摘要
蛋白质翻译是通过tRNA氨酰化和核糖体延伸来进行的。在tRNA高度保守的结构中,它们具有促进与同源氨酰tRNA合成酶(aaRS)相互作用的显著特征。这些关键特征被称为身份元素。在我们的研究中,我们研究了安装22第氨基酸,吡咯烷(tRNA派尔:PylRS)。吡咯烷酰-tRNA合成酶(PylRSs)在一些古生物和细菌基因组中天然编码为酰化tRNA派尔用吡咯烷。它们的大氨基酸结合口袋和对tRNA反密码子的较差识别有助于整合>200个非经典氨基酸。根据其基因组结构,PylRS酶可分为三类。两类都包含N端和C端结构域,但第三类(ΔpylSn)缺少N端结构域。在本研究中,我们探索了ΔpylSn tRNA的tRNA识别元件派尔从绿念珠菌它驱动了与其同源的PylRS(MaPylRS)的正交性。通过氨酰化和翻译分析,我们确定了ΔpylSn tRNA中的五个关键元素派尔MaPylRS活动所必需的。发现缺少碱基(位置8)和G–U摆动对(G28:U42)会影响tRNA的高分辨率结构,而分子动力学模拟使我们认识到G–C碱基对(G3:C70和G5:C68)所赋予的刚性。
Lay摘要
被称为PylRS的酶具有用非天然氨基酸扩展活细胞自然遗传密码的非凡能力。目前,在PylRS及其伴侣tRNA的帮助下,200多种非天然氨基酸可以进行基因编码派尔使我们能够赋予蛋白质新的属性,或使用光交联或诱导交联来调节蛋白质活性。PylRS酶的一个有趣特性是,当来自不同生物体(如古生菌)的两个PylRS同源物时,它们能够避免交叉反应马氏甲烷八叠球菌和阿尔维斯嗜甲烷菌-在单个细胞中共同表达。这使得在单个蛋白质中同时编码两种非天然氨基酸成为可能。本研究通过低温电子显微镜、生物化学和分子模拟阐明了PylRS特异性的难以捉摸的机制。PylRS与M.阿尔维斯带有tRNA派尔最好将其描述为拼图中的两块;其中PylRS识别其同源tRNA的独特形状,而不是tRNA序列中的特定核苷酸,就像其他tRNA结合酶一样。这一发现可能简化了多种非天然氨基酸同时遗传结合工具的合理设计,从而促进了研究、医学和生物技术用有价值蛋白质的开发。
介绍
转移RNA(tRNAs),促进蛋白质翻译的基本过程,将mRNA序列转化为蛋白质。大多数参与蛋白质翻译的tRNA具有高度保守的三级结构,与细菌中的延伸因子EF-Tu相互作用,并有效地通过核糖体。然而,每种tRNA都有其独特的特征,这些特征被其同源氨酰tRNA合成酶(aaRS)识别,将相应的氨基酸附着在tRNA的3′CCA末端。这些被称为tRNA识别元件,包括4–7个碱基,这些碱基或促进与同源aaRS(决定簇)的相互作用或防止与非同源aaRS相互作用(反行列式)。在特定生物体中,20个典型tRNA同工酶基团的特征元素已被很好地描述(1,2)最近扩展到所有生命领域的tRNA基因(三)。
在一些生物体中,还有额外的翻译系统,它们重新利用终止密码子来促进多达22个氨基酸的插入。有证据表明,在生命的所有三个领域中都有UGA编码以插入硒代半胱氨酸(第21个氨基酸),而UAG编码则主要存在于古生物物种和一些细菌中,以插入第22个氨基酸吡咯烷(Pyl)(4,5)。与20个典型氨基酸类似,Pyl也有一个专门的tRNA:aaRS对(tRNA派尔:PylRS)进行蛋白质翻译。已鉴定出三种不同类别的PylRS酶,根据存在的结构域及其基因组组织命名。这个pylSc-pylSn类(位于马氏甲烷八叠球菌)具有C端域(CTD)和N端域(NTD)通过连接器融合在一起,而在pylSn公司(在中找到哈夫尼脱硫杆菌)CTD和NTD是翻译后结合在一起的两个独立基因(图第1页)。最后一节课,ΔpylSn(在中找到绿念珠菌)缺乏tRNA-binding NTD,但在大肠杆菌(图1) (6)。考虑到NTD是高效的体内的活动pylSn公司和pylSn-pylScPylRS类(7)。
图1。
(A类)三类不同PylRS酶的结构域示意图(NTD,N末端结构域;VL,可变连接子;CTD,C末端结构域)。(B类)立体交叉结构Ca.M.阿尔维斯和马赛先生tRNA派尔(分别为Ma和Mm)和描述其同源PylRS(分别为MmPylRS和MaPylRS)中的域。图像表示改编自(47)。MaPylRS为ΔpylSn公司类和MmPylRS属于丙基锡类。箭头中的数字表示PylRS对tRNA的相对翻译活性派尔由我们的体内以Pyl为底物的测定。
这个ΔpylSn类酶与其他两类PylRS正交,无法识别各自的tRNA派尔(图1B年) (8)。这表明在tRNAs上存在来自ΔpylSn类别(ΔN tRNA派尔)通过CTD-only PylRS促进氨基酰化。tRNA的3 nt可变臂派尔已被证明对氨基酰化很重要pylSn公司和pylSn-pylSc类酶(8,9)。较长的可变臂(4 nt或更多)与PylRS的NTD发生空间冲突,阻止该酶识别任何其他内源性tRNA(9)。来自ΔpylSn然而,类没有NTD,因此此功能不被视为标识元素。相反,通过在ΔN tRNA的可变臂上添加额外的核苷酸派尔,这在其他两类PylRS酶之间创建了一个正交翻译系统(8)。
