毒液系统作为研究进化小说起源和规律的模型

摘要

生物学的一个中心目标是确定进化重复自身的方式。动物毒液是融合进化新奇性本质中最显著的例子之一。在不同的动物门中，不同的专门器官和解剖结构从不同的发育组织进化而来，执行相同的功能，即产生并传递一种强有力的分子混合物，以制服猎物或捕食者。因此，毒液生物提供了独特的机会来研究关键适应性性状聚合的进化过程，以及新基因、细胞和组织出现的分子机制。事实上，一些有毒物种已经被证明非常适合作为发育研究的模型，最近对毒腺类有机物的研究为直接测试重要的进化问题提供了可操作的系统。在这里，我们提供了当前知识的综合，可以作为建立毒液系统作为进化和分子生物学新模型的起点。特别是，我们强调了各种有毒物种在研究细胞分化和细胞身份以及快速进化、高表达、组织特异性基因旁系的调控动力学方面的潜力。我们希望这篇综述将鼓励研究人员超越传统的研究生物，将毒液系统视为探索进化新奇性的有用工具。

介绍

在生命之树中，当物种独立面对类似的环境或生物挑战时，往往会进化出类似的新特性，这一过程称为趋同进化(2013年斯特恩). 动物毒液是自然界对一种关键适应性性状进行重复进化的最显著例子之一。在100多个场合，动物谱系，包括已灭绝的恐龙(Gong等人。2010)和哺乳动物(福克斯和斯科特2005)，已经独立进化出生产生物活性分子鸡尾酒并将其传递给其他动物的能力(Schendel等人。2019). 这些生化武器通常是为了适应觅食、防御或种内竞争而进化而来的，它们的进化获得将捕食者与猎物之间的相互作用从物理战转变为生物化学战，通常使小型有毒生物能够制服或逃离体型更大的动物(Casewell等人。2013). 科学界已知的有毒动物种类超过20万种，不出所料，它们在人类历史上一直是公众着迷的对象，因为体型娇小、体形脆弱的动物能够注射复杂的分泌物，从而导致毁灭性的破坏，包括死亡(图1).

获得毒液系统并不是一个简单的过程，它包括几个步骤，包括1）将正常的生理蛋白质转化为有毒分子，同时发展对它们的自抗机制；2） 进化出新的组织来分泌和运输毒液，如外分泌腺、导管和肌球；以及3）发展有效输送毒液的解剖结构，如毒牙、毒刺、鱼叉、钩和倒钩等。尽管毒液系统通常具有相同的首要功能（例如捕获猎物或阻止捕食者），但毒液系统的解剖结构和组织在谱系之间存在显著差异，从而提供了对形成生物体复杂性的制约因素（例如形态学、生态学和遗传学）的见解(Schendel等人。2019). 因此，毒液系统为研究新蛋白质、组织、，以及形态结构，并最终理解相似的解决方案如何在自然界中反复使用的基础，进而有助于形成更为普遍和可预测的进化理论。

毒液系统已被证明是研究新细胞调控进化的独特模型。例如，在过去的15年里 年，中国人（主要是翻译起始因子和枕骨水螅)已被建立为这一新兴研究领域的实验室模型(Darling等人。2005;2012年盖洛特;Babonis和Martindale 2014;Layden等人。2016;2019年Sachkova和Burkhardt)，对调控网络（GRN）中保守和衍生基因的相对贡献以及各种转录因子和信号通路在细胞识别中的作用提供了重要见解（见下文）。尽管蛇床子是在细胞水平上进行详细解析的合适模型，但其他有毒动物提供了研究新解剖结构和器官重复进化的分子基础的机会。然而，只有少数主要针对蛇的研究调查并确定了调节元素及其在毒液生产周期中的潜在作用（例如。，Ma等人。2001;Nakamura等人。2014;Han等人。2016;Schield等人。2019) (图2). 这是令人惊讶的，因为大量的研究致力于描述动物毒液系统的分子和生物化学组成。尽管我们通常对负责毒液系统起源、发展和功能的精确细胞和调节机制缺乏全面的了解，但到目前为止的工作为建立对这些关键进化创新进化过程的统一理解提供了一个有希望的基础。此外，最近开发的新模型，如毒腺类有机物(Post等人。2020)，能够深入研究同源研究系统中控制毒液生成的调节机制。

