA分析,并在培养过程中增加btuB(英国)无Hfq或有Hfq时的RNA。右边的箭头显示了空闲的OmrA和OmrA-Hfq-btuB(英国)复合物。(E类)Toeprint分析监测Hfq和OmrA对翻译起始复合物形成的影响。实验在没有或存在Hfq、OmrA或30S/tRNA-fMet的情况下进行。车道U、A、G和C表示排序阶梯。完整凝胶如所示补充图S13A. (F类)表示btuB(英国)具有Hfq和OmrA的mRNA。Hfq保护区、Shine-Dalgarno(SD)和AUG如图所示。H1突变体中改变的核苷酸以蓝色显示。
接下来,我们使用电泳迁移率变化分析(EMSA)来表征btuB公司OmrA和Hfq。我们的结果表明btuB(英国)-Hfq复合物是在Hfq浓度增加时形成的(图6摄氏度). 此外btuB(英国)-OmrA相互作用仅在Hfq存在时检测到(图第6天),表明Hfq是形成稳定的btuB(英国)-OmrA复合体。这些结果表明OmrA和Hfq直接与btuB(英国)调节其基因表达。
为了直接评估Hfq在抑制翻译起始中的作用,我们使用了在体外Hfq存在或不存在时的趾印试验(图第六版,请参阅中的完整凝胶补充图S13A). 使用30S核糖体亚单位进行检测,btuB(英国)mRNA和启动子tRNA(tRNA-fMet)(54). 在存在30S和tRNA-fMet的情况下,在U16位置检测到逆转录停止(趾印)(图第六版,通道2),表明30S亚单位与btuB(英国)mRNA,与先前数据一致(39). 在Hfq存在的情况下,观察到U16脚趾明显消失(图第六版,泳道6),显示Hfq阻止30S亚基与btuB(英国)mRNA。相反,在G18位置观察到一个新的逆转录停止,可能是因为Hfq阻断了该位置的逆转录酶,这与我们的铅探测数据非常一致(图6A级). 当使用OmrA进行实验时,Hfq的加入仍然导致U16趾印的丢失和G18信号的产生(图第六版,车道4和8),对应于Hfq约束。使用H1进行的Toeprint分析btuB(英国)变异体没有显示U16指纹,而是显示了不同的逆转录酶终止图谱(补充图S13B),表明H1上的翻译起始btuB(英国)变体受到损害。这与H1-BtuB-LacZ融合的活性比WT对照降低了10倍的事实相一致(图6亿).
总之,这些结果表明Hfq直接与btuB(英国)OmrA配对位点上游的mRNA,并阻止30S亚单位与btuB(英国)AUG启动密码子在体外(图第六版). 这与Hfq对OmrA介导调节的要求相结合体内(图1摄氏度,5亿和6亿),表明结合OmrA有助于招募HfqbtuB(英国)TIR,类似于Spot42或SgrS/DicF招募Hfq进行监管的方式sdhC公司或手动X表达式,分别(51,52).
讨论
此处报告的结果表明btuB(英国)作为Omr规则的新成员。尽管这两种sRNAs的生理作用尚未完全理解,btuB(英国)这让人联想到OmrA/B的其他先前验证的靶点。首先,BtuB是一种外膜蛋白(OMP),与其他几个已知靶点(OmpT、CirA、FecA和FepA)一样。其次,与CirA、FecA和FepA一样,BtuB依赖于TonB系统来摄取其底物,即AdoCbl。
重要的是btuB(英国)和其他OmrA/B目标。而OmrA/B与所有先前识别的靶点的配对依赖于sRNAs 5′末端((22–27)以及我们未发布的数据粪便A),控制btuB(英国)涉及OmrA的中心区域,这使其与OmrB不同。与此一致,删除OmrA足以增加btuB(英国)在酸化培养基中表达,而在相同条件下,仅删除OmrB没有影响(图4G网络). 然而,在缺少OmrA的情况下,删除OmrB可以进一步增加btuB(英国)表达式,但不是btuB公司携带M9突变(图4G网络),表明OmrB仍然可以与btuB(英国)mRNA,尽管其效率远低于OmrA。在这方面,OmrB的残基29至37和OmrB残基+69至+77之间存在9 bp的互补性btuB(英国)(如所示补充图S6E)但这是否参与监管仍不清楚。此外,类似于OmrA(图4A级),OmrB的目标是+85到+94btuB(英国)区域通过其5′结构域。虽然OmrB 5′端的作用由突变M5'支持,M5'取消了对btuB(英国)(补充图S6C),需要更多工作来确定OmrB-btuB(英国)监管互动。总之,btuB(英国)显示为优先的OmrA目标,而OmrB的调制只是边缘的,可能需要更具体的条件。