在这里,我们系统地研究了哪些核苷酸驱动PylRS和tRNA之间的相互作用派尔从M.阿尔维斯(ΔN tRNA派尔)。氨酰化和翻译分析发现五个碱基位置(包括缺少碱基),它们对M.阿尔维斯PylRS(MaPylRS)。结构研究表明,五个碱基位置中的两个引起了tRNA结构的变化M.阿尔维斯tRNA派尔(马tRNA派尔)与相比时马赛先生tRNA基因派尔(百万tRNA派尔)。这使得其他三个碱基位置无法明确它们对于促进MaPylRS识别的重要性派尔我们认识到,我们识别的所有五个碱基位置共同创造了MaPylRS识别的定义结构。我们的数据首次表明,碱基的缺失为tRNA识别提供了一个新的视角,酶识别的机制可能在tRNA治疗的个性化医学中具有前景。
材料和方法
分析材料的准备
pBAD_sfGFP2am_tRNA
tRNA变体被克隆到pBAD_sfGFP2am中(10,11)反向(3′至5′)。首先,通过扩增tRNA周围的质粒打开pBAD_sfGFP2am载体。在DpnI(新英格兰生物实验室®)消化和净化以去除甲基化的母体质粒后,将产物用作模板,通过两个重叠引物插入tRNA(耶鲁大学W.M.凯克基金会)。第一个引物位于相反方向(3′至5′),与pBAD_sfGFP2am的rrcn终止子互补至少15 bp,尾部包含tRNA序列的一部分(~50 bp)。第二个引物在正向(5′至3′),与第一个引物的3′端互补至少20 bp,继续与tRNA序列的其余部分互补,然后与pBAD_sfGFP2am的Lpp启动子互补至少15 bp结束。NEBuilder HiFi(新英格兰生物实验室®)用于在转化为DH5α细胞进行质粒制备和测序之前确保完整的载体组装(耶鲁大学凯克基金会)。
pMW-PylRS-pylBCD
这个pylBCD公司用于改进Pyl生物合成的变异体3f2从其亲本质粒中扩增出来(Joanne M.L.Ho博士的礼物)(12)添加EM7启动子。pMW-PylRS质粒(11)含有来自Ca.M.alvus公司,马赛先生通过反向扩增引物,在卡那霉素抗性基因下游打开或缺失酶。这个pylBCD公司由于插入了PCR扩增的互补区域,因此使用NEBuilder HiFi(新英格兰生物实验室®)将盒式磁带插入打开的pMW-PylRS中。
MaPylRS蛋白的表达与纯化
大肠杆菌用含有N末端His标记的MaPylRS的pET28a载体转化BL21(DE3)。转化细胞在2×YT培养基中生长,并在37°C、250 rpm、OD条件下添加50μg/ml卡那霉素600=0.6,此时温度降至25°C,并用0.1 mM异丙基-β诱导蛋白质表达-d日-硫代半乳糖苷(IPTG)。18小时后,通过离心收集细胞,将其重新悬浮在50 mM Tris pH 8.0、50 mM NaCl、5 mM MgCl中2(缓冲液A)并通过超声波进行溶解。通过离心去除细胞碎片,然后用30%的硫酸铵将蛋白质从澄清的裂解液中沉淀为两个部分。从60%(w/v)硫酸铵馏分中沉淀的蛋白质在缓冲液B(50 mM Tris pH 8.0,250 mM NaCl,5 mM MgCl2)含有20mM咪唑并在重力流柱中使用Ni-NTA树脂纯化。使用含有250 mM咪唑的缓冲液B洗脱结合蛋白,然后使用Amicon离心过滤装置(10 kDa MWCO)将缓冲液交换至缓冲液A。蛋白质在Q Sepharose Fast Flow柱上进一步纯化,用缓冲液B洗脱,然后用Superdex Increase 10/300 GL尺寸排除柱与存储缓冲液(20 mM Tris pH 8.0,200 mM NaCl,5 mM MgCl)预平衡2,1 mM二硫苏糖醇)。将纯级分浓缩至>30mg/ml,并在液氮中快速冷冻。
tRNA的体外转录
DNA模板在体外tRNA转录派尔从适当的pBAD_sfGFP2am_pylT质粒中扩增出变异体。正向引物在5′端包含14 bp的尾部,T7启动子序列,与tRNA序列的5′端互补16 bp。反向引物补充tRNA的3′端。使用GoTaq®Master Mix(Promega)进行PCR扩增,并使用标准苯酚-氯仿萃取纯化扩增的DNA。如前所述设置转录反应(13)使用18–22 mM MgCl2并进行纯化。
氨酰化和翻译研究
体外氨酰化试验
这个在体外转录tRNA派尔变体首先在3′端用[α-32P] -ATP,如前所述(14)。氨基酰化反应用5μM32P标记的tRNA派尔,625 nM MaPylRS,缓冲液中250μM Pyl(100 mM HEPES[pH 7.2],100 mM NaCl,25 mM MgCl2,5mM ATP,1mM二硫代苏糖醇)。如前所述,在5μl溶液(200 mM醋酸钠中0.5 U P1核酸酶,pH 5.5)中,在15 s、1 min和15 min的时间点将反应猝灭30 min。通过在TLC板上分离带电tRNA和未带电tRNA,监测这些反应中的氨酰化效率(14)。双面t吨-对所有活性分析进行测试n个 = 3.
