ALS8患者诱导多能干细胞运动神经元VAPB表达下调

摘要

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种无法治愈的神经肌肉疾病，会导致生活质量严重下降和过早死亡。大约10%的病例是遗传性的，ALS8是一种常染色体显性遗传的家族性ALS，由吸血鬼相关蛋白B/C突变引起(VAPB公司)基因。VAPB蛋白参与许多细胞过程，除ALS8外，还可能参与其他形式ALS的发病机制。许多在ALS动物模型中成功的药物试验无法转化为人类，这突出表明需要新的方法。诱导多能干细胞（iPSC）技术带来了新的希望，因为它可以用于建模和研究疾病在体外在这里，我们提供了一个基于ALS8-iPSC的额外工具来研究ALS。来自ALS8患者及其非携带者兄弟姐妹的成纤维细胞被成功重组为多能状态并分化为运动神经元。我们首次表明，在ALS8衍生的运动神经元中，VAPB蛋白水平降低，但与过度表达系统相比，无法鉴定细胞质聚集体。我们的结果表明，最佳VAPB水平可能在ALS8的发病机制中起着核心作用，这与在散发性ALS中观察到的VAPB减少相一致。

简介

肌萎缩侧索硬化症（ALS），也被称为Lou Gehrig病，是最常见的成人型运动神经元病（MND）(1). 临床表现包括肌肉萎缩和无力，伴有束状和痉挛，以及皮层、脑干和脊髓运动神经元的快速进行性退化(2). 患者的死亡发生在症状出现后2至5年，通常是由于呼吸衰竭(三). 这种疾病不仅没有治愈方法，而且其发病机制也鲜为人知。大约90%的ALS病例为散发性（SALS），其余10%为家族性（FALS），大多数为常染色体显性遗传(4). ALS涉及10多个不同的基因座，包括超氧化物歧化酶1（SOD1，ALS1）(5)，Tar-DNA结合蛋白-43（TDP-43，ALS10）(6–8)，融合肉瘤（FUS，ALS6）(9,10)和vamp相关蛋白B/C（VAPB，ALS8）(11).

ALS8是一种常染色体显性遗传型FALS，首次在巴西家族中定位(12). 随后，囊泡相关膜蛋白相关蛋白B/c的突变c.166C>T(VAPB/C公司)该基因在巴西的原始家族和其他六个ALS家系中被鉴定(11). 嘧啶转换导致VAPB蛋白第56位（P56S）的丝氨酸取代脯氨酸(11). 巴西家族具有创始人效应，因为他们拥有相同的单倍型(13). 然而，ALS8并不局限于南美。在德国发现了相同的P56S突变(14)还有一个日本血统的病人(15). 该德国患者的单倍型与巴西家系不同，表明该P56S突变独立于巴西创始人突变(14). 此外，最近的一项研究发现，一名英国ALS患者中的一种新突变（T46I）导致了与P56S突变相似的分子缺陷(16). 在未受ALS或其他MND影响的人群中未观察到这些突变(11,16). 总之，这些数据提供了证据，证明ALS8并不像之前提出的那样罕见(17,18).

ALS8与高度可变的临床病程相关。一些受影响的患者可能会出现快速而严重的病程，而其他患者则表现出缓慢的进展，有时需要几十年才能发展成严重的运动障碍(11和未发布的数据）。了解是什么保护了一些个体免受VAPB突变的有害影响是非常有趣的，因为它可能为治疗提供了一个窗口。VAPB是一种II型完整膜蛋白，由氨基末端主要精子蛋白（MSP）、中心线圈和内质网膜锚定的羧基末端结构域组成(19–21). 该蛋白在系统发育上很保守；VAPB的同源物在从酵母到哺乳动物的物种中都有发现(11,21,22). VAP通常普遍表达并定位于内质网和前高尔基体中间体(23). 它们与许多细胞功能有关，包括调节脂质转运和体内平衡，形成突触前终末和未折叠蛋白反应（UPR）(24). VAP也被证明是一种分泌激素，因为VAP的MSP结构域被裂解、分泌，并作为昆虫和苍蝇中Eph受体的配体(25). 因此，许多细胞过程中的缺陷可能与ALS8的发病机制有关。P56S突变的生物学性质似乎很复杂。首先，P56S突变可能导致功能丧失，因为它导致VAPB与一些关键蛋白的相互作用水平降低(26). 然而，突变型VAPB的轻度过表达已被证明在培养细胞中诱导UPR(27)和苍蝇(25)与在SOD1小鼠中观察到的情况类似(28). 这些数据表明，它可能有毒，并具有功能特性。最后，突变也可能导致显性负效应，因为突变蛋白隔离野生型（WT）VAPB，从而促成细胞质聚集(16,21).