动物毒素也是研究与获得新基因功能或蛋白质新功能化有关的进化过程以及聚合招募蛋白质的调控动力学的显著模型。毒液毒素起源的经典模型涉及编码生理体蛋白的基因的复制，通常随后是新功能化(科尔迪什和古本舍克2000;Casewell等人。2011;Chang和Duda 2012)、额外的重复和毒腺中选择性增加的表达(Whittington等人。2008;Junqueira-de-Azevedo等人。2015;Reyes-Velasco等人。2015;Margres等人。2017). 然而，其他机制，包括单拷贝基因的协同作用(Wong等人。2012;Martinson等人。2017;Drukewitz等人。2019)，水平基因转移(Moran、Fredman等人。2012;Martinson等人。2016)，可选拼接(Cousin等人。1998;Zeng等人。2012)和外显子洗牌(Wang等人。2017)也可能有助于形成一套支持毒液基因获取的机制。在动物毒液中发现的几种最丰富、最有效的毒素属于大的、高度多样的蛋白质家族，其特征是序列进化加速(Casewell等人。2011;Sunagar和Moran 2015年). 事实上，某些毒素家族代表了迄今为止发现的一些最快的多样化蛋白质(Chang和Duda 2012). 最终，这些可变的过程可以导致单个毒液中含有数百种不同的生物活性分子。尽管有这种非凡的复杂性和可变性，但毒素的生理靶标和被选作毒素的分子都有显著的趋同程度。事实上，在大量可用的构建块中，相对有限的蛋白质组（例如富含半胱氨酸的分泌蛋白质、透明质酸酶、kunitz、磷脂酶a₂[解放军₂]，和丝氨酸蛋白酶）作为毒液成分在多个后生动物谱系中被集中招募，这表明相对较少的蛋白质家族能够发挥毒性作用(Fry等人。2009;Casewell等人。2013,2019). 原因尚不清楚；这些蛋白类型的非毒素“生理”作用是多种多样的，其中许多毒素同系物本身就是大型多位点基因家族的成员，至少在蛇中，它们在不同组织类型中具有广泛的低水平表达谱(Junqueira-de-Azevedo等人。2015;Reyes-Velasco等人。2015). 这些特征使得毒液毒素非常适合作为模型来研究新的、高表达的和组织特异性基因的调控动力学，这些基因是在来自具有不同表达背景的同源基因的强烈自然选择下快速进化而来的。

因此，毒液系统为研究以下方面提供了独特的机会：1）与关键适应性性状聚合相关的进化过程；2）新细胞类型和器官产生和发展的分子机制；3）新功能基因的调控动力学。发育研究中众所周知，GRN控制细胞分化，因此可以考虑定义细胞类型(戴维森2010). 理解新细胞的进化需要首先确定GRN的组成部分，因为一个特征明确的GRN是测试不同细胞类型和分类群之间分子机制和调控关系的保守性假设的关键工具(Babonis和Martindale 2014). 因此，本综述的目的是提供当前知识的综合，以作为建立毒液系统作为进化和分子生物学新模型的起点。首先，我们概述了分泌毒液的细胞和组织的不同来源；然后，我们以分级的方式讨论毒液的调节。更具体地说，我们总结了与1）分泌毒液细胞的分化和鉴定、2）毒腺的整体功能、3）毒素基因的转录和4）毒液成分的选择性表达有关的调节机制的现有知识。虽然翻译后修饰大大增加了许多毒液系统中毒素的多样性(Buczek等人。2005;Moura-da-Silva等人。2016;Delgado-Prudencio等人。2019)，我们选择在这里不深入讨论这一点，而是关注直接影响毒液分泌细胞及其基因表达谱调控的过程。

静脉分泌细胞的起源

产生毒液的细胞都是上皮分泌细胞。这些细胞最显著的特征，无论是作为单细胞系统还是组织成组织和腺体，都是它们进化的各种方式。事实上，即使毒液器官在独立毒液谱系之间的结构和功能上看似相似，其发育模式也可能不同。令人感兴趣的问题是，不同毒液系统的分子基础是否相似，即不同的谱系是否对毒液系统进化采用相同的调控策略。在这里，我们对目前已知的动物毒液系统的起源进行了概述。

蛇床子属

蛇形目动物（如水母和海葵）是现存最古老的有毒动物。它们在被称为cnidocytes的特殊细胞中产生毒液，其中包含微型叮咬装置，即cnidocystes；此外，毒素也在外胚层腺细胞中产生(Moran、Genikhovich等人。2012). cnidocytes和一些原生动物的精细挤出细胞之间有着密切的进化关系(肖斯塔克1993;Denker等人。2008;Ozbek等人。2009)虽然没有发现横向基因转移的分子证据支持这一假设(Technau等人。2005). 此外，结构、功能和系统发育数据支持cnidarians中cnidocytes的独立起源以及甲藻原生生物中同源鱼叉状分泌细胞器(Gavelis等人。2017). 由于cnidocytes具有感知周围环境并对其作出反应的能力，人们假设它们是一种不寻常的神经元(潘廷1942). 神经元和cnidocytes前体中几种常见调节基因的表达（例如，cnox-2、prdl-b和COUP-TF）(2011年盖洛特和奎昆德)确实支持一种共同的神经-cnidocyte祖细胞的假说(Miljkovic-Licina等人。2007). 然而，单细胞RNA-seq分析Hydra公司研究表明，在分化为神经元或腺体细胞之前，cnidocytes从一个共同的祖细胞中产生(Siebert等人。2019). 蛇形细胞与集中的祖细胞群同步分化，然后迁移到它们将被部署的组织(Khalturin等人。2007). 虽然在水螅体内，cnidocytes起源于多能干细胞(大卫2012)在其他蛇类动物中，例如Anthozoa（例如。，线虫属)和Scyphozoa（例如。，奥雷利亚)，它们起源于上皮肌细胞(Gold和Jacobs 2013;Sebé-Pedroós等人。2018;Gold等人。2019). 在线虫属，在原肠胚形成开始时，cnid细胞发育早(Zenkert等人。2011)在所有生命阶段，它们在上皮细胞中单独和异步发育(Babonis和Martindale 2014,2017). 有助于我们理解细胞类型分化的一个有趣的研究方向是，研究间质细胞如何在最衍生的蛇类世系——水螅虫（Hydrozoa）中调节卵泡发育(Gold等人。2019).