体内荧光分析
用pBAD_sfGFP2am_pylT(含有相应的tRNA)转化DH10B细胞派尔变体)和pMW_PylRS_pylBCD(具有感兴趣的PylRS),并在选择板上生长过夜。将单个菌落转移到底部透明的96周黑板中的150μl表达培养基(含100μg/ml氨苄西林、50μg/ml卡那霉素、0.1%(w/v)阿拉伯糖和1 mM IPTG的Luria培养液)中。在Synergy HTX平板阅读器(BioTek)中,平板在37°C下培养24小时。荧光(例如485 nm,Em.528 nm)和A类600每15分钟进行一次测量,至少进行四次生物复制。在16小时时,通过将荧光测量值除以A类600用Ma-tRNA读取并比较其与MaPylRS的活性派尔.双面t吨-所有活性测定均使用n个 = 4.
核糖体的结构研究
样品制备
Ma-tRNA的冷冻电镜标本派尔和Mm tRNA派尔如前所述准备(13)。使用MotionCor2校正了样品的梁诱导运动和因热漂移导致的级不稳定性(15)。使用CTFFIND4估算每个显微照片的对比度传递函数(CTF)(16)。使用RELION软件中包含的Autopicker算法拾取成像粒子(17)。
低温电磁分类
对于Ma tRNA派尔与核糖体复合(补充图S1)从14092张显微照片中提取2386471个颗粒。对四次装箱的颗粒进行二维分类,将核糖体样颗粒从Autopicker算法拾取的冰样和/或碎屑样颗粒中分离出来。1 203 474个粒子被保存用于3D分类。其中,920 880个粒子是从高分辨率3D类别中选择的,用于聚焦3D分类。对重新提取的颗粒进行聚焦三维分类,无需装箱。412 295个含有Ma tRNA的颗粒派尔选择密度进行自动重定义。
对于Mm tRNA派尔与核糖体复合(补充图S2)从27651张显微照片中采集到538559个颗粒。对四次装箱的颗粒进行二维分类,将核糖体样颗粒从Autopicker算法拾取的冰样和/或碎屑样颗粒中分离出来。保存了3 240 791个粒子用于3D分类。其中,3 166 597个粒子是从高分辨率3D类别中选择的,用于聚焦3D分类。对重新提取的颗粒进行聚焦三维分类,无需装箱。405 164个含有Mm-tRNA的颗粒派尔选择密度进行自动重定义。
对来自这些类别的未装仓的粒子进行自动细化。最后的密度图通过应用自动程序估计的负B因子进行锐化。使用ResMap估计局部分辨率变化(18)并通过UCSF Chimera可视化(19)。
模型构建和细化
的模型大肠杆菌使用UCSF Chimera将70S核糖体(5WE4)对接到地图中(19)。手动调整所有模型,然后针对Coot中缺失的残留物构建de-novo(20)然后是凤凰(21)和Refmac(22)精细化。所有显示电子密度和原子模型的图形都是使用UCSF Chimera创建的(19)和PyMOL分子图形系统。
分子动力学模拟
两种Ma-tRNA的A位点低温EM-tRNA结构派尔(PDBID:8UPT)和Mm-tRNA派尔(PDBID:8UPY)从核糖体中去除,以在溶液中进行模拟。tRNA派尔在模拟和Dh-tRNA之前,在PyMOL中修改变体派尔(PDBID:2ZNI)单体是从其晶体结构中提取出来的。对于所有tRNA,通过将tRNA主干与tRNA重叠,九个镁离子被添加到其结构中菲(PDBID:1EHZ)并从该结构中提取镁离子的位置。每个tRNA与TIP3P水分子在十二面体形状的盒子(距离盒子边缘至少1 nm)中溶解(23)并用0.15 M NaCl中和。用CHARMM36力场描述核酸结构和离子(24)。所有模拟均使用GROMACS(2021.4版)软件包进行。为了保持恒定的温度和压力,分别应用了V重标度和C重标度耦合。每个tRNA在300 K温度、0.1 ps耦合时间和1 bar压力、1.0 ps耦合时间下平衡。等温压缩性为4.5×10−5酒吧−1.使用了积分时间步长为0.002 fs的跳跃式积分器。使用P-LINCS算法约束氢键(25)短程静电和范德瓦尔斯截止1.2纳米。每个分子系统执行三个独立的副本,以避免模拟陷入局部最小值。每个模拟运行100 ns,允许收敛。出于分析目的,将这三条轨迹组合在一起。由此生成平均结构,并计算每个基数的均方根波动(RMSF)。
MaPylRS的生物物理分析
溶液X射线散射
在缓冲液(50mM MES,pH 5.2,500mM NaCl,10mM MgCl)中以5mg/ml收集MaPylRS的溶液X射线散射数据2)使用之前执行的HPLC-SAXS设置在钻石光源(英国迪德科特)处(26)。将50μl样品体积注入与专用流动池相连的安捷伦1200(安捷伦科技)HPLC中。我们使用Shodex KW402.5-4F色谱柱去除任何可能的聚集/降解材料。每个尺寸排除框架暴露于X射线下3 s,然后进行SAXS数据分析。首先执行数据最小化以缓冲减去峰值区域,然后使用Sc Autter程序合并数据。使用吉尼尔近似法对合并数据进行进一步分析,以获得回转半径(R(右)克)并测定样品的均匀性。我们还进行了无量纲Kratky分析(27)以确定样品是否折叠。接下来,我们使用了GNOM程序(28)获得对距离分布(P(P)(第页)),它提供了R(右)克和最大粒子尺寸(D类最大值)。随后P(P)(第页)信息用于计算12个低分辨率从头算用DAMMIN程序为MaPylRS成型封套(29),如前所述(30,31)。对所有12个模型进行平均和过滤,以通过DAMAVER获得代表性模型(32)。
