TADB 3.0：细菌毒素-抗毒素基因座和相关流动基因元件的更新数据库

摘要

TADB 3.0版(https://bioinfo-mml.sjtu.edu.cn/TADB3网站/)是一个更新的数据库，提供了细菌I型至VIII型毒素-抗毒素（TA）基因座的综合信息。与前一版本相比，本文介绍了三个主要改进：首先，借助文本挖掘和人工管理，在实验支持下记录了536个TA基因座的详细信息，其中包括102、403、8、14、1、1、3和4个I～VIII型TA基因座；其次，通过利用升级的TA预测工具TAfinder 2.0和严格的策略，TADB 3.0收集了在34 789个完整测序的原核基因组中预测的211 697个假定的I型到VIII型TA基因座，为研究人员提供了一个大规模的数据集，用于进一步的后续分析和表征；第三，基于它们的基因组位置，69019个TA基因座和60898个移动遗传元件（MGE）的关系通过用户友好的网页访问的交互式网络可视化。通过最近的更新，TADB 3.0可以提供改进的生物信息学支持理解TA对在原核生物中的生物学作用及其与MGE的功能关联。

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介绍

毒素-抗毒素（TA）基因座是原核生物基因组中常见的小遗传模块，其流行性和多样性已在许多染色体和质粒中广泛记录(1). 通常，TA基因座由一对基因组成：一个编码抑制基本细胞功能的稳定毒素，另一个编码中和同源毒素活性的不稳定抗毒素。TA系统参与了细菌生存和适应所必需的各种生物过程，如应激反应(2)，噬菌体防御(三)，细菌毒性(4)，抗菌性(5)和质粒稳定性(6). 根据抗毒素的性质和作用方式，已知TA基因座可分为八类，即I型至VIII型(7,8). 大多数描述的毒素是蛋白质（I型到VII型），而毒素是VIII型TA对的RNA。抗毒素是II型和IV至VII型TA对的蛋白质，但是I、III和VIII型TA对中的RNA。

细菌可移动遗传元件（MGE），如原噬菌体、基因组岛（GI）、整合和结合元件（ICE）和质粒，通常含有具有选择性优势的基因，包括抗生素抗性决定因子和毒力因子，从而形成细菌进化和这些特征的传播(9,10). 值得注意的是，越来越多的证据表明TA基因座和MGE之间存在显著关联，突出了它们的功能相互作用(11–13). 例如，II型TA对已被很好地证明是成瘾模块，以确保在细菌复制期间维持质粒(6,14). 最近，一种质粒携带prpT/prpA轨迹红色假交替单胞菌被发现控制质粒拷贝数(15). TA基因座还与其他MGE（如基因组岛）的遗传稳定性相关(13)，前噬菌体(16)、整体元素和共轭元素(17)、和整合子(18). 有趣的是克雷塔VIII型TA基因座通过使细胞对CRISPR-Cas上瘾来维持CRISPR免疫(19). 因此，了解TA基因座和MGE之间的关系可能有助于阐明水平基因转移、细菌在环境胁迫下的存活以及细菌对变化环境的适应机制。

多年来，TA系统领域取得了显著进展，各种数据库为表征这些系统提供了宝贵的资源。塔斯马尼亚岛(20)是数据库存档生物信息学使用精心策划的HMM模型发现了I型到IV型TA位点。T1TAdb数据库(21)专门收集了I型TA基因座的信息，包括毒素肽和抗毒素RNA分子的注释。RASTA在线工具(22)搜索单个毒素或抗毒素蛋白的保守功能域，但其网站维护已于2011年停止。2011年，我们提出了开放访问数据库TADB1.1(23)将实验验证和生物信息学预测的II型TA对。2018年，我们发布了更新后的数据库TADB 2.0(24)系统地存档了更新的实验验证和生物信息学预测II型TA基因座，以及用于识别细菌基因组中II型TA位点的在线工具TAfinder。从那时起，数量迅速增加的新型II和其他类型的TA对已经被实验表征。此外，尽管TA基因座和MGE之间的相互作用在细菌生存和进化中起着至关重要的作用，但现有的TA相关数据库往往缺乏关于其关联性的全面信息。因此，迫切需要对数据库进行重大更新。

在这里，我们报告了TADB版本3.0的发布，它提供了实验支持的I型到VIII型TA对的最新综合沉积。同时，我们已将TAfinder升级到2.0版，大大扩展了其在完全测序的细菌和古生物基因组中预测广泛的I型到VIII型TA基因座的能力。此外，TADB 3.0提供了一个用户友好的网页，根据TA基因座和MGE的基因组位置查询和显示其关系。我们预计TADB 3.0将为探索TA对的多样性提供更好的支持，并为TA基因座和MGE之间的复杂关系提供关键见解。