蛇

蛇的毒腺和毒牙是由眼部口腔上皮联合内陷形成的，与其他唇上腺分开(科奇瓦1963;谢尔·沃尔伯格和科奇瓦1967). 有趣的是，尽管这是由口腔组织发展而来的，并且毒腺可能起源于唇腺，但它被假设为科奇瓦（1987）并得到了进一步的支持Vonk等人。(2013)，毒液腺和胰腺之间也存在发育联系。一些胰腺酶（例如PLA₂)唾液腺和毒腺中可检测到的对应物，后者被用作毒素(油炸2005). miR-375是脊椎动物胰腺中典型的micro-RNA（miRNA），其在毒液腺中的大量表达也表明毒液分泌系统的调节成分可能来源于胰腺(Vonk等人。2013). 这些数据表明，蛇的毒液系统的进化可能涉及来自多种解剖起源的成分的协同和编配，尽管需要进一步研究才能完全阐明这一过程。

锥蜗牛

锥蜗牛是一种海洋捕食性新腹足类动物，具有复杂的毒液器官，包括：1）一条长而盘旋的导管，用于分泌毒素；2）一个肌肉球，收缩以通过导管排出毒液；3）一个鱼叉状结构，用于将毒液注入猎物或捕食者体内。这种毒腺的不寻常形态引起了人们对其进化起源的争议，这种进化起源被解释为高度衍生的唾液腺(阿尔卑斯山1931;弗雷特和格雷厄姆1962)，一个全新的结构(史密斯1967)或与其他腹足类的食管中段腺体同源(思考1973;Ponder和Lindberg 1997;2010年莫迪卡和霍尔福德). 发育研究支持了后一种假说，研究表明，毒腺在变态过程中产生，原因是中前肠区腹侧区上皮细胞肥大，随后迅速从主背侧通道剪断新形成的导管(球2002;第2011页). 尽管各种食管中段结构之间的精确同源性仍有争议(Ponder等人。2019)目前正在研究中，很明显，毒液导管的上皮管和颗粒是通过重塑从预先存在的上皮层产生的(第2011页).

其他世系

对于大多数其他动物谱系，关于其分泌毒液细胞来源的数据仍然稀少。在蜘蛛中，毒液系统是从最古老的中层苔藓分类群的螯虾基部的小“原始”腺体进化而来的(Foelix和Erb 2010)到位于高级拟南芥原生质体中发育良好的腺体（真正的蜘蛛）(Langeneger等人。2019). 毒腺已经存在于栉足蛛(Silva等人。2011)和来自外胚层内陷(辛普森和卡萨斯2011). 相反，在蜈蚣中，最近的几项研究表明，毒腺起源于腺体表皮上皮及其相邻的角质层的斑块，这些角质层越来越内嵌于鳃的内部（总结于von Reumont等人。[2014]). 在脊椎动物中，鲇鱼（Siluriformes，catfish）具有相对简单的毒腺，由腺细胞聚集而成，这些腺细胞被包裹在上皮细胞的珠被鞘内，并与背鳍和胸鳍中的骨棘相连(赖特2017). 多种证据表明，起源于表皮分泌细胞，可能是由于脊椎周围腺体组织的增厚以及随后的进化变化（总结于赖特[2017]). 然而，毒液腺是否来源于分泌防御性海百合毒素的俱乐部细胞(Cameron和Endean 1973年)或产生愈合和抗菌分泌物的细胞(赖特2009)仍有争议，需要进一步研究。鸭嘴兽是极少数几种有毒哺乳动物之一，其毒腺来源于改良的顶泌汗腺，在发育过程中，顶泌汗腺从每只大腿的内表面迁移到骨盆背腹面上的最终位置(克劳斯2010). 腺体发育的最早阶段是雏鸟和最近出现的鸭嘴兽幼崽（6个月大）。

静脉分泌细胞和组织的调节

据我们所知，对分泌毒液细胞的GRN的研究很少；然而，在过去20年中进行的相对较少的研究已经开始揭示毒液系统的分子基础(图2). 仅在蛇床子中研究了细胞身份和分化的调控动力学；相比之下，对毒素基因和调节其表达的潜在元素的DNA分析主要是在蛇和其他一些生物体上进行的。下面，我们介绍了主要的发现，并讨论了这些结果作为候选结果的潜力，以便通过先进的分子技术和/或比较基因组和转录组学方法在未来的研究中进行测试。