沉降速度
对在50mM MES、pH 5.2、500mM NaCl、10mM MgCl中以0.3、0.6和1.2mg/ml的浓度制备的PylRS样品进行沉降速度分析超速离心(SV-AUC)2SV-AUC实验是使用ProteomeLab™XL-I超离心机(Beckman Coulter Inc.)和An50Ti 8-cell转子(Beckman-Coulter Inc。标准12 在mm Epon双扇形细胞的一侧填充420μl MaPylRS和420μl缓冲液(50 mm MES,pH 5.2,500 mm NaCl,10 mm MgCl2)在另一边。在20°C的真空条件下隔夜平衡后,样品以30 000 rpm的速度沉淀24小时,收集288 nm的强度数据和干扰数据。使用UltraScan-III处理实验数据(33)如前所述(34)。
动态光散射
水力半径(R(右)小时)如前所述,使用Nano-S Zetasizer(Malvern)仪器获得MaPylRS的分布(31)。在0.20至1.60 mg/ml的浓度范围内进行了五次测量,并绘制了平均分布图。
结果
tRNA的鉴定派尔MaPylRS活动所需的元素
确定Ma tRNA的关键元素派尔对其相互作用和随后的MaPylRS氨基酰化负责,我们系统地将突变工程到Ma tRNA中派尔顺序。我们比较了Ma tRNA的tRNA序列派尔,可与MaPylRS氨酰化为Mm-tRNA派尔不能(图1) (8)。从中,我们发现了我们决定测试的核苷酸差异。我们在比较两个tRNA序列时发现的第一个主要差异是Ma tRNA反密码子茎中存在A隆起派尔A突起位于42a位置,之所以这样命名是因为该单核苷酸在反密码子茎对碱基对中没有互补碱基(图2安培)。确认之前发现此基础对功能不必要的结果(35),我们设计了Ma-tRNA派尔变型Ma02(图2安培)。去除A隆起对系统没有负面影响在体外氨酰化降低到65%(P(P)<0.05)(图2B型)和体内sfGFP的阅读率增加到116%(P(P)<0.01)(图2摄氏度)。自从Mm tRNA派尔没有隆起,我们简化了两个tRNA之间的比较,并且从Ma tRNA中删除了a隆起派尔导致Ma02作为进一步突变的支架。
图2。
识别MaPylRS识别Ma-tRNA所需的元素派尔. (A类)Ma tRNA派尔不同的三叶草结构。更改或丢失的基数用蓝色圆圈表示。所有变体都没有A42a,如Ma02所示。(B类)体外Ma tRNA检测派尔变异显示了tRNA突变对MaPylRS氨酰化效率的影响。数据表示至少三个生物复制的平均值,误差条对应于标准偏差。(C类)体内Ma-tRNA荧光穿透分析派尔变异显示了tRNA突变对MaPylRS翻译的影响t吨-以星星表示的测试和意义。
已知的相互作用D.哈夫宁PylRS及其同源tRNA的受体茎派尔(日)(36)然后我们重点关注Ma-tRNA的受体干派尔.与Mm-tRNA相比派尔,Ma-tRNA的受体茎派尔更富含G:C。因此,我们选择将受体茎中的两个G:C碱基对(G3:C70和G5:C68)分别突变为A:U(发现于Mm-tRNA中派尔),产生变体Ma05和Ma06。两种突变均导致在体外(P(P)<0.01,图2B型)和体内(P(P)<0.0001,图2摄氏度)活动。我们继续通过受体干并鉴定出Ma-tRNA派尔在受体干和D-干之间的连接区域缺少一个碱基,这是Δ中tRNA的一个显著特征pylSn公司酶的种类(37)。在这个位置安装一个U(在Mm-tRNA中找到派尔,变异体Ma07)也被发现降低活性在体外(P(P)<0.01,图2B型)和体内(P(P)<0.0001,图2摄氏度)。此外,虽然A-bulge对Ma-tRNA的功能没有总体影响派尔,G:U摆动对(G28:U42)正好位于反密码子茎中的摆动对之下。这与Mm-tRNA不同派尔在同一位置有一个U:G摆动对。交换G和U的位置(变体Ma08),这是一个已知会影响结构的动作(38),对MaPylRS对tRNA的识别能力产生了负面影响(图2)。这些数据突出了四个区域,集中在受体干附近或内部以及反密码子干中,它们负责促进MaPylRS的识别。
安装tRNA派尔元素促进MaPylRS活动
为了确认我们鉴定了所有的Ma-tRNA派尔被MaPylRS识别所必需的元素,我们将它们转移到tRNA中派尔MaPylRS无法识别。我们从Mm tRNA开始派尔作为脚手架,插入G3:C70、G5:C68和G28:U42代替原来的底座(A3:U70、A5:U68和U28:G42),随后移除U8(图3A级,变型Mm03)。通过对这些变化的工程处理,我们能够诱导MaPylRS识别在体外Mm03的氨酰化活性大约增加了5倍(相对于Ma,从15%增加到78%,P(P)<0.01,图3B公司)同时体内sfGFP的读取率从0%达到5%(P(P)<0.0001,图3C公司)。试图进一步改进体内活性,将A26:U44额外更改为G26:C44(变体Mm05)。这进一步增加了在体外和体内放射性达到106%(P(P)<0.01)和9%(P(P)<0.01)。Mm-tRNA固有的低活性派尔在里面大肠杆菌甚至与其同源合成酶(MmPylRS)(图1磅,C),这可能是我们无法进一步提高MaPylRS翻译效率的原因。
