P10K数据库：原生生物10000基因组项目的数据门户

摘要

原生动物是一种高度多样化的微生物，与真菌、动物和植物不同，在地球生物圈中发挥着关键作用。然而，只有一小部分已知原生生物物种的基因组已经公布并公开。为了解决这一制约因素，启动了原生动物10000基因组项目（P10K），实施了一条专门的单细胞基因组/转录组组装、净化和注释原生动物的管道。生成的P10K数据库(https://ngdc.cncb.ac.cn/p10k/)作为一个综合平台，整理和传播来自不同原生生物群体的基因组序列和注释。目前，P10K数据库已纳入2959个基因组和转录组，包括1101个P10K新测序数据集和1858个公开可用数据集。值得注意的是，它覆盖了45%的原生动物目，纤毛虫具有显著代表性（53%的覆盖率），拥有近千个基因组/转录组。有趣的是，对纤毛虫独特密码子表用法的分析揭示了与NCBI分类系统相比的差异，表明需要修改这些物种使用的密码子表。总而言之，P10K数据库是原生生物研究的宝贵遗传资源库，旨在通过整合更多的序列数据和先进的分析工具来扩大其收集范围，以造福全世界的原生生物研究。

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介绍

原生动物是一个高度多样化的单细胞真核生物群，包括原生动物王国，1969年由罗伯特·惠塔克提出，是生命的五个王国之一(1). 自17世纪以来，微生物学家一直在描述和编目这些不同的真核生物(2). 原生生物在维持地球生物圈的生态平衡、环境健康和能量运输方面发挥着至关重要的作用，特别是在海洋和淡水栖息地等水生生态系统中，它们是细胞学、遗传学、遗传学、生物学、遗传学、生物医学和生物医学研究的重要模式，发育生物学和进化生物学。

近年来，人们在不同的生命王国，如植物，进行了大量的基因组测序工作(三)，真菌(4)不同分支的动物(5–8)和原核生物(9,10). 因此，已经为这些王国建立了基因组数据库。然而，已测序的真核生物基因组在不同王国之间的分布明显不均衡，在原生动物中基因组和转录体严重匮乏。目前，NCBI分类系统(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy网站) (11)记录了超过6万种记录在案的原生生物。原生生物基因组学领域的研究人员在研究各种原生生物群体方面做出了显著贡献，并建立了各种资源来支持他们的研究。已经开发了30多个原生生物基因组数据库，其中包括纤毛虫基因组数据库TGD(四膜虫基因组数据库，网址：https://tet.ciliate.org) (12)，藻类基因组数据库FWAlgaeDB（淡水藻类数据库，网址：http://www.fwalagedb.com)，寄生原生动物基因组数据库VEuPathDB（真核病原体、载体和宿主信息资源，https://veupathdb.org) (13)和MMETSP（海洋微生物真核生物转录组测序项目，http://marinemicro真核生物.org) (14). 尽管做出了这些努力，但原生生物基因组和转录组数据集的可用性仍然相对有限，截至2022年，可用数据集不超过2000个。这表明许多原生生物基因组尚未被探索，尽管它们在生物学和生态学上具有重要意义。此外，跨越数十个门的原生生物的分类多样性，在整合额外基因组方面构成了一个巨大的挑战。因此，显然需要一个专门为原生生物量身定制的专用基因组数据存储库。

为了解决这一差距，2019年启动了Protist 10000基因组项目（P10K）(15). 其主要目标是对10000多个原生生物基因组进行测序，特别强调使用单细胞基因组/转录组测序技术来克服与培养原生生物相关的挑战。为了促进实现这一目标并能够有效使用生成的数据，P10K数据库(https://ngdc.cncb.ac.cn/p10k/)作为一个全面的数据门户网站建立。P10K数据库作为一个中央存储库，存储由P10K计划生成的测序数据、组装基因组序列和注释。其主要目的是提供高质量原生生物基因组的精心收集，并提供用户友好的功能，实现轻松访问、直观浏览和在线分析。

材料和方法

样品采集和排序

在中国的各个地区，如青海高原地区、青海湖地区以及中部和东部地区，不断进行大规模采样，以收集各种各样的原生生物标本。这些样品采集自各种栖息地，包括湖泊、河流、湿地、海洋和温泉。根据形态特征，从水样和苔藓样品中分离出原生细胞。共获得1101份原生生物样本。其中，1078个样本是单细胞分离物，因为难以在实验室培养或富集。有关这些样本的详细元信息可以通过P10K数据库的样本页面访问。此外，还对可在实验室成功培养或富集的原生动物进行了DNA/RNA提取测序。