与静脉分泌细胞分化有关的调节因子

毒液分泌细胞形成的上游过程只在蛇类中进行了研究。这一主题的研究得益于长期的开拓性研究（总结于Babonis和Martindale[2014])以及在其他有毒生物中应用具有挑战性的基因操作相对容易。

转基因报告系和敲除实验用于鉴定对多能干细胞分化为cnidocyte至关重要的各种转录因子。研究人员发现，双体SoxB基因的同源序列SoxB2和SoxB3可以调节两个远缘关系的蛇类物种（珊瑚虫属）的祖细胞向神经元和cnidocytes的分化翻译起始因子(理查兹和伦茨2014)和水螅棘球水螅(Flici等人。2017). 事实上，已知保守转录因子的Sox家族参与细胞特性的发展和维持(Bowles等人。2000). 在SoxB2下游，PaxA在细胞的发育中起着关键作用线虫属(2017年Babonis和Martindale). 配对盒（Pax）基因是一个保守转录因子家族，参与不同后生动物组织中感觉结构的发育(Blake和Ziman 2014)和巨蟹座动物具有Pax基因的直系同源性以及谱系特异性基因，即PaxA、PaxC和PaxD(Matus等人。2007;Suga等人。2010). 敲低PaxA，而不是敲低PaxC，会导致发育中的cnidocytes的损失，并导致肌细胞增强因子2（Mefv2）的下调，这是另一种被发现对cnidocystal特异性基因的正常表达很重要的转录因子(Genikhovich和Technau 2011). 最近的单细胞转录组学分析线虫属证实了这些先前的发现，SoxB2在髓细胞分化的早期阶段表达，随后是PaxA的表达(Sebé-Pedroós等人。2018). 中的类似研究Hydra公司(Siebert等人。2019)发现Pax结合基序在一组基因（“后基因”）的调控区域中显著富集，这些基因在早期和中期发生时表达；此外，PaxA本身也被表达，证实了其在cnidogenesis中的作用Hydra公司，并建议一定程度的通用性。其他的基序也被发现在脊椎动物发生过程中富集，包括在中晚期富集的叉头（Fox）基序和晚期富集的Pou基序。类似地，也在线虫属FoxL2和Pou4在中晚期表达(Sebé-Pedroós等人。2018).

虽然研究与单细胞毒液系统相关的细胞分化调控元件不太具有挑战性，特别是因为这些细胞在毒蛇的一生中都会再生，但对集中的、基于组织的系统（如毒腺）进行此类研究要困难得多。然而，随着DNA测序和基因组工程（如CRISPR/Cas9）的不断进步，再加上最近描述的可操作的模型系统，如毒腺衍生的有机物(Post等人。2020)我们预计有可能测试参与细胞分化的元素是否在不同的毒液谱系中共享，同时建立其他毒液谱族的代表作为发育生物学研究的模型。

在静脉分泌细胞和组织中表达的调节元件

虽然SoxB2和PaxA在早期参与了与蛇毒相关的cnid细胞的发育，但已发现少量其他调节元件与该细胞身份途径的下游有关。例如，通过CRISPR/Cas9和FACS排序以及RNA-seq，Sunagar等人。（2018年）发现转录因子在cnidocytes中有差异表达。由作者cnido-Jun和cnido-Fos1命名的两个与原癌基因转录因子c-Jun和c-Fos同源的基因被强烈上调，并且cnido-Jun的敲除实验导致cnido细胞发育减少和损伤，呈现非典型形状。已知c-Jun和c-Fos形成激活蛋白1（AP1）复合体，该复合体调节基因对应激、感染和其他刺激的反应(Hess等人。2004)特别是c-Jun以前被发现参与包括组织发育在内的各种信号通路(孟夏2011). 系统发育分析表明，这两种转录因子起源于六珊瑚类共同祖先500 Ma左右的基因复制。在cnid细胞中，同源c-Jun和c-Fos没有上调；因此，cnido-Jun和cnido-Fos1似乎进化出了与应激反应相关的不同功能。此外，还发现一种Jun因子在cnidocyte发育的晚期分化阶段表达线虫属和潜在增强子元件的基序富集分析发现Jun与一组cnidocyte特异性基因相关(Sebé-Pedroós等人。2018).

