BloodChIP Xtra：健康人类干/祖细胞亚群和白血病细胞中比较全基因组转录因子结合和基因表达谱的扩展数据库

摘要

BloodChIP Xtra数据库(http://bloodchipXtra.vafaeelab.com/)有助于全基因组探索和可视化罕见的原始人类造血干细胞（HSC-MPP）和祖细胞（CMP、GMP、MEP）以及急性髓细胞白血病（AML）细胞系（KG-1、ME-1、Kasumi1、TSU-1621-MT）中的转录因子（TF）占有率和染色质配置，以及来自这些患者和原发性AML的染色质可及性和基因表达数据。与我们早期的数据库BloodChIP（两种主要细胞类型和两种细胞系）相比，BloodChIP-Xtra的数据集要多得多。确定TF占用率和染色质可及性的改进方法提高了健康和AML造血谱中罕见原代细胞类型的数据可用性。然而，仍然需要以易于访问的方式集成这些数据，以便进行基于基因的查询并在下游应用程序中使用。在这里，我们提供了一个基于健康干/祖细胞类型中关键造血TF和组蛋白标记的全基因组结合图谱的用户友好数据库。将其与源于原代和细胞系AML的结合图谱和染色质可及性进行比较，并与相应细胞类型的表达数据进行整合。所有查询都可以导出以构建TF-基因和蛋白质-蛋白质网络，并评估基因与特定细胞过程的关联。

图形摘要

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介绍

转录因子（TF）和顺式-它们结合的调控DNA序列是控制基因表达和最终细胞身份的基因调控网络（GRN）的组成部分(1–3). GRN由基因及其相关调控元件（启动子和顺式-调控元件（CRE），如增强子）和DNA结合蛋白（包括TF），通常是多因子调控复合物的一部分，人们越来越了解其包含RNA和蛋白质。调控元件的可及性受到直接DNA修饰（如CpG甲基化和组蛋白翻译后修饰）的调节，即使CRE处于开放构象，这些元件的DNA序列至少部分决定了哪些TF可以结合(4，5). 启动子及其CRE之间的相互作用，由染色质环和转录调节因子复合物介导，调节转录爆发频率和输出，从而调节细胞身份。

干细胞具有自我更新或产生子细胞的能力，子细胞具有越来越特殊的功能和有限的增殖能力，在分化轨迹上发生的细胞身份变化与受谱系特异性GRN控制的转录程序改变直接相关。造血是脊椎动物最具特征的发育系统之一，是成人干细胞多系分化的模型系统。造血干细胞（HSC）通过其自我更新或分化为成熟细胞类型的能力维持循环血细胞的产生。最原始的HSC具有多谱系潜能，但随着谱系限制的增加而产生祖细胞(三，6). 然而，控制人类成年HSC及其后代身份的GRN的组成和层次，以及它们在白血病细胞中被劫持或重新激活的机制，仍不完全清楚。

TF在结合远端调节元件的多蛋白复合物中发挥作用，并与启动子相互作用，与大量染色质修饰物和转录起始/延伸因子一起启动、调节或抑制基因表达。七种TF的核心组（七肽：ERG、FLI1、GATA2、RUNX1、TAL1、LYL1和LMO2），所有已知的健康和白血病造血调节因子(7–14)，共同调节造血干细胞和祖细胞（HSPC）的基因表达。七叶皂苷TF也有助于白血病细胞中的干细胞样基因表达特征，其存在与患者生存率低相关(15). 在HSC做出血统承诺决策时，了解这些TF如何与其他血统特异性TF合作和相互作用，对于提高我们对健康和白血病血液发育的理解至关重要。

为此，我们最近生成了七肽TF、CTCF、STAG2、主髓细胞调节因子PU.1、H3K27ac、H3K4me3、H3K17me3以及罕见造血亚群（干/多能祖细胞[HSC-MPP]加普通髓细胞[CMP]、粒细胞-巨噬细胞[GMP]）中H3K17ac HiChIP的高质量ChIPseq数据和巨核细胞红细胞[MEP]祖细胞）跨越骨髓/红细胞谱系的HSC承诺(5). 为了优化这些数据的实用性，BloodChIP Xtra将我们的染色质占有率数据与已发表的健康HSPCs、原发性AML和AML细胞系的染色质占有率和可及性以及表达数据进行了整合。与我们早期的数据库BloodChIP相比，这些数据集显著增加了可以查询的数据量(16). 所有分析和过滤的数据集都可以导出用于下游分析，我们还提供了到外部资源的链接，例如UCSC基因组浏览器以可视化数据，以及基因表达图谱以查询其他细胞类型中的表达。

材料和方法

数据来源和分析策略

数据源汇总于补充表S1(5，17–29)，所包含数据集的示意图如图所示1数据分析和输出格式摘要如图所示2.