利用MGISEQ-2000测序平台对单个细胞进行了多重置换扩增（MDA）以进行基因组测序。Smart-seq2用于使用Illumina NovaSeq 6000和Illuminia HiSeq 4000平台从单个细胞生成cDNA用于转录组测序。对于培养样本，使用Illumina、Oxford Nanopore或PacBio SequelⅡ等平台提取大块DNA/RNA进行测序。

补充方法中包含了有关样品采集和测序的其他详细信息。

使用标准化管道进行数据处理和注释

为了分析单细胞基因组/转录组数据，开发了一条标准化管道，以简化为原生生物量身定制的组装、净化和注释过程(补充图S1). 概述的程序如下，更多细节可在补充方法中找到。

Fsatp公司(16)用于筛选出低质量读取并删除适配器以用于下一代测序读取。用于基因组/转录组组装，MEGAHIT(17)用于单细胞基因组组装，Trinity(18)用于单细胞转录组组装(19)和卡努(20)分别在短读和长读中组装批量基因组测序。

iGDP(https://github.com/GWang2022/iGDP) (21)用于净化纤毛虫基因组，而MMseqs2(22)用于搜索NR（NCBI非冗余蛋白质序列数据库），以清除非纤毛虫基因组和所有转录组的细菌、古细菌和病毒污染。此外，短于1Kb的contigs被从基因组组合中移除。

对于物种注释，nhmmer(23)用于将序列与rDNA hmm剖面对齐，以提取SSU序列。然后，使用NT（NCBI核苷酸序列数据库）搜索提取的SSU序列(24)、SILVA(25)和PR2(26)由BLASTN提供(27,28)以确定最佳分类注释。对于基因预测，使用codetta估计遗传密码（密码子表）(29)和面部(30). 我们管道中基因组的基因预测过程使用了基于同源性的两种方法（GenomeThreader(31)和AAT(32))和从头预测方法（PASA(33)，奥古斯都(34)、闪光HMM(35)和SNAP(36)). 最后，使用EVidenceModeler创建了一组完整的基因模型(37)通过合并所有预测的基因模型和RNA-seq转录本（如果可用）。对于转录组集合，使用getorf预测ORF(http://浮雕.bioinformatics.nl/cgi-bin/浮雕/help/getorf).

使用InterProScan注释基因功能(38). 使用Diamond识别正记录和副记录(39)截止恒等式超过30%E类-值小于1e–5。

当分析来自培养的原生动物的基因组测序数据（如长读测序数据）时，该管道的去污和基因预测过程仍然适用(40–42).

对于基因组/转录组质量评估，由BUSCO估计基因组完整性(43)CDS完整性（带有起始密码子和终止密码子的基因模型的比率）是基因组质量（GQ）的完整性。计算方法如下。

根据GQ值的范围，基因组完整性分为三个水平：高（GQ≥80%）、中（50-80%）和低（GQ<50%）。

公共数据检索和管理

除了最新测序的原生动物基因组和转录组外，我们还为原生动物收集了公开可用的测序数据。总而言之，P10K数据库包含了1858个来源于多个公共数据库的公共原生生物基因组/转录组。其中，从NCBI下载了1193个基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly网站/)从Ciliate.org下载了1个基因组(https://ciliates.org/)而MMETSP生成了659个转录组(14)和5个转录本游仆虫属源自盖杜科娃的研究等。(44). 该公共数据的样本来自世界各地的国家和地区。在这些公共基因组中，获得了428个基因组的组装序列和基因注释，而其余766个基因组仅获得了组装序列。对于MMETSP中只有组装序列的659个转录组(14)，使用我们的分析管道（如上所述）执行重新注释过程，包括净化和基因注释步骤。

数据库实施

P10K数据库是使用Spring Boot开发的(https://spring.io/projects/spring-boot)作为后端框架。所有数据都使用MySQL存储和管理(https://dev.mysql.com). 为了确保无缝的用户体验和高度交互式的web应用程序，使用HTML5构建网页并使用JSP呈现(https://jakarta.ee/规范/pages/3.0/). 前端接口是使用语义UI构建的(https://semantic-ui.com)和JQuery(https://jquery.com网站). 此外，基因组浏览器由igv.js实现(https://github.com/igvteam/igv.js#igvjs)，并使用HighCharts实现了数据可视化(https://www.highcharts.com)和数据表(https://datatables.net). BLAST搜索由国家基因组数据中心（NGDC）BLAST在线服务提供支持(https://ngdc.cncb.ac.cn/blast/).