据我们所知,这是首次报道通过与OmrA特异区域配对而获得优先OmrA靶点,这表明除了一个共同的调节子外,一些基因可能仅受OmrA调控。相反的情况也可能是真的,即一些基因可以单独由OmrB控制,尽管迄今为止还没有描述过这样的例子。此处报告的目标的差异控制btuB(英国)可能有助于肠杆菌中OmrA和OmrB sRNA的保存。
在酸性条件下刺激OmpR活性(29,48)为解释酸应激后OmrA/B的诱导提供了理论依据,最终导致btuB公司压制(图4G网络). 在如此低的pH值条件下,btuB(英国)转录因子GadX也抑制转录(55)从而确保btuB(英国)mRNA水平被有效调节。重要的是,低pH值条件也会增加质子动力(56,57),这对BtuB的钴胺素进口至关重要(53)以及其他依赖于TonB的转运蛋白的功能。因此,预计AdoCbl核糖开关调节机制在酸性不足以抑制btuB(英国)通过OmrA/B和GadX。从全球来看,根据上述结果,我们的数据表明btuB(英国)AdoCbl核糖开关和sRNAs OmrA、OmrB和GadX在多个水平上高度调节表达。
从机械角度来看,Hfq严格要求控制btuB(英国)OmrA/B。这是预期的,并且已经在许多其他Omr靶点上观察到,因为在没有这种伴侣的情况下,OmrA/B水平显著下降(图第五版) (22,24,26). 然而,更不寻常的是,Hfq远端面部突变体(Y25D)也废除了这种控制。对于sRNAs与RBS配对的规范性调控(例如ompR公司OmrA/B控制,图5摄氏度). 由于Hfq远端表面已被证明参与mRNA结合,这强烈表明OmrA控制btuB(英国)依赖于Hfq与该靶mRNA相互作用的能力。有趣的是,控制sdhC公司按点42(图第五天)和,共dgcM公司由OmrA/B提供(26). 在后一种情况下,Hfq被发现调节dgcM公司促进与OmrA/B相互作用的mRNA(26),而在前一种情况下,如前所述,Hfq直接负责抑制30S与sdhC公司(51). 我们的在体外实验表明Hfq直接与TIR结合btuB公司mRNA,位于包含由多个(a–R–N)基序形成的典型结合位点的区域,从而抑制30S结合(图第六版). 相比之下,OmrA本身对脚趾形成的影响要小得多(图第六版). 总之,这些结果表明了一种类似于Spot42所描述的机制-sdhC公司,SgrS公司-手动X或DicF-手动X对,其中OmrA的中心区域与btuB(英国)mRNA,从而促进Hfq募集并抑制30S结合。此外,Hfq显著改善了OmrA-btuB公司复杂的在体外(图第6天). 目前尚不清楚该观察的确切机制,但Hfq可能参与OmrA或btuB(英国)促进双链形成的mRNA结构,与已报道的类似dgcM公司(26). 值得注意的是,Hfq过表达抑制btuB(英国)即使没有OmrA和OmrB sRNA(补充图S12A). 这增加了Hfq可能与btuB(英国)mRNA,无需“辅助”sRNA,促进基因调控。或者,OmrA/B以外的sRNA可以通过结合btuB(英国)mRNA和招募Hfq。
虽然过去几十年进行的大多数研究都提出了这样的观点,即sRNAs在转录后水平调节基因表达(58–60)最近研究表明,sRNAs也可以通过控制Rho转录终止来进行共转录(61–63). 对于ChiX,Rho转录终止是通过调节翻译起始间接控制的肠道沙门菌(64). 然而,对于一些sRNA,如DsrA、ArcZ和RprA,Rho活性是由sRNA与mRNA的结合直接调节的,可能是通过抑制Rho结合或移位(7). 相反,目前的数据表明,核糖开关主要在共转录水平调节基因表达枯草芽孢杆菌(65,66)通过调节内源性转录终止因子大肠杆菌通过依赖Rho下调翻译抑制后的mRNA水平(6). 研究还表明,转录后调控可能被一些核糖开关所利用(66)这表明,与sRNAs一样,核糖开关可能在转录过程完成期间和之后发挥控制作用。
值得注意的是btuB(英国)被AdoCbl核糖开关和OmrA/B sRNA选择性调节,通过不同机制影响mRNA水平。与之前的研究一致(14,19,20,67),我们的数据表明,核糖开关主要控制翻译起始,然后通过内嵌调节区域的作用调节RNA水平btuB(英国)ORF公司。特别是,以前有人认为转录衰减器(位置+18到+48)可能参与降低mRNA水平(19),其形成可能有利于翻译抑制。有趣的是,在81 nt转录结构中存在OmrA时,核糖开关调控的缺失(图3A级)可以归因于OmrA绑定到btuB(英国)并且破坏衰减器结构的形成。然而,对于携带较长区域的mRNAbtuB(英国)编码序列,Rho依赖的转录终止在核糖开关控制后mRNA水平的降低中起主要作用(图三).