ATACseq数据

健康人群的ATACseq峰值坐标（峰值±250 bp）从基因表达总表（GEO）下载(30)加入GSE74912(28)并使用UCSC LiftOver工具将hg19转化为hg38参考基因组(31). 使用基因组区域注释工具（GREAT）v4.0.4，使用带有默认参数的基本扩展方法，将得到的590650个峰分配给基因(32，33).

从序列读取档案（SRA）下载的序列文件(34)或ArrayExpress(35) (补充表S1)，转换为fastq格式，并使用BWA v0.7.17与GRCh38基因组对齐(36). 使用picardMarkDuplicates去除线粒体和重复读数，使用alignmentSieve转移读数以解释Tn5介导的切除，合并重复样本，峰值称为MACS2 v 2.2.7.1(37)具有最小阈值P（P）-值为1×10⁻⁵，并跟踪使用deepTools bamCoverage和RPKM规范化生成的UCSC浏览器中的可视化(38). E-MTAB-9021中的样本是单端读取，在这种情况下，处理管道中省略了alignmentSieve步骤。通过合并HSC和MPP副本中的所有bam文件，在UCSC浏览器上生成用于可视化的合成HSC-MPP ATACseq轨迹。ATACseq轨迹可在以下位置进行可视化http://genome.ucsc.edu/s/PimandaLab/BloudChIP_Xtra_ATAC.

ChIPseq数据

急性髓细胞白血病（AML）细胞系KG-1的全基因组TF和组蛋白结合谱(22，24)，ME-1(22，25)，Kasumi-1(18–21)，TSU-1621-MT(26)来自SRA(补充表S1). 序列读取被转换为fastq，并使用cutadapt进行处理以删除适配器(39)，使用命令行工具“cut”修剪到最大长度为100（未修剪小于100的读数），然后使用BWA v0.7.17校准仪映射到GRCh38基因组(36)，使用MACS2 v2.2.6调用的峰值(37)，以及使用deepTools的bamCoverage和RPKM规范化生成的UCSC浏览器中的可视化轨迹(38). 为了一致性，所有样本均作为单端序列数据进行处理。如前所述，对健康人HSC-MPP、CMP、GMP、MEP的全基因组TF和组蛋白结合谱进行处理(5). 对于K27ac和K27me3，使用选项“–宽”调用峰值。呼叫峰值控制是由HSC-MPP、CMP、GMP、MEP（健康人类细胞）或KG-1、ME-1和HSPC（AML细胞系）组成的复合IgG轨迹。ChIPseq轨迹可在以下位置进行可视化http://genome.ucsc.edu/s/Pimanda实验室/BloudChIP_Xtra_TF（TF）和http://genome.ucsc.edu/s/PimandaLab/BloudChIP_Xtra_epientics（组蛋白）。

峰值重叠

使用bedtools intersect确定了ChIPseq和ATACseq峰之间的交叉区域以及590650个峰组(40). 只有当ChIPseq峰的峰宽大于10%与ATACseq峰重叠时，才考虑交叉。然后，从最终数据集中排除任何包含的数据集中没有相应ChIPseq或ATACseq峰的ATACsez峰，最终数据集包含387291个峰。

基因表达

具有可用基因表达数据的样本如所示补充表S2从GEO（GSE74246）下载健康人HSPC亚群和白血病亚群的RNAseq计数表(28). 主要人类AML样本的RNAseq计数表和相应的临床注释（BeatAML2）(41)已从下载https://biodev.github.io/BeatAML2/癌症细胞系百科全书中AML细胞系的RNAseq计数表(42)已从下载https://depmap.org/portal/download/all/？releasename=depmap+公共+23Q2&filename=OmicsExpressionGenesExpectedCountProfile.csv.RNAseq读取TSU-1621-MT细胞(26)从SRA（SRR1552863，SRR1552664）下载，并与人类基因组（GRCh38.p13；下载自https://www.gencodegenes.org/human/release_43.html)使用STAR v2.7.9a(43). 基因计数表采用百万分之一对数计数标准化。如果多个ENSG-id指的是同一个基因符号，则已报告所有样本（在该数据源内）中总表达量较大的ENSG-id。

数据库实施、web界面和可用性

BloodChIP Xtra数据库以逗号分隔值（CSV）和制表符分隔值（TSV）格式存储和访问。我们的用户友好的web界面，可在http://bloodchipXtra.vafaeelab.com/，已使用JavaScript开发，简化了数据访问，并通过基于Python的脚本实现了转录因子（TF）结合和基因表达的可视化。此界面利用了Plotly(https://plot.ly网站)用于生成可下载的基因表达框图。完整的数据集也可直接下载http://bloodchipXtra.vafaeelab.com/downloads（http://bloodchipXtra.vafaeelab.com/downloads）/.