数据库内容和功能

地理、生境和分类方面的广泛覆盖

P10K数据库已成功整合2959个原生物基因组/转录组，包括1601个基因组和1358个转录组。这些数据来源于各种各样的栖息地，其中1101个由P10K团队生成，分布在中国，1858个数据可从世界各地公开获得（图1安培). 值得注意的是，P10K数据集的一部分是从以极端条件为特征的地区收集的，如高海拔、温泉温度升高以及镉和汞等重金属污染的环境（图1B年). 这些特定的数据采集对于我们更好地理解在这种挑战性环境中蓬勃发展的原生生物具有重要意义。根据当前NCBI分类(11)，原生生物被分为10个超群和27个门（图1摄氏度). 基于这一分类框架，P10K数据库显示出全面的包容性，包括9个超群和24个门，但不包括芽囊真菌门、半乳突门和Picozoa门。就可获得的基因组/转录组数据的数量而言，纤毛虫属、枕类植物、蚜虫门和卵菌门最为丰富，每个都超过了200条记录（图1摄氏度). 相比之下，Imbridgea、Preaxostyla、Parabasalia和有孔虫门的记录相对较少，每个门的记录不到十个（图1摄氏度). 就订单或类的覆盖范围而言，P10K数据库包含45%（174/385）的订单和75%（64/85）的原生分类类（图1摄氏度). 统计分析表明，肺泡菌（47/84）、Stramenopiles（47/100）、变形虫（13/19）、Discoba（8/13）和触觉菌（8/11）超群在有序水平上的覆盖率超过或接近50%。相比之下，Rhizaria（7/37）仅实现了约19%的覆盖率（图1摄氏度).

P10K团队包含了1101个新测序的基因组/转录组，这代表着数据集中37%的显著扩展，涵盖了12个类群/门的物种（图一维). 该数据集突出地显示了纤毛虫门、管藻门和盘藻门的大量基因组/转录组，特别强调纤毛虫（纤毛虫）。

纤毛虫门或纤毛虫是P10K数据库中最具代表性的生物类群，包括985个基因组/转录组，其中90%（884）是新测序的（图一维). 值得注意的是，P10K的最新序列数据已经涵盖了14个新订单（图1E级)导致与当前公开数据相比大幅增加。基因组/转录组分布在10个纲和30个目中，约占所有纲的71%（10/14），占卷叶猴门内所有目的53%（30/57）（图1E级). 在涵盖的类别中，寡膜翅目、鞘翅目和荔枝目的数据集最为广泛。值得注意的是，Nassoporea和Litostomatea类的所有订单都包含在内。在涵盖的目中，Sessionlida和Colpodida各包含>100个基因组/转录组，这意味着最高的数据代表性。紧随其后的是触手类、前齿类、异毛类和膜壳类，每个都拥有40多个基因组/转录体（图1E级).

基于量身定制方法的高质量策划和注释

98%的新测序数据集（包括385个基因组和693个转录组）是使用先进的单细胞测序技术生成的，我们专门为这些基因组/转录组组装、净化、物种鉴定、，基因注释和评估（详见材料和方法）。

GC含量分布分析表明，管道内的净化过程非常有效。最终组装显示出单一GC峰，表明没有污染物。相比之下，原始组件通常显示出多个GC峰，表明存在污染物（图2安培).

就BUSCO完整性而言，新测序数据和公开可用数据显示出相当比例的中等和高水平基因组组装完整性。它表明，约23%（94/406）的新测序基因组和30%（364/1194）的公开基因组显示了80%至100%（高水平）的完整性水平（图第2页). 此外，48%（193/406）的新测序基因组和39%（461/1194）的公开基因组的完整性水平在50%到80%之间（中等水平）（图第2页).