图3。
将身份元素转移到其他tRNA中派尔序列促进MaPylRS识别。(A类)百万tRNA派尔不同的三叶草结构。更改或丢失的基数用橙色圆圈表示。(B类)体外用Mm-tRNA进行分析派尔变异显示tRNA突变对MaPylRS氨酰化效率的影响(C类)体内用Mm-tRNA进行荧光穿透分析派尔变异显示tRNA突变对MaPylRS翻译的影响(D类)Dh-tRNA派尔不同的三叶草结构。更改或丢失的基数用粉色圆圈表示。(电子)体外用Dh-tRNA进行分析派尔变异显示tRNA突变对MaPylRS氨酰化效率的影响(F类)体内用Dh-tRNA进行荧光穿透分析派尔变异显示了tRNA突变对MaPylRS翻译的影响。显示的数据是至少三个生物复制的平均值,误差条代表标准偏差。用Ma tRNA计算活性百分比派尔100%。采用配对t检验进行统计分析,显著性用星星表示。
tRNA派尔来自pylSn公司类也不被MaPylRS识别,因此我们测试了我们识别的Ma-tRNA派尔元素可以促进与MaPylRS的相互作用。我们选择使用tRNA派尔从D.哈夫宁由于其与同源PylRS相互作用的先前特征(7,39,40)。此外,Dh-tRNA的相似性派尔与Ma tRNA相比派尔只需要三个改变(G5:C68、G28:U42和去除G8)即可获得与Mm03中相同的转移tRNA元素(图三维,变型Dh01)。然而,这些变化对MaPylRS活性的影响并不令人信服在体外氨酰化效率与原始Dh-tRNA无统计学显著差异派尔(图第三方)以及体内sfGFP通读翻译效率仅提高到6%(P(P)<0.01,图第三层)。因此,我们仔细研究了所有三种tRNA的序列,以确定Ma和Mm tRNA之间的差异派尔从中我们在Dh-tRNA的反密码子茎中发现了额外的G:U摆动对(G30:U40)派尔这与G28:U42的添加相结合可能会影响反密码子茎的堆叠,干扰MaPylRS的有效识别(41)。将G40突变为C40后,形成Watson-Crick碱基对(变体Dh02),氨基酰化(63%,P(P)<0.01)和翻译(36%,P(P)<0.0001)效率提高(图第三方,F类)。为了确认最初从Ma tRNA中移除的A-bulge是否派尔序列将增加这些新的Mm和Dh-tRNA的活性,结果喜忧参半。将A42a添加到Mm05(Mm05A)中表明体内GFP生产(P(P)<0.0001),而在Dh02A中,活性降低了25%(P(P) < 0.0001) (补充图S1)。
低温EM成像揭示了Ma-tRNA的影响派尔tRNA形状上的同一元素
揭示Ma-tRNA的作用机制派尔同一元件介导对Ma-tRNA的高度特异性识别派尔通过MaPylRS,我们确定了两种低温电子显微镜结构。我们通过使用核糖体作为显示Ma或Mm-tRNA的支架,获得了高分辨率(2.8–2.9 Au)地图派尔(图4A级,补充图S2)这是一个我们之前证明是成功的战略(13)。这两种结构的比较揭示了Ma-tRNA的四个独特结构特征派尔与Mm-tRNA相比派尔提供了MaPylRS对其正交识别的深入了解。
图4。
低温EM成像揭示了Ma-tRNA的影响派尔tRNA形状上的同一元素。(A类)tRNA的总体结构派尔从阿尔瓦斯乳杆菌(蓝色)和马赛先生(橙色)。(B类)重叠结构tRNA综述派尔从M.阿尔维斯和马赛先生说明tRNA中第8位没有核苷酸派尔导致tRNA片段中保守碱基的位置发生变化。(C类)Ma-tRNA的反密码子茎派尔表明,与之前的预测不同,碱基A42a不会从tRNA体中凸出,而是插入到反密码子茎中。(D类)叠加结构的观点突出了Ma-tRNA中的C45突起派尔. (电子)Ma-tRNA的完整覆盖派尔和Mm tRNA派尔显示了标识元素U8和G28:U42之间出现的不同特征。
第一个主要区别是位置8(在受体/D-阀杆连接处)没有底座。这种缺失的碱基会导致受体茎和D-茎之间连接体的整体结构发生变化。单位:百万tRNA派尔与其他tRNAs一样,U8的出现将G10推入循环。然而,在它不存在的情况下(Ma tRNA派尔),G10紧邻C7,导致碱基C7和G10的非典型构象(图4B类)。
第二个区别是A42a-bulle,因其在Ma-tRNA中的突起而得名派尔二级结构,因为它不能与反密码杆中的C27或G28进行基极配对。我们的三级结构表明,这种隆起在视觉上是不存在的。相反,A42a被夹在两个碱基对C27:G43和G28:U42之间。作为A42a插入tRNA分子的受体茎的明显结果,我们观察到核苷酸43和44向受体茎上移动,改变了tRNA结构(图4摄氏度)。