材料和方法

通过文本挖掘和手动管理更新数据

在使用关键词“毒素-抗毒素系统”对PubMed的文献进行细致的手动管理后，TADB 3.0整合了自2017年以来发布的335篇TA系统相关出版物，使数据库中的论文总数达到921篇。在对这些论文进行文本挖掘和手动整理后，在TADB3.0中，实验验证的II型TA基因座的数量已从105个显著增加到403个。此外，这一更新的数据库包括102、8、14、1、1、3和4个分别经实验验证的I、III、IV、V、VI、VII和VIII型TA基因座(补充表S1). 值得注意的是，根据T1TAdb收集了36个I型TA基因座的家族和基因组位置(21)，并为这些I型TA位点建立了T1TAdb条目的超链接。此外，使用严格的预测策略，TADB 3.0还记录了16 009、168 794、55、16 685、2 786、2、388和6 978生物信息学分别预测I型至VIII型TA基因座，如下一节所述。因此，TADB 3.0数据库现在共存档了16 111、169、197、63、16 699、2 787、3、391和6 982个TA基因座，所有这些都可以在数据库中访问(补充表S1).

与前一版本类似，TADB 3.0继续使用PostgreSQL关系数据库、PHP数据管道和HTML web界面来组织TA位点数据。此外，Bootstrap库(https://getbootstrap.com/)和由JavaScript支持的数据可视化库，如ECharts(25)和SVGene(https://github.com/kblin/svgene)，添加到各种web界面，以实现更人性化的浏览。图中提供了TADB 3.0数据表示接口的图示1和补充图S1.通过InterProScan预测毒素和抗毒素蛋白的结构域(26). 对于每种毒素或抗毒素，使用NCBI BLASTp鉴定出类似的蛋白质(27). Clustal Omega对这些相似蛋白质进行了多重序列比对(28)随后通过R包msa可视化(29). 对于蛋白毒素和抗毒素，从RCSB蛋白质数据库（PDB）中获得了实验测定和预测的三维结构(https://www.rcsb.org/) (30)和AlphaFold蛋白质结构数据库(31)分别是。然后使用PDBe-Mol*可视化这些结构(32). 在RNA毒素和抗毒素的情况下，RNA二级结构由RNAfold预测(33)并通过VARNA进行可视化(34).

利用TAfinder 2.0预测原核生物全序列中的I型至VIII型TA基因座

TAfinder工具，最初引入TADB 2.0数据库(24)，旨在通过使用NCBI BLASTp搜索毒素或抗毒素蛋白的同源物来预测II型TA位点(27)和HMMER3(35). II型至VII型TA基因座通常由位于同一DNA链上的两个串联基因组成，编码同源蛋白伴侣。相反，I型TA系统由位于相反DNA链上的毒素基因和抗毒素RNA组成。VIII型TA系统由位于同一链或相反链上的毒素RNA和抗毒素RNA组成。在这项研究中，我们将TAfinder预测管道更新到2.0版，从而能够预测除II型以外的所有类型的TA位点(补充图S2).

简而言之，BLASTn对RNA同源物的预测被添加到管道中。蛋白质同源搜索模块和操纵子结构检测模块与II型到VII型TA位点预测的原始版本保持一致。值得注意的是，为了鉴定I型TA基因座，毒素基因和抗毒素RNA必须位于相反的DNA链上，而不是在同一链上形成操纵子结构。此外，为了识别VIII型TA基因座，我们考虑了两个实验验证的VIII型TA基因座的特征：克雷塔毒素和抗毒素RNA位于同一链或相反链上(19,36,37)和SdsR-RyeA，其中两个RNA位于相反的链上(38). 因此，我们根据这两个不同的VIII型TA基因座的各自特征对其进行了预测。BLAST参考数据集包括所有TADB 3.0存档的实验验证的蛋白质和TADB 3.0中存档的TA位点的RNA。此外，与之前版本的TAfinder相比，我们将毒素域的HMM图谱数量从108个扩大到207个，而抗毒素域的数量从201个增加到228个。

为了使用TAfinder 2.0对完全测序的细菌和古生物基因组进行TA位点预测，我们首先从NCBI RefSeq数据库下载了34 257个细菌和532个古生物完整基因组(39)2023年7月10日，包括36751条染色体和40457个质粒。随后，我们使用这些基因组序列和带注释的蛋白质编码序列作为TAfinder 2.0的输入，用于TA位点预测(补充图S3). 为了确保TA位点预测结果的高度特异性，我们只保留基于BLAST的蛋白质和核苷酸H（H）-值>0.36(40)作为候选毒素和抗毒素。此外，毒素或抗毒素蛋白的长度标准设定为30到500个氨基酸残基。除I型TA位点外，同一DNA链上假定毒素和抗毒素基因之间的基因间距离设置为–20至150 bp。对于I型TA位点预测，毒素基因和反义抗毒素sRNA之间的最大距离设置为200 bp，不限制重叠长度。对于VIII型TA基因座的预测，我们采用了不同的标准：毒素RNA和抗毒素RNA之间的最大距离设置为200 bp克雷塔而对于SdsR-RyeA，该距离设置为<0 bp。