有趣的是，AP1和另一种转录因子NFkB已被证明能增加其在蛇毒腺中的活性哈拉拉卡葡萄毒腺刺激后(Luna等人。2009). 在其他系统中，NFkB以失活状态存在于细胞中，能够对刺激产生快速反应(吉尔摩2006); 因此，应激相关转录因子似乎也是蛇分泌毒液细胞GRN的一部分。AP1和NFkB是细胞外信号相关激酶1和2（ERK1/2）信号通路的成员，该通路的其他成员参与毒素基因调控。在哈布蛇毒腺的cDNA文库中鉴定出几个与上皮特异性转录因子（ETS）同源的编码蛋白的全长序列，日本原矛头蝮(Nakamura等人。2014). ETS也被ERK激活，相邻的ETS和AP1结合位点可以作为该途径转录激活的反应元件(霍伦霍斯特2012). 在ETS家族中，在富含上皮组织中特异表达的蛋白质被归类为ESE亚家族。其中，ESE-1广泛表达于多种组织，而ESE-2和ESE-3则表达于富含腺上皮的组织，如唾液腺和乳腺(Kas等人。2000). 所有三种ESE均表达于黄色葡萄球菌与其他组织相比，ESE-3对毒腺的表达水平和特异性更高。ESE-3也是唯一能够激活PLA启动子的因子₂毒物编码基因(Nakamura等人。2014). 最近，Schield等人。（2019年）据报道，草原响尾蛇毒腺中有12种转录因子显著上调，草原响尾蛇与其他身体组织相比。在这12种转录因子中，粒头型转录因子1（GRHL1）已知在表皮屏障形成和修复中起作用(Ting等人。2005;Kim and McGinnis 2011年)在ERK途径外，他们检测到与腺上皮修复（如ELF5）和分泌功能（如ATF6和CREB3L2）相关的转录因子。此外，属于核因子I（NFI）家族的转录序列也被发现上调；众所周知，NFI成员能够促进组织特异性表达(Gronostawski 2000年)以及在染色质重塑和反式激活中的作用(Fane等人。2017). 尽管对毒腺中表达的转录因子的研究可以为我们提供哪些调控元件表达的探索性证据，从而可能发挥重要的调控作用，但它们并不能提供与DNA相互作用的直接证据。先进的基因组学技术，如染色质免疫沉淀测序（直接分析蛋白质与DNA的相互作用）和转座酶可及染色质测序（评估全基因组染色质可及性）的分析，可以很容易地识别毒素基因及其相关蛋白的转录因子结合位点(Geertz和Maerkl 2010).

毒素基因的转录调控

尽管转录因子的差异表达分析可以深入了解毒液分泌细胞的GRN，但它并没有揭示哪些元素直接控制其主要产物（即毒素）的表达。基因结构的比较DNA分析、报告分析和基序结合测试等研究已开始对毒液基因的个体表达控制过程提供一些线索。从文献中收集的转录结合位点的完整列表见补充表S1和S2,补充材料在线。

Cis公司-启动子区域的监管要素

深入了解转录调控的一个良好起点是分析～1000区域 毒素基因转录起始位点上游的bp，因为它包含特定的DNA序列（“顺式-调控元件”）为转录因子、增强子、沉默子和其他上调或下调基因表达的元件提供结合位点。中的研究线虫属事实证明，启动子区域和编码毒素的基因的第一部分包含所有必要的元素，不仅用于表达，还用于组织特异性(Columbus-Shenkar等人。2018;Sachkova等人。2019). 不幸的是，这些研究中没有研究直接控制毒素基因表达的转录因子；尽管如此，目前可获得的大量基因组数据提供了识别这些基序和结合位点的机会，以进一步探索这一主题。

启动子区域的DNA序列分析主要在蛇中进行。眼镜蛇三指毒素家族心脏毒素基因的研究马来西亚射毒眼镜蛇发现存在两个假定的糖皮质激素受体结合位点，氯霉素乙酰转移酶报告试验表明，当糖皮质激素存在时，对基因表达有抑制作用(Ma等人。2001). 激活的糖皮质激素受体可以与毒腺核提取物中的NFkB或AP1复合(Luna等人。2009)-阻止它们结合目标基因，从而间接抑制其表达(Ray和Prefontaine 1994). 糖皮质激素受体也被证明在唾液腺的发育和分泌中起重要作用(Jaskoll等人。1994)先前在唾液腺特异性蛋白胱抑素S的启动子区域发现了多个结合位点(Shaw和Chaparro 1999). 因此，糖皮质激素受体很可能在调节毒素转录的高级机制中发挥作用；然而，需要进一步分析毒液腺细胞中糖皮质激素受体的存在，以了解这些受体在不同毒液系统中所起作用的潜在共性。