第三,Ma tRNA派尔有一个明显的C45,在核糖体结合的Mm-tRNA中缺失派尔以前在Mm-tRNA的晶体结构中也观察到类似的隆起派尔(PDBID:5UD5)(9) (补充图S3,图4D(四维))。Mm-tRNA在该区域差异的原因派尔尚不清楚,但我们确实知道45位是可变臂中的第一个核苷酸。以前的研究表明核糖体中可变臂结构对有效翻译的重要性,我们知道大肠杆菌百万tRNA派尔不能像Ma tRNA那样翻译派尔(13,42,43)(图1和3C公司)。
最后,通过叠加两个tRNA派尔从核糖体上的低温电子显微镜成像获得的结构,我们发现它们的受体茎和反密码茎下部的构象几乎相同(它们的主链原子之间的rmsd为0.25–0.30º)。然而,在Mm-tRNA的U8和U28之间的一段时间内,两个tRNA结构开始相互偏离(骨架原子之间的rmsd~1.5º)派尔(图第4页)。这种整体形状变化似乎是由Ma-tRNA中的元素引起的派尔我们确定这是MaPylRS识别所必需的;Ma-tRNA中U8的缺失派尔截断受体茎和D-茎之间的环,U28:G42突变为G28:U42(可能还有A42a插入)影响磷酸骨干的轨迹(38)。综上所述,我们的结构分析表明,这两种鉴定出的Ma-tRNA派尔元素通过改变tRNA分子的整体形状发挥作用。
仿真表明MaPylRS识别需要严格的身份结构
活性分析和结构数据都强调了G28:U42的重要性,以及第8位缺少用于MaPylRS识别的碱基。然而,结构数据并不能说明受体茎和反密码子茎中的G:C碱基对如何促进这种相互作用。此外,Dh-tRNA派尔变异数据表明,仅仅移植G28:U42并移除位置8的碱基不足以促进MaPylRS的活性(图三维–F类,补充图S4A)。为了解开这个谜团,我们对tRNA进行了分子动力学模拟派尔解决方案中的变量。我们发现Ma-tRNA派尔采用典型的L形三级结构,L结处的RMSF值较低,3′-CCA端和反密码环处的RMSF增加(图5)。另一方面,Mm tRNA派尔采用钝角,整个tRNA(包括L连接)的RMSF增加。对于Dh-tRNA派尔我们使用tRNA晶体结构(PDBID:2ZNI5)。这些模拟表明,MaPylRS需要一个刚性的L型tRNA结构才能有效识别。
图5。
分子动力学模拟揭示了Ma-tRNA的刚性派尔所示为每个tRNA的平均模拟结构派尔,根据残差的均方根波动(RMSF)着色。红色为高波动(>0.6),灰色为低波动(<0.2)。
为了验证tRNA刚性需求的假设,我们还模拟了tRNA派尔我们研究的变体。没有每个变体的高分辨率结构,我们通过PyMOL中的突变工具生成了起始结构。从去除Ma02的A突起开始,我们发现受体结构域的波动略有增加,反密码子茎的稳定性发生了重排。在Ma tRNA中派尔,A凸起处具有较高的灵活性,而反密码杆的另一侧则更为刚性。对于Ma02,A凸起两侧的波动现在适中(0.3–0.4)(补充图S4)。为了进行比较,还对Ma-tRNA进行了模拟派尔MaPylRS难以识别的变体。在所有变体中,tRNA的灵活性都增加了,主要是在反密码子干中,在某些情况下也在受体干中,L连接稳定性变化最小(补充图S4B)。这进一步强调了刚性tRNA的要求派尔用于MaPylRS活动。
正如我们在活性测定中所看到的,主要问题是所鉴定的突变是否能诱导Mm和Dh-tRNA的识别派尔MaPylRS通过诱导tRNA刚性来实现这一目的。令人惊讶的是,与Mm相比,Mm05的模拟显示出更典型的L形结构,刚性增加(0.2–0.3)(图6A级)。Dh02也出现了类似的观察结果,其中L型结构从~120°变为~90°(图6A级)。这证实了我们的假设,即MaPylRS识别的一般要求是刚性的L形tRNA。
图6。
tRNA突变派尔诱导刚性,使这些tRNA符合MaPylRS识别的理想结构(A类)tRNA派尔与亲本tRNA相比,变异体Mm05和Dh02更为刚性,具有典型的L形派尔(分别为Mm和Dh)。(B类)在提议的Ma-tRNA处测量三个距离派尔:MaPylRS接口(PDBID:6EZD)揭示了使用MaPylRS进行最大活动所需的必要距离。距离1被证明是这一认识的主要贡献者。
这些模拟清楚地解释了为什么MaPylRS识别Ma、Ma02、Mm05和Dh05,而不识别任何其他tRNA派尔变体。然而,它并没有阐明为什么体内与Dh02相比,Mm05的活性较差。为了进一步研究这一点,我们考虑了PylRS的tRNA相互作用位点派尔利用其同源PylRS的C末端结构域,我们选择了tRNA结合囊中的六个核苷酸(36,40)。我们在tRNA上发现了这些核苷酸派尔变异并使用平均模拟tRNA结构磷酸主链的磷原子测量它们之间的距离(核苷酸6-11、4-10和26a-69)(图6亿)。由此,我们发现当这三个距离接近Ma tRNA的距离(1°以内)时派尔,MaPylRS的翻译活动增加(图6亿)。此外,核苷酸6和11之间的距离对于体内活动。与Ma相比,Ma02的距离减少了1º,活性提高到Ma-tRNA的116%派尔另一方面,即使Mm05与Ma tRNA的距离相等派尔在核苷酸4–10和26a-69之间,核苷酸6–11之间较宽的4°距离有限体内活性仅为Ma-tRNA的9%派尔多元线性回归分析显示距离1、2和3的相关系数分别为-0.68、-0.43和-0.58。这强调了距离1对MaPylRS活动的更强影响;我们还绘制了整个模拟过程中出现的距离分布(补充图S5-7)。对于tRNA派尔MaPylRS很好识别的变体,有一种倾向,即距离分布较窄,集中在正确的距离上(距离1为11°,距离2为22°,距离3为28°),而识别不佳的变体的距离分布较宽,或以较大距离为中心的狭窄分布(补充图S5-7)。