整体基因组完整性评估显示，新测序数据的质量也可与公开可用数据相比较。为了评估基因组完整性，通过考虑基因组/转录组组装和CDS完整性来使用基因组质量（GQ）度量（参见材料和方法中的详细信息）。据观察，35%（140/400）的新测序基因组和16%（47/289）的公开基因组显示GQ在80%到100%之间变化（高水平）（图2摄氏度). 此外，41.5%（166/400）的新测序基因组和78%（225/289）的公开基因组显示GQ在50%至80%之间（中等水平）（图2摄氏度). 对于转录组，在新测序数据和公开可用数据之间观察到可比较的完整性水平。对于基因组，尽管与公开数据相比，新测序数据显示的中高水平比例略低，但值得注意的是，大多数公开可用的基因组都是从大量DNA样本中生成的。

纤毛虫遗传密码变异

纤毛虫（纤毛虫门）中观察到的一个显著特征是利用各种替代遗传密码。密码子表的精确估计对提高纤毛虫基因组结构注释的准确性具有重要意义。通过分析P10K数据库中纤毛虫基因组/转录组中的密码子表，发现纤毛虫之间存在更高程度的遗传密码变异，这超出了我们之前的理解(45). 图三展示了纤毛虫进化树的推断模式，列出了P10K基因组注释期间每个属内估计的遗传代码类型。

共有七个密码子表（除了没有终止密码子的物种(46))被发现用于纤毛虫，编号为1、4、6、10、12、27和30（图三). 其中，Spirotrichea类在密码子使用方面表现出相当大的变异性，使用了四个密码子表（1,6,10,12）。值得注意的是，螺菌纲的大多数属主要使用密码子表6。在异鞭毛虫纲、荔枝目、鞘翅目、前列腺目和叶咽目中，标准密码子表（密码子表1）似乎最受欢迎。在寡膜翅目中，物种主要使用密码子表6或30。值得注意的是，只有少数属在不同物种的密码子表中表现出差异，而这一趋势在整个纤毛虫中是一致的（图三). 根据我们的数据，纤毛虫的一个特定属通常以单个密码子表为主要特征，这表明在属于同一属的物种中，替代密码子表是罕见的。总的来说，我们的数据集为许多纤毛虫的遗传密码提供了有价值的见解，特别是包含了14个新目。将P10K估计密码子表与NCBI分类系统中的密码子表进行比较(11)，我们发现了31种纤毛虫的差异，主要在异毛纲（图三). 为了解决这个问题，我们与NCBI分类小组进行了讨论(11)和NGDC基因组仓库（GWH）集团(https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh网址/) (47,48). 我们希望共同探索和开发有效的方法，使我们能够准确地纠正和验证密码子表的分配，确保这些纤毛虫物种以及其他原生物种的遗传密码的准确表示。

用户友好的web界面

P10K数据库提供了一个用户友好的网络界面，由四个主要模块组成：浏览、基因组可视化、统计和BLAST工具，使用户能够轻松浏览和检索序列并进行在线分析（图4). 为了帮助用户最大限度地利用数据库，我们在帮助页面上提供了一个分步教程和教学视频。

浏览

浏览模块具有样本、基因组和基因网页，这些网页经过精心设计，确保轻松导航和直观访问。这些页面提供了组织良好的特色项目和信息表，允许用户轻松浏览和检索所需信息。样本页面以表格的方式展示了22个主题，如生物关系、栖息地、极端环境。用户可以选择要显示的所需列，对列内容进行排序，并下载元数据。通过在“搜索”框中输入关键字或浏览表上方列出的特色项目，可以应用自定义过滤器。类似地，表中显示了10个受试者的基因组页面允许按预设组进行浏览，如“新物种测序”、“基因组重新命名”、“单细胞基因组”。基因页面允许用户选择感兴趣的物种或样本，以表格格式查看所有相关基因。基因位置和结构可以通过基因组浏览器进行探索。

此外，P10K数据库提供样本和基因的单独页面，可通过使用主页中的样本ID或基因ID或表中的相关超链接进行搜索来访问。单个样本页面由七个部分的44个主题组成，包括摘要、生物特征、地理信息、联系信息、测序细节、基因组组装和注释信息以及可视化。单个基因页面显示基因摘要，如基因组位置、使用的遗传代码、CDS和蛋白质序列，还提供GO注释、同源和同源基因。