启动子区域的插入也影响毒液基因的表达。例如，Trocarin D（TroD）的核苷酸序列比较，TroD是来自卡氏锥虫，及其同源生理对应物，凝血因子X（TrFX），揭示了TroD启动子区存在插入，称为版本在补骨脂素C（PCCS）催化亚基的启动子中也发现了类似的插入物，PCCS是另一种来自东部拟眼镜蛇，尽管这两个插入被认为源于独立的事件(Reza等人。2007). 这种插入被认为是招募过程中的重要因素，负责从肝脏中因子X的低表达转变为毒腺中TroD和PCCS的高表达(Reza等人。2007;Kwong等人。2009). 在TroD，版本港口顺式-将基因表达上调19-49倍但不控制毒液特异性表达的元素(Kwong等人。2009). 类似地，在IA PLA组的启动子区域发现了一个插入₂海蛇中的毒素基因半筋膜阔尾藻(Fujimi、Kariya等人。2002; Fujimi等人。2004;Han等人。2016). 比较序列分析和报告基因分析表明，与相关组IB-PLA相比，该插入显著增加了基因表达₂启动子插入缺失的基因。IA PLA集团₂在这种蛇的毒液中高度表达，而IB-PLA组₂-氨基酸序列中含有胰环，与消化PLA更相似₂哺乳动物胰腺分泌的毒素通常表达量低，在毒液中检测不到。IA PLA组启动子插入₂包含两个E盒和一个GC盒，并存在于其他IA PLA组中₂来自几种蛇的毒液基因，表明该序列可能早于弹性蛇的辐射(Fujimi、Tsuchiya等人。2002; Fujimi等人。2004). 因此，启动子区的插入似乎在提高毒素基因的表达水平方面发挥了重要作用，尤其是与生理学上的、非毒素的对应物相比。然而，这些实验都是在哺乳动物细胞培养中进行的；因此，这些插入物的特殊功能和相关结合转录因子的作用仍有待于在同源系统中进行系统测试。

年的早期实验马来西亚射毒眼镜蛇发现3FTX心脏毒素的转录结合位点与PLA启动子区的转录结合部位有很大不同₂基因(Jeyaseelan等人。2001;Ma等人。2001)尽管其中一些存在于两个毒物编码基因家族中，例如具有激活/增强活性的SP-1。转录结合位点也被发现在同一毒素基因家族成员中保守，但在不同毒素家族之间不保守半筋膜乳杆菌(Fujimi、Kariya等人。2002; Fujimi等人。2004)和卡氏锥虫(Han等人。2016). 由于毒液基因副序列起源于复制事件，因此我们可以推断每个新拷贝都可能从其衍生的副序列继承启动子区域，从而继承调控机制，这将解释基因家族内启动子区域DNA序列的相似性，而非基因家族之间的相似性。事实上，在蛇的基因组中，这种毒液-毒素同源序列通常是串联排列的，但不同的毒素家族基因簇位于不同的染色体位置(Vonk等人。2013;Shibata等人。2018;Schield等人。2019;Suryamohan等人。2020). 单个基因启动子区的后续副基因特异性突变可能至少部分导致任何特定基因家族中的差异表达，因此可能有助于基因表达的“微调”。因为这里讨论的一些毒素家族存在于许多动物毒液系统中（例如PLA₂毒素存在于爬行动物、蛛形纲动物、头足类动物、食腐动物和处女膜类动物中）(Fry等人。2009)，比较这些不同动物谱系中的启动子区域，以探索与这些毒素的聚合分子进化相关的调控元件是否也以可重复的方式进化，这将是非常有趣的。

已知启动子区域也与距离靶基因很远的元件相互作用(2019年Schoenfeld和Fraser). 这些长程增强子、沉默子和绝缘体与目标基因的启动子在空间上非常接近，缺失实验表明，远端增强子对于调控目标基因的时空表达至关重要（例如。，Sagai等人。2005). 最近开发的测序技术，如启动子捕获Hi-C（PCHi-C），可以在单个实验中检测所有启动子的这些远端启动子相互作用区域(Schoenfelder等人。2018). 因此，将PCHi-C应用于毒液分泌细胞可以促进启动子序列的下拉并识别其频繁的长程相互作用伙伴。通过同源系统（如毒腺类有机物）中的基因组操作实验对识别的启动子进行后续验证(Post等人。2020)反过来，可以对启动子功能进行稳健的评估，而对不同毒液谱系中这些区域的比较分析可以提供对这一关键进化特征的大规模调控结构的广泛见解。

Cis公司-内含子中的调控元件

除了启动子区域外，内含子也发挥功能作用，第一个主要参与转录调控，而下游内含子控制基因剪接(Storbeck等人。1998;利维等人。2001;Majewski和Ott 2002). 在中国蝎子身上(东亚钳蝎)，编码神经毒素的基因具有两个外显子和一个内含子的保守结构，可以控制剪接和转录水平(Cao等人。2013). 事实上，当用培养的人类细胞中另一种毒素的内含子替换钾通道毒素基因的内含子时，人工构建物的表达增加(Zhijian等人。2006). 一项对锥蜗牛的类似研究表明大肠杆菌转染含有无内含子a-芋螺毒素结构的载体的活性细胞的表达水平低于含有内含子的载体(Wu等人。2013). 黑寡妇α-拉曲毒素及其相关副产物的基因分析(寡妇蜘蛛)在内含子中发现了几个转录结合位点，尽管这些元素似乎与毒液的产生无关(Bhere等人。2014). 对蛇的研究更进一步，确定了毒液基因内含子中的潜在调控元件。例如，荧光素酶分析表明TroD毒素的毒液特异性表达受位于第一内含子三个插入区内的元素调节(Fujimi等人。2004;Han等人。2016). 在这些调控元件中，富含AG的基序被鉴定具有组织特异性沉默功能，最有效的是能够关闭>95%的基因表达(Han等人。2016). 在哺乳动物细胞中，包括YY1、Sp3和HMGB2在内的转录因子被鉴定为与富含AG的基序结合并沉默基因表达。在其他毒素家族（如PLA）的毒液基因中也观察到类似的富含AG的基序₂在里面半筋膜乳杆菌但不在生理对应物中，也不在家政基因（SDHA、GAPDH、TBP、RPL13A和ACTG1）中(Han等人。2016). 有趣的是，含有富含AG基序的插入片段在不同的毒素基因之间序列相似性较低；考虑到毒液基因家族有不同的染色体位置和招募时间，似乎在编码毒液毒素的不同基因家族中，进化历史和机制是不同的(Fujimi、Kariya等人。2002;Fujimi等人。2004;Han等人。2016).