MaPylRS在生理浓度下是单体
进一步解释结构刚性tRNA的需求派尔对于相互作用,我们对溶液中的MaPylRS进行了生物物理表征。SAXS数据表明,MaPylRS作为单体存在于溶液中(图第7页)回转半径为21°(R(右)克)和最大粒径62º(D类最大值)(表1)。考虑到晶体结构(PDBID:6EZD和6JP2)表明MaPylRS是二聚体,我们研究了低聚状态的浓度依赖性。AUC(图7亿)和DLS(图7摄氏度)数据证实,在低μM浓度(6μM[0.2 mg/ml])下,发现MaPylRS是一种单体。绘制R(右)小时根据使用HullRad对晶体结构进行的流体动力学预测(表1) (44),并进一步低聚50μM(1.6 mg/ml)(图7摄氏度)。
图7。
生物物理特性揭示了MaPylRS的动态行为(A类)从头算MaPylRS的HPLC-SAXS与晶体结构(PDBID:6EZD)重叠生成的模型显示了这种酶的单体性质。(B类)多种浓度下的AUC数据显示该酶存在较强的二聚体。(C类)在更大浓度范围内的光散射揭示了三个不同的流体动力学半径(R(右)小时)。
参数. | MaPylRS公司. | 单体克. | 二聚体克. |
---|
米周(千Da)一 | 32.15 | 30.49 | 61.15 |
吉尼尔R(右)克(Å) | 21.59 ± 0.06 | 21.47 | 25.35 |
P(P)(第页)R(右)克(Å)b条 | 21.00 ± 0.02 | – | – |
D类最大值(Å)b条 | 62 | 74.87 | 100.80 |
|$\chi^2美元$|c(c) | 1.8 | – | – |
国家统计局d日 | 0.76 | – | – |
R(右)小时(Å)e(电子) | 26 ± 2 | 26.83 | 34.07 |
s°20,周(S)e(电子) | 2.45 | 2.65 | 4.18 |
米w个(千Da)(f) | 32 | 30.49 | 61.15 |
参数. | MaPylRS公司. | 单体克. | 二聚体克. |
---|
米周(千Da)一 | 32.15 | 30.49 | 61.15 |
吉尼尔R(右)克(Å) | 21.59 ± 0.06 | 21.47 | 25.35 |
P(P)(第页)R(右)克(Å)b条 | 21.00 ± 0.02 | – | – |
D类最大值(Å)b条 | 62 | 74.87 | 100.80 |
|$\chi^2美元$|c(c) | 1.8 | – | – |
国家统计局d日 | 0.76 | – | – |
R(右)小时(Å)e(电子) | 26 ± 2 | 26.83 | 34.07 |
s°20,周(S)e(电子) | 2.45 | 2.65 | 4.18 |
米w个(千Da)(f) | 32 | 30.49 | 61.15 |
参数. | MaPylRS公司. | 单体克. | 二聚体克. |
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米周(千Da)一 | 32.15 | 30.49 | 61.15 |
吉尼尔R(右)克(Å) | 21.59 ± 0.06 | 21.47 | 25.35 |
P(P)(第页)R(右)克(Å)b条 | 21.00 ± 0.02 | – | – |
D类最大值(Å)b条 | 62 | 74.87 | 100.80 |
|$\chi^2美元$|c(c) | 1.8 | – | – |
国家统计局d日 | 0.76 | – | – |
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米w个(千Da)(f) | 32 | 30.49 | 61.15 |
参数. | MaPylRS公司. | 单体克. | 二聚体克. |
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米周(千Da)一 | 32.15 | 30.49 | 61.15 |
吉尼尔R(右)克(Å) | 21.59 ± 0.06 | 21.47 | 25.35 |
P(P)(第页)R(右)克(Å)b条 | 21.00 ± 0.02 | – | – |
D类最大值(Å)b条 | 62 | 74.87 | 100.80 |
|$\chi^2美元$|c(c) | 1.8 | – | – |
国家统计局d日 | 0.76 | – | – |
R(右)小时(Å)e(电子) | 26 ± 2 | 26.83 | 34.07 |