鉴定与TA基因座相关的MGE

在本研究中，TA相关的MGE被定义为含有TA基因座的MGE或由TA基因座旁间隔<5 kbp的IS/转座子(补充图S3). 识别与实验验证和生物信息学预测TA基因座，MGE识别管道VRprofile2(41)首次用于鉴定细菌基因组中的MGE，包括原噬菌体、GI、ICE、整合子、IS/转座子和IS簇。然后分析TA基因座和预测的MGE的基因组位置，以确定TA相关的MGE。成对Mash距离(42)还计算了其中的MGE，Mash距离<0.01的MGE被视为类似的MGE。

TA相关的MGE显示在“浏览”页面、“统计”页面和TA基因座的详细信息页面上。在TA基因座、TA相关MGE、相应的类似MGE以及这些MGE所包含的所有TA基因座的“统计”页面和详细信息页面中，利用ECharts动态显示为交互式网络(25). 用户只需单击网络图中的MGE节点，或通过“浏览”页面上表格中的可用MGE按钮，即可访问每个MGE的全面详细信息。此外，在MGE的详细信息页面中，SVGene通过基因结构图直观地显示货物基因，包括TA对、抗生素耐药基因和毒力基因(https://github.com/kblin/svgene). 此外，通过熟料和clustermap.js对一组类似的MGE进行了对比分析和交互式可视化(43).

结果和讨论

与TADB 2.0相比，更新后的TADB 3.0数据库提供了三个主要改进：（i）在实验证据和支持下，手动管理超过500个i型至VIII型TA基因座；（ii）收集TAfinder 2.0-在34000个以上已完成测序的原核基因组中预测TA位点；（iii）TA基因座和MGE关系的图形表示。

用于I型至VIII型TA基因座的TADB3.0浏览模块

TADB 3.0提供了一个灵活且用户友好的web界面，其中包含了几个新功能（图1). 特别是，开发了“统计”模块，用于可视化TA基因座和MGE之间的关系、TA基因座在分类系统中的分布以及毒素和抗毒素蛋白质的同源网络(补充图S1). 在“浏览”页面和专用于各种类型TA基因座的详细信息页面上，用户可以访问有关菌株、TA家族、基因组背景、蛋白质域和相关MGE的全面详细信息（图1B年–F类). 例如relBE公司TA家族基因座(VCA0503/VC_RS15830-VCA0504/VC_RS158/35)是之前在霍乱弧菌O1生物型El Tor街N16961(18). 这个TA基因座位于一个超整合子内，在稳定这种MGE中起着至关重要的作用。同时，如VRprofile2所示(41)，TA位点的两侧也有一个假定的is5家族转座酶位于5kbp距离内，支持TA位点可能有助于其邻近区域的稳定性的观点（图1楼). 可视化此IS的5 kbp侧翼区域5家族转座酶揭示了它与另外三个TA位点的联系，除了VCA0503-VCA0504（图1G个). 此外，通过分析其他预测的TA基因座和MGE霍乱弧菌，我们发现超整合子和转座酶在霍乱弧菌基因组，如Iqbal所述，基因组也编码几个假定的TA基因座或两侧有几个TA基因座等。(18)（图1楼). 比较这些类似转座酶的侧翼基因组区域表明，这些区域在一定数量的霍乱弧菌正在分析的应变（图1小时).

严格预测原核基因组序列中的I型至VIII型TA位点

近年来，实验验证的TA对数量和原核基因组测序数据的可用性都有了大幅增加。随着信息的日益丰富，需要获得相对高置信度的TA位点预测数据集，以支持进一步的实验研究。利用TADB 3.0数据库中可用的经实验验证的I型至VIII型TA基因座(补充表S1)，我们已将II型TA基因座预测工具TAfinder升级到2.0版(补充图S2). 这个新版本能够利用从TADB 3.0数据库中新收集的实验验证数据预测I型到VIII型TA基因座。为了预测已完全测序的原核基因组中的TA基因座，从NCBI RefSeq数据库下载了34 257个细菌基因组和532个古细菌基因组(39). 随后，利用TAfinder 2.0预测这些基因组序列中的TA位点。为了提高我们预测的特异性和可靠性，我们采用了严格的方法，专门使用实验验证的TA对作为参考数据集，并实施了严格的策略(补充图S3). 简单地说，只有毒素和抗毒素BLAST与H（H）-值>0.36(40)被保留。因此，我们的预测在34 789个已完全测序的原核基因组中总共产生了211 697个TA基因座同源物，其中包括16 009个、168 794个、55个、16 685个、2 786个、2个、388个和6 978个I型到VIII型TA基因座的TA同源物(补充表S1).