TroD中发现的一些富含AG的基序类似于多梳响应元件。这些元素招募多梳组蛋白和转录因子来抑制特定靶基因的转录(Lanzuolo和奥兰多2012;Han等人。2016). 在果蝇，与多梳反应元件位点结合的转录因子包括Pho、Dsp1和Spps，它们分别与蛇的YY1、HMGB2和Sp-1/3同源(Lanzuolo和奥兰多2012;Kassis and Brown 2013年). 由于这些转录因子及其结合位点通过果蝇对于哺乳动物来说，可以设想它们可能在毒液特异性表达中发挥类似的调节作用。因此，研究多梳抑制复合物是否在毒液特异性表达中发挥关键作用，对于扩大我们对非模式生物中多梳组蛋白的理解，进而对基因调控的总体理解，可能具有根本重要性。

毒素的选择性表达模式和机制

与毒液调节相关的另一层复杂性是那些控制产生哪些毒素、何时产生以及产生多少毒素的因素。在有毒动物基因组中发现的众多毒素基因中，很明显，并非所有的毒素基因都能产生分泌毒液中可检测到的肽/蛋白质，其中一些未转录，而另一些则被修饰或未翻译。毒素的选择性表达具有重要意义：它可以增加毒液的多样性和复杂性，反过来，这可能有利于，例如，最大限度地提高针对不同范围猎物的关键受体的机会，或补偿毒素抗性的进化(Arbuckle等人。2017). 虽然毒素基因的组织特异性表达似乎主要受转录调控控制，例如基因沉默，但毒液蛋白的变异似乎受转录前和转录后过程的调节(图3).

毒液成分的时空变化

近年来，越来越多的有毒动物被发现以异质的方式在分泌毒液的组织中产生毒素。锥蜗牛能够产生独特的毒液，用作对抗捕食者的麻痹性毒素，或引发感官剥夺和活动不足的状态，以固定猎物。与这些捕食者或前y种毒液相关的不同毒素组沿着毒液导管进行差异表达和合成，防御诱发毒素分泌在近端区域，捕食诱发毒素产生在远端区域(Dutertre等人。2014). 蜈蚣中也观察到类似的分隔现象(Undheim等人。2015)和刺客昆虫(Walker等人。2018)这两种情况与锥蜗牛相似，在锥蜗牛的毒液腺的不同部位产生不同功能的毒液。在所有情况下，转录组和蛋白质组水平都是相互关联的，这表明差异转录的调控机制是通过沉默或增强，或两者的结合。虽然没有证据表明蛇能够从同一腺体产生类似的、功能不同的毒液，但最近的研究表明毒液腺体中可能存在一些毒素定位元素。单细胞RNA-seq显示，不同细胞群的毒液腺衍生类有机物表达不同的毒素类别(Post等人。2020)而质谱成像显示，不同的毒素在蛇毒腺中以高度可变的方式在空间上分布(Hamilton等人。2020).

替代拼接

一种常见的转录后调控机制是选择性剪接，它通常由外显子跳跃或内含子保留产生。后者在植物、真菌和单细胞真核生物中最常见；它通常与通过无义介导的衰变（NMD）下调基因表达有关，由此保留的内含子序列中断了mRNA的主要开放阅读框架，导致过早终止密码子或二次启动密码子的引入(雅各布和史密斯2017). 这两种机制都发生在哈布蛇身上(黄色葡萄球菌)在三个蛋白家族中观察到广泛的选择性剪接，即金属蛋白酶（SVMP）、丝氨酸蛋白酶（SVSP）和血管内皮生长因子；然而，没有其他毒液基因或其生理对应物显示出选择性剪接的证据(小川等人。2019). 除此之外顺式-剪接转录物，反式-剪接变异体也被发现起源于多个串联聚集基因(小川等人。2019). PLA嵌合mRNA序列₂草原响尾蛇的毒物编码基因已被描述(草原响尾蛇) (Tsai等人。2003); 然而，这些嵌合体解放军₂s在毒液中不存在，这表明有一种机制（如NMD）阻止了它们的翻译或分泌。A类反式-在中国蝎子中也发现了拼接毒素转录本(东亚钳蝎); 其特征是早期终止密码子和多个开放阅读框表明NMD途径可快速降解(Zhu等人。2001). 普通蜘蛛(温室希蛛)也显示毒液基因的复杂转录模式，由5′和3′剪接位点交替、外显子跳跃、互斥外显子以及第一外显子和最后外显子交替产生，但不通过内含子保留(哈尼等人。2019). 有趣的是，Bhere等人。(2014)发现黑寡妇蜘蛛α-latrotoxin paralog的3′UTR中存在内含子，这可能导致转录物通过NMD途径减少翻译。事实上，毒液中的α-latrotoxin paralog未通过质谱检测到，而主要的α-拉特罗毒素是分泌出来的，它不含3′UTR内含子。