随着核糖开关介导的btuB(英国)mRNA不依赖于Hfq和降解体(图1),这强烈表明阻止翻译启动btuB(英国)不足以触发RNase E介导的该mRNA的衰变。相反,OmrA/B过度表达后观察到的降解很可能依赖于RNase E和降解体的募集到btuB(英国)mRNA通过Hfq-RNA复合物(68,69). 相反,事实上btuB(英国)与核糖开关控制相比,OmrA/B控制需要mRNA,这表明,虽然核糖开关作用导致Rho依赖性转录提前终止,但sRNAs可能并非如此。这种机制上的差异与AdoCbl核糖开关和sRNAs OmrA/B调节相一致btuB(英国)基因表达分别在共转录和转录后水平。现在需要进行更多的实验,以充分了解这些调控活动在多大程度上局限于共转录和转录后机制。
以前有报道称,核糖开关和sRNA可能协同作用以控制基因表达(70–72). 的确,在单核细胞增生李斯特菌,转录终止由S公司-腺苷蛋氨酸核糖开关产生一种sRNA,控制PrfA的表达,PrfA参与毒性基因的表达(70). 此外,它还显示在粪肠球菌和单核细胞增生李斯特菌AdoCbl核糖开关控制含有ANTAR RNA元件的sRNA的形成,后者对调节eut(中子)乙醇胺利用相关基因(71,72). 虽然这些研究揭示了核糖开关可能作为“前RNA”的调节元件,但我们的研究结果表明,核糖开关和sRNAs都可以调节btuB(英国)基因。
核糖开关和sRNA可能参与对相同mRNA群体的调节,从而增加了基因调节机制的复杂性。虽然核糖开关在大多数情况下仅限于5′-UTR,但结合sRNA调节可靶向多个mRNA区域,可显著提高共转录和转录后水平的基因调节效率。因此,核糖开关和sRNAs调节基因表达的多种机制可以在细菌中使用和结合,以确保多种条件下的细胞内环境稳定。在这方面,有趣的是,其他大肠杆菌已知受核糖开关调控的信使核糖核酸在与RNA伴侣ProQ或Hfq免疫沉淀后富集,并且sRNA-mRNA对如MicA-莫阿或CyaR-溶血素C在Hfq-co-IP组分中研究的RNA-RNA相互作用组分中鉴定(73). 这表明这里报道的对单个基因的双核糖开关-sRNA控制并不局限于btuB(英国)mRNA,以及其他系统的研究在未来可能具有指导意义。
数据可用性
本文的基础数据可以在文章及其在线补充材料中找到。如有合理要求,可从相应作者M.G和D.A.L.处获得支持本研究结果的进一步数据。
补充数据
补充数据可从NAR Online获取。
致谢
我们感谢D.Schu和N.Majdalani(NIH,Bethesda)高频q变体菌株,以及E.Massé(谢尔布鲁克大学)菌株。我们感谢N.Fraikin和L.Van Melderen(比利时ULB)携带mCarlet基因的pNF02质粒,以及E.Hajnsdorf(巴黎IBPC)携带pCLHfq质粒。我们感谢A.Lavigueur、M.Springer和C.Condon对手稿的批判性阅读。
基金
加拿大卫生研究院(PJT153205,PJT183678);加拿大自然科学与工程研究委员会(RGPIN-2020-06241)(致D.A.L.);欧盟地平线2020研究与创新计划下的欧洲研究委员会(ERC)[818750 to M.G.];根据第101034407号Marie Skłodowska-Curie赠款协议,欧盟地平线2020研究和创新项目;UMR8261的研究也得到了CNRS和法国国家“卓越倡议”项目的支持[“DYNAMO”,ANR-11-LABX-0011]。开放存取费用的资金来源:CIHR、NSERC和ERC。
利益冲突声明。未声明。
笔记
现住址:西班牙巴塞罗那圣佩尔佩图亚·德莫多加Venvirotech Biotechnology SL Laurène Bastet,08130。
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作者注释
©作者2024。由牛津大学出版社代表核酸研究出版。