数量最多的物种生物信息学每种类型的预测TA位点和每种TA类型内TA家族的分布显示在补充图S4作为研究最广泛的TA系统类型，II型TA基因座同源物是所有类型TA基因座同系物中最丰富的，部分原因是用于预测的大量实验验证的II型基因座。在携带II型TA基因座同源物的物种中，99.1%（2769/2795）的分析大肠杆菌基因组在染色体和质粒中均含有39 324个假定的II型TA位点，每个菌株约有14个II型TA座位(补充图S4B). II型TA基因座在大肠杆菌可以部分归因于完全测序的广泛可用性大肠杆菌基因组。除此之外，结核分枝杆菌菌株平均拥有50个以上的TA位点，数量明显超过其他物种。同时，在一些临床病原体中，每个菌株的假定II型TA基因座的平均数量很高，例如霍乱弧菌（17.3）和肺炎克雷伯菌(11.3). 在预测的II型TA基因座中，TA家族vapBC公司,higBA、relBE和mazEF公司广泛分布于预测II型TA基因座数量最多的前20个物种中，而其他一些科，如嘻哈音乐在某些物种中似乎很丰富。

预测的TA基因座已在TADB 3.0数据库中编目，可供浏览和下载。然而，值得注意的是，预测结果可能无法准确地表示TA基因座和TA家族在原核生物中的分布，而是用作参考目的的高置信预测，突出了值得进一步实验验证和调查的潜在TA基因座。此外，对于对特定细菌菌株特别感兴趣的用户，强烈建议使用TAfinder 2.0，对TA位点预测的阈值要求较低。

基于基因组定位的TA-MGE关系研究

TA对被提议在维护包含这些遗传模块的MGE中发挥作用(13,16–18). 在获得实验验证的TA基因座和生物信息学预测TA基因座，然后利用VRprofile2(41)鉴定TA-环原核菌株中的各种MGE(补充图S3). 在本研究中，TA相关的MGE被定义为含有TA基因座的MGE或间隔<5kb的TA基因座侧翼的IS/转座子(补充图S3). 因此，在TADB 3.0中存档的211 697个TA基因座中，69 019个（32.6%）TA基因座被预测与60 898个MGE相关，导致总共82 018个TA-MGE关系（图2,补充表S2和补充图S5). 在各种类型的MGE中，前噬菌体和质粒与TA位点的关系频率最高。在分析的40457个质粒中，发现有14163个（35.0%）编码至少一个TA位点。此外，基因组岛和ISs/转座子也与TA位点有显著关联。对于II型TA位点，观察到其中31.7%（53 678/169 197）与MGE相关，尤其是质粒、基因组岛和原噬菌体（图2). 有趣的是，大多数已鉴定的III型TA位点（51/63，81.0%）与MGE相关，尤其是质粒。这一观察可能归因于目前可用的实验验证的III型TA基因座数量相对较少，再加上我们严格的预测方法，这可能导致对III型TA位点的预测较少。此外，我们还分析了TA家族在不同类型MGE中的分布(补充图S6). 在TA家族中，II型TA家族relBE公司与MGE的联系最多，其次是II型TA家族higBA公司和I型TA系列洋蓟同时，IV型TA家族是UV（也称为cbtA-cbeA型)也经常与MGE相关。值得注意的是，II型TA家族relBE公司与所有类型的MGE相关，而大量IV型TA家族的TA位点是UV位于基因组岛内，但很少在质粒上发现。然而，值得注意的是，由于我们的MGE预测仅关注携带TA基因座的菌株，因此需要进一步调查以确定与TA基因座相关的每种MGE类型中MGE的比例。

结论

在这里，我们报道了TADB的一次重大升级，主要关注TA基因座及其与MGE的关系。TADB 3.0收集并整合了I型至VIII型TA基因座的系统信息。总的来说，我们的严格分析使用了一种稳健的方法，该方法结合了实验验证的TA基因座和严格的阈值设置，在完全测序的原核基因组中产生了高度特异的TA基因位预测结果。此外，TADB 3.0对假定TA基因座和MGE的关系提供了深入的可视化。总之，TADB 3.0中的这些结果为研究人员提供了进一步研究的坚实基础，同时认识到需要进行未来的实验研究，以全面探索TA对在原核生物中的分布和功能意义。

数据可用性

TADB 3.0可从以下网站免费获得：https://bioinfo-mml.sjtu.edu.cn/TADB3网站/.

补充数据

补充数据可从NAR Online获取。

基金

国家自然科学基金资助项目[32070572]；上海市科学技术委员会[19JC1413000]。开放存取费资助：国家自然科学基金[32070572]和上海市科学技术委员会[19JC1413000]。

利益冲突声明。未声明。

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