结果：数据库功能

通用web界面

默认的BloodChIP Xtra界面显示数据过滤器、搜索框和列出数据集中所有注释基因的表格(补充图S1A). 与每个基因相关的带注释的ATACseq峰（结合图谱）的数量与UCSC基因组浏览器的链接一起显示，以便在该基因位点上可视化TF、表观遗传（Epi）和ATACseque（ATAC）图谱。可以同时显示TFs/组蛋白和细胞类型的任何组合的结合状态；可以使用显示过滤器自定义显示的特定绑定配置文件。还可以显示与每个基因相关区域的TF结合汇总表，或显示原始健康细胞、白血病细胞和AML细胞系中单个基因表达的绘图。

点击箭头可展开基因行，以便探索与该基因相关的峰值(补充图S1B). 图中显示了每个峰的基因组坐标，红色表示特定TF在指定细胞类型的该峰上结合，蓝色表示未检测到结合峰。没有数据的峰值/单元类型组合以灰色显示。

查询数据库

数据库可以通过基因名称或TF绑定进行查询(补充图S1A). 对于基因查询，可以输入单个基因或多个基因。为了检索特定细胞类型中可能受特定TF调控的基因，用户可以使用TF和细胞类型的任意组合构造查询，以识别由多个TF（“and”）组合绑定或由任何TF（”or“）绑定的基因。

下游分析

为了促进下游分析和数据可视化，提供了Expression Atlas的链接(44)跨多个数据集显示选定基因的转录组和蛋白质组数据。该网络接口还允许从查询的一组基因中导出数据；可以导出单个基因的TF结合信息，并且可以导出查询检索到的所有基因的规范化表达值，以便于进行外部分析，例如聚类或生成热映射。

BloodChIP Xtra的效用：分步示例

BloodChIP Xtra允许用户查询8个细胞系中的10个TF、ATACseq和3个组蛋白修饰。通过UCSC基因组浏览器可以显示分馏的原代AML细胞的其他ATACseq图谱，并且可以显示任何基因的800多个独特样本的基因表达图，这些样本跨越正常造血、原代和AML细胞系。要启动查询，用户首先输入感兴趣的基因。例如，搜索基因，ERG公司搜索时返回数据表中的一行[ERG GATA2 TAL1公司]为每个基因返回一行(补充图S2A). 然后可以使用基因数据库表来搜索搜索结果。

基因数据库表的行显示了与搜索参数一起返回的基因，使用GREAT映射到该基因的基因组区域的数量在“绑定配置文件”列中指示(补充图S2A). 在UCSC浏览器中提供到预编译会话的链接，用户可以选择可视化所有可用细胞类型的TF结合（TF）、组蛋白标记、H3K27ac-HiChIP、CTCF、RNApolII和STAG2（Epi）或ATACseq（ATAC）数据。用户还可以通过单击“基因表达式”列中的“查看”按钮来显示和可视化所有细胞类型的基因表达，该列将启动一个弹出图(补充图S2B，ERG公司基因）。样品按电池类型分组，颜色与图中所示的电池类型相对应1将BeatAML2队列中的样本划分为单个组，也划分为临床相关突变亚型的亚组(补充表S2) (45). 单击绘图图例可以打开和关闭单个单元格类型。用户可以使用Expression Atlas的链接进一步探索该基因，或查看GREAT分配给该基因的所有结合事件的摘要(补充图S2C，GATA2基因基因）。

单击基因名称左侧的箭头可以显示其他详细信息，该箭头将显示在“显示过滤器”复选框中选择的绑定配置文件和细胞类型(补充图S2D). 扩展的表格显示了GREAT映射到该基因的所有区域中每个因子和细胞类型的峰值的存在（红色）或不存在（蓝色）(补充图S2E). 在所示的示例中TAL1（目标1）在chr1:47 232 180–47 232 680处，GATA2、RUNX1、TAL1、LYL1和LMO2明显结合，对应于TAL1（目标1）发起人(补充图S2F). 灰色方块表示该因子/单元类型组合没有可用数据。TFs/组蛋白和细胞类型的任何组合的数据都可以同时显示，从而方便地可视化比较结合图谱。此外，将显示每个区域的坐标，并将其链接到三个UCSC浏览器会话。