数据下载

为了增强用户访问每个样本不同级别数据的便利性，我们在单个样本页面中提供了一个单击下载功能。此功能允许用户轻松下载基因组组装、基因组注释、CDS序列、蛋白质序列、同源和同源基因以及基因注释详细信息。此外，用户可以连接到基因组仓库（GWH）(47,48)使用程序集ID并访问外部链接，如NCBI序列读取存档（SRA）(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra网址)获取相关数据。对于每个基因，也可以方便地从单个基因页面本地下载CDS和蛋白质序列。

基因组可视化

基因组可视化模块允许用户展开物种分类树，以查看与每个分类单元关联的样本。括号内列出了每个分类单元及其子类别的相关样本数。当用户单击分类单元或子类别时，右下角的表格会同步并显示相关样本的基因组组装和注释信息。此外，用户可以使用树顶部的搜索栏搜索特定的分类法。点击查看按钮，用户可以可视化所选样本的基因、mRNA、CDS和外显子的基因组位置。

BLAST工具

它还集成了用于序列搜索的BLAST工具和高级功能，如距离树和多序列比对（MSA查看器），用于对获得的序列进行彻底分析和比较。目前，该平台提供四个程序：BLASTN、BLASTP、BLASTX和TBLASTN，以及基因组、基因、CDS和蛋白质数据库的P10K集合。值得注意的是，结果可以根据生物体、身份、，E类-值和查询覆盖率。从BLAST结果中选择特定序列后，用户可以生成距离树并通过MSA查看器查看多序列比对。

讨论和未来方向

凭借丰富的信息和用户友好的设计，P10K数据库站在原生生物研究的前沿，在推进原生生物基因组学研究方面具有巨大潜力。它为全球科学界提供了宝贵的资源，使研究人员能够探索原生生物的遗传复杂性，并加速这一动态领域的发现。展望未来，P10K项目的下一阶段将集中于来自其他分类群的原生生物，目标是实现每个分类群中代表物种的广泛基因组覆盖。这些庞大的原生生物基因组资源将不断更新并整合到P10K数据库中。为此，我们将不断从数据库和相关文献中收集数据，建立年度批量搜索系统，并采用人工筛选，以确保综合文献数据的可靠性。同时，P10K数据库的数据表示和交互可视化将进一步完善，并将开发更多的生物信息学工具，如多序列比对、保守域预测和系统发育分析，为用户提供方便的在线服务。如果P10K数据库和NCBI分类系统之间的密码子表分配存在差异(11)，我们希望与NCBI分类小组建立密切合作(11)以及其他相关组织，共同解决这一问题，并确保原生动物物种遗传密码的精确表示。此外，我们将在P10K平台上开发一个系统，以便于无缝访问其他原生生物基因组平台，使用户能够访问与原生生物研究相关的更广泛的数据。总而言之，P10K数据库作为原生动物的专用数据门户，对于破译原生动物基因组序列、重建真核生物树以及解决人们广泛关注的基本科学问题具有重要意义和实用价值。

数据可用性

P10K数据库的程序集可以访问https://ngdc.cncb.ac.cn/p10k/本文报告的原始序列数据已保存在基因组序列档案中(50)国家基因组数据中心(51)，中国国家生物信息中心/中国科学院北京基因组研究所（PRJCA017400项目下），可在https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa.

补充数据

补充数据可从NAR Online获取。

致谢

我们感谢Protist 10000基因组项目（P10K）联盟的成员提出的有益建议。生物信息学分析得到了中国科学院超级计算中心武汉分院的支持。原生细胞的培养和维护得到了国家水生生物资源中心（NABRC）的支持。我们衷心感谢NGDC GSA和GWH Group，特别是Meili Chen、Xuetong Zhao、Yanling Sun、Yanqing Wang和Lili Dong，感谢他们在存储原始测序、基因组组装和注释数据方面的帮助，并感谢Zhoojing Fan在web界面设计方面的贡献。此外，我们还要感谢NCBI分类小组在遗传密码分配方面的帮助。

基金

国家重点研发计划[2020YFA0907400]；中国科学院战略优先研究计划项目[XDPB18，XDB38030400]；中国科学院青年创新促进会[2019104]；中国科学院国际合作项目[153F11KYSB20160008]；国家自然科学基金项目[32122015，32030021，3187221，31900339]；IUBS开放生物多样性与健康大数据项目。开放获取费用资助：中华人民共和国科学技术部；国家重点研发计划。

利益冲突声明。未声明。

工具书类

作者注释