s°20,周(S)e(电子) | 2.45 | 2.65 | 4.18 |
米w个(kDa)(f) | 32 | 30.49 | 61.15 |
讨论
在这项研究中,我们揭示了tRNA中的关键核苷酸派尔识别所需的M.阿尔维斯PylRS。我们的初始目标是从ΔpylSn公司类,揭示了这些tRNA元素一起形成了一个独特的结构(45)。发现这种同一结构是由位置8处没有碱基和存在摆动碱基对G28:U42引起的。然而,这两个元素不足以被MaPylRS识别,必须在受体和反密码子茎中添加额外的G:C对(最多三个)。我们发现将这些tRNA元素结合成其他tRNA派尔MaPylRS(来自pylSn-pylSc和丙基锡类)通过MaPylRS促进氨基酰化和随后的蛋白质翻译。
通过MD模拟,我们解释了这五种元素诱导刚性(降低RMSF)并促进MaPylRS识别的独特tRNA身份结构的形成派尔,表示Δ的共同进化pylSn公司PylRS类酶及其同源tRNA(4)。从开始pylSn-pylSc一类酶,其中NTD通过一个连接子(同源tRNA(Mm-tRNA)与CTD物理连接派尔)显示出较高的RMSF,平均结构看起来更像钝角,而不是L形。当这两个基因分离时(pylSn公司类),我们观察到同源tRNA(Dh-tRNA派尔)变得更加僵硬和L形,但不像tRNA那样僵硬派尔从ΔpylSn公司没有NTD的类。PylRS的NTD先前已被鉴定为一个募集结构域,对tRNA具有高亲和力派尔(7)。我们的数据表明,除了招募tRNA外派尔,NTD可在溶液中稳定其,以促进CTD的结合和随后的氨酰化。如果没有NTD,那么MaPylRS需要一个已经稳定在正确方向上的tRNA,可以被识别和氨酰化。
这一假设在表征MaPylRS齐聚作用时得到了放大。在生理浓度下,MaPylR是单体的。这与DhPylRS的建议相反(36)和大多数其他II类aaRS的特征(5)。假设DhPylRS的每个拷贝都与Dh-tRNA相互作用派尔分子,单体酶将失去这种额外的稳定性,无法形成复合物(36)。此外,我们还无法分离出Ma-tRNA派尔:溶液中的MaPylRS复合物,可能是由于Ma tRNA派尔在结构上可以进行氨酰化。
PylRS翻译系统已被大量研究用于遗传密码扩展,重点是开发多个正交tRNA派尔:PylRS对。三类ΔN tRNA的最新鉴定派尔将PylRS的使用扩展到五个正交系统(37,46)。我们对MaPylRS识别所需元素的鉴定提供了对这种正交性的理解,也表明了Ma-tRNA之间的进化关系派尔此外,tRNA突变可以影响其在溶液中的灵活性的概念可能为tRNA治疗的发展提供了见解。
数据可用性
所报告的低温电子显微镜结构的原子坐标和结构因子已以登录号8UPT和8UPY存放在蛋白质数据库中,并以登录号EMD-42455和EMD-4245存放在电子显微镜数据库中。
补充数据
补充数据可从NAR Online获取。
致谢
我们要感谢Joanne Ho和Corwin MillerpylBCD公司Plasma和Kyle Hoffman进行了深入的讨论。分子模拟工作得到了瑞典电子科学研究中心的支持,计算资源由BioExcel卓越中心(EU 823830)、瑞典研究委员会(VR 2019-02433)和瑞典国家计算基础设施(SNIC 2021/3-39)提供。我们非常感谢Stanford-SLAC Cryo-EM中心(S2C类2)设施工作人员:伊丽莎白·蒙塔巴纳(Elizabeth Montabana)、陈东华(Dong-Hua Chen)和张晨松(Chensong Zhang)。我们感谢斯坦福大学和斯坦福研究计算中心提供Sherlock集群资源和DIAMOND光源以使用其设施。我们感谢光束线科学家的支持。
基金
NIH[R35 GM122560,R35 GM122 560-05S1至D.S.,GM51266至J.D.P.];能源部基础能源科学办公室[DE-FG0298ER2031 to D.S.];囊性纤维化基金会[PUGLIS20G0 to J.D.P.];加拿大卫生研究院[PJT-152935和PJT-178097至J.S.];Knut和Alice Wallenberg基金会博士后奖学金[KAW 2016.0488 to J.Z.];SAXS数据收集于英国钻石光源[SM22113];T.R.P.是RNA和蛋白质生物物理学加拿大研究主席,J.S.是结构生物学加拿大一级研究主席。开放接入费用资金NIH[R35 GM122560-05S1]。
利益冲突声明。未声明。
笔记
现住址:Jeffery M.Tharp,美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院生物化学和分子生物学系,邮编:46202。
现住址:Natalie Krahn,美国佐治亚大学生物化学和分子生物学系,雅典,佐治亚州30602。
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作者注释
©作者2023。由牛津大学出版社代表核酸研究出版。