或者，可以构造一个更复杂的查询来返回特定细胞类型中被选定因子绑定的基因。“添加过滤器”按钮允许输入多个因子/单元类型组合，可使用AND/OR组合查询。例如，搜索MEP中与七肽结合的基因可以检索到856个基因；然后这些基因填充基因数据库表(补充图S2G). 对于其他分析，下载页面上提供了完整的数据表，其中包含125个因子/细胞类型组合的峰值调用和>800个个体样本的基因表达数据。

讨论

TF在共同调控基因的增强子和启动子处的组合相互作用是决定细胞特性的基因调控网络的核心组成部分(46). 我们最近生成了10个关键TF和3个组蛋白修饰的高质量ChIPseq数据，以及H3K27ac HiChIP，这些数据分布在骨髓/红细胞谱系中跨越HSC承诺的罕见造血亚群中(5). 在这里，我们将这些数据与来自健康和白血病细胞的额外TF占用率、染色质可及性和基因表达数据进行了整合（图1，补充表S1)并创建了一个用户友好的数据库，允许用户（i）查询感兴趣基因位点的重叠TF结合，（ii）发现感兴趣TF的结合坐标和相关基因靶点，以及（iii）比较健康细胞和白血病细胞之间的结合谱。其他功能包括数据下载和链接，以进一步可视化和探索基因表达。该数据库的总体目标是帮助理解HSPC转录网络在沿着髓系/红系轴的谱系承诺和白血病发生期间的动态变化。

了解细胞命运决定背后的调控网络，以及白血病细胞中这些网络受到干扰的方式，具有重要的翻译意义。例如，具有潜在遗传原因的骨髓衰竭综合征可能适用于以HSC为靶点的基因治疗方法，以产生正确的分化细胞。然而，需要广泛了解谱系承诺期间的时空基因调控，以避免因转基因表达不当而导致谱系扭曲。血统特异性增强子已成功用于克服这一问题，并在Diamond-Blackfan贫血患者中挽救红细胞分化(47). 相反，基因调控网络在多种AML亚型中受到干扰(1，48)通常通过反复移位事件(49–54)越来越多的人认为，它们包括可以介导增强子劫持和致癌转化的小结构变体(55–59). BloodChIP-Xtra为发现可用于基因治疗方法的谱系特异性调节元件或了解白血病细胞中新结构变异的潜在临床后果提供了一种可访问的工具。

BloodChIP Xtra目前包括健康HSC-MPP、CMP、GMP和MEP、原代AML和四种AML细胞系，这些细胞系的相关TF结合染色质和/或可及性数据可用，以及来自800多个健康和白血病样本的基因表达数据。随着更多高质量数据集的发布，数据库将进行扩展，以容纳更多的TF结合图谱和其他基因组调控器。我们相信，BloodChIP Xtra将组合TF结合与正常和恶性细胞中的基因表达结合在一起，将成为从事造血和白血病研究的生物学家和生物信息学家以及更广泛地从事基因调控和干细胞生物学研究的人的有用工具。

数据可用性

BloodChIP Xtra数据库可免费访问http://bloodchipXtra.vafaeelab.com/。本文所依据的数据可在以下任一GEO中获得：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo网站/或ArrayExpress位于https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress中提供了所有数据登录号补充表S1.

补充数据

补充数据可在NAR Online上获得。

致谢

作者感谢新南威尔士州IT部门的Steven Yong、Daniel Gov、Matthew Tolhurst和Richard Green对原始BloodChIP数据库的持续更新和维护。

基金

安东尼·罗特纪念信托基金[致J.A.I.T.，J.E.P.]；香港创新技术基金[MHP/054/21 to J.W.H.W.]；澳大利亚国家卫生和医学研究委员会[GNT1139787，GNT2011627，MRF1200271 to J.E.P.]；白血病淋巴瘤学会（LLS）-斯诺多姆基金会-白血病基金会的转化项目资助[6620-21 to J.E.P.]。开放存取费用的资金来源：安东尼·罗特纪念信托基金。

利益冲突声明。未声明。

工具书类

作者注释