与其他有毒动物相比，海葵中毒液毒素的变化似乎受到转录和转录后过程的控制。几种毒素在发育阶段和身体组织中表现出不同的表达模式，它们的转录组和蛋白质组丰度相互关联，表明转录机制控制着时空动力学(Moran、Genikhovich等人。2012;Macrander等人。2016;Columbus-Shenkar等人。2018;Sachkova等人。2019;Surm等人。2019). 然而，神经毒素Nv1在线虫属，但由于内含子保留在Nv1转录本中，胚胎和扁平苔藓缺乏成熟毒素(Moran等人。2008).

微型核糖核酸

除了上面讨论的调控过程外，另一种被确定为负责或促成毒液成分变化的转录后机制是miRNAs。miRNA代表一类小（～22 nt）通过降解靶mRNA和/或抑制其翻译来调节基因表达的非编码RNA(安布罗斯2004).德班等人。(2013)表明靶向SVMP和crotoxin（一种神经毒性PLA）的miRNAs浓度随年龄变化₂)毒物编码mRNAs调节响尾蛇从富含crotoxin的幼年毒液到富含SVMP的成年毒液的转变鳄鱼随后，在其他三种同类响尾蛇中也描述了同样的机制(德班等人。2017)这表明miRNAs可能在调节毒液的个体发育变化中发挥重要作用，至少在蛇中是如此。有趣的是，在这种情况下，miRNAs似乎具有双重作用，因为它们不仅沉默了crotoxin的翻译，而且似乎同时上调了SVMP靶向mRNAs。令人惊讶的是，miRNA在毒液调节中的作用只在这几种响尾蛇中进行了深入的研究，因此将对小RNA的研究扩展到其他毒液谱系将是非常有趣的。

结束语和未来方向

总之，有毒生物为解决与进化和分子生物学有关的关键问题提供了令人兴奋的模型(图4)随着组学技术的不断进步，毒液研究的可观价值在更广泛的科学界中越来越大(Holford等人。2018;Post等人。2020;Suryamohan等人。2020). 然而，在广泛了解不同动物毒液系统的起源、进化和调节的分子机制之前，还需要进行更多的研究工作。特别是，我们鼓励研究人员

• 建立不同毒液谱系的代表性模型，用于扩大我们对分泌毒液细胞和组织起源的了解。反过来，这些模型将使我们能够有力地探索进化生物学中的一个基本问题：不同的动物谱系是如何进化出类似的特征的？

• 通过改进当前可用基因组的组合，并使用新的测序技术生成新的基因组数据，扩展有毒动物的现有基因组数据。这些数据资源需要支持采用先进的基因组技术（例如PCHi-C和染色质免疫沉淀测序），以阐明毒液分泌细胞的GRN。

• 开始对不同蛋白质家族和动物谱系的毒素基因调控区进行比较基因组学研究，以探索与毒素家族聚合分子进化相关的调控元件是否也以可重复的方式进化。

目前可用于各种有毒生物的大量测序数据已经为此类比较分析提供了宝贵的初始资源，以确定GRN中涉及的元素顺式-和反式-这些比较产生的调控元件，以及文献中已经报道的调控元件可以通过基因组操作进行测试，例如CRISPR/Cas9已经成功应用于线虫属-和RNA干扰（RNAi）-在蜘蛛中建立，用于研究胚胎发育和分割（例如。，Schönauer等人。2016). 这些数据，再加上基因表达水平、蛋白质组数据、质谱成像和单细胞测序方法，将继续推动该领域的发展，有助于确定新的适应性基因和与出现相关的GRN成员选择性表达所涉及的调控过程和元素，保持和多样化的进化创新。最终，我们认为，动物毒液的聚合进化可以作为有价值的模型加以利用，为新适应进化机制的一般性提供有力的见解。动物毒液经常出现在动物生命树的各个领域。

致谢

我们感谢M.Robinson-Rechavi富有成果的见解，感谢Yehu Moran和两位匿名审稿人的反馈和建议，这有助于扩大本手稿初稿的范围。

参考文献