VAPB功能丧失可能导致其他家族性和散发性ALS。事实上，SALS患者运动神经元中VAPB蛋白水平降低(29,30). 此外，在SOD1小鼠模型中，VAPB水平随着疾病的进展而降低(29). 然而，VAPB的丢失如何参与散发性或家族性ALS的发病机制尚未确定。对人类细胞中ALS的研究可能有助于确定VAPB缺失是如何导致疾病的，但目前还没有这种细胞。诱导多能干细胞（iPSC）技术提供了一个新的机会，因为它允许ALS患者的基因组被捕获到多能干细胞谱系中。从ALS患者的组织中创造iPSC也可以解决人类特有的影响，维持疾病发生的遗传背景(31). 在这里，我们证明了iPSC的成功生成和ALS8患者细胞的进一步运动神经元分化。我们发现VAPB蛋白存在于多能干细胞和来自iPSC的运动神经元中。重要的是，我们发现ALS8患者的成纤维细胞、iPSC和运动神经元中VAPB的水平降低。我们认为VAPB水平降低可能是导致ALS8发病的初始缺陷，ALS8-iPSC可用于开发早期诊断工具，并确定未来治疗的可能药物和靶点。

结果

从ALS8患者成纤维细胞中生成iPSCs

为了减少可能由遗传背景引起的差异，我们选择了两个ALS8家族，并在签署同意书后从受影响患者及其非携带者兄弟姐妹身上采集了皮肤活检；家庭2有一名对照组和两名患者（图1A） ●●●●。我们按照标准的细胞培养方案培养外植体。我们按照描述进行了细胞重编程(32)，使用c-Myc公司,2004年10月3日,Klf4公司和SOX2标准(31). 这使得病毒转导后10-15天可以产生人类胚胎干细胞（hESC）样细胞（图1B和C）。我们根据类人胚胎干细胞的形态选择iPSC菌落，并将其转移到无饲料培养条件下（图1D和E）。我们成功地将所有七个样本（四名患者和三名对照）重新编程为多能干细胞，并通过几个通道将其扩展。我们使用聚合酶链反应（PCR）和海III限制性内切酶消化显示ALS8突变的独特带，对照DNA中不存在，并证实所有患者源细胞中的P56S突变(补充材料，图S1). 为了确定细胞是否具有多能性，我们用多能标记物对iPSC菌落进行了免疫细胞化学。我们发现来自对照组和ALS8患者的iPSC表达第28行和纳克（图1F–I）。我们还使用引物进行了半定量RT-PCR，用于内源性表达10月4日和纳克检查他们的表情。我们发现这些标记物存在于iPSC中，但不存在于同一个体的成纤维细胞中(补充材料，图S2). 更重要的是，确认诱导的iPSC是否具有多潜能体内，我们将其注射到裸鼠皮下，以检测iPSCs是否能诱导畸胎瘤。事实上，我们发现了来自三个胚层的组织，包括来自内胚层的肠样细胞、来自中胚层的软骨和肌肉以及来自外胚层的神经玫瑰花结（图1J–M）。为了确保基因组重排不会被诱导，我们对细胞进行了核型分析。iPSC染色体数量和组织正常（图1N–O）。这些数据共同表明，我们成功地从ALS8患者及其正常同胞的组织中生成了ALS8-ipsc。

接下来，我们检查了WT或ALS8突变VAPB是否在iPSC细胞中表达。尽管VAPB在许多组织中表达(27)，它是否在多能干细胞中表达尚待确定。为了特异性检测VAPB蛋白，我们针对VAPB N末端部分的序列制备了单克隆抗体（A1315F3G10）。该序列对VAPB是唯一的，并且抗体不能识别VAPA蛋白(补充材料，图S3). 我们证实单克隆VAPB抗体可以在分别表达WT VAPB和P56S突变体VAPB的培养细胞中检测WT VAPB和突变体ALS8的表达（图2A） ●●●●。此外，该抗体能够检测P56S-VAPB过度表达产生的细胞质内含物（图2A和插图）。我们对ALS8-iPSCs进行免疫染色，并用抗VAPB抗体和多功能标记物抗Nanog抗体控制iPSCs。我们发现VAPB在ALS8-ipCS中表达，类似于对照iPSC（图2B） ●●●●。细胞重编程到多功能状态需要涉及转录和表观遗传因子的几个步骤。为了进一步确定VAPB蛋白在多能期表达，我们还通过抗VAPB抗体的western blotting检测了VAPB在人类ES细胞系HUES9和HUES6中的表达。我们发现VAPB也在两种人类ES细胞中表达（图2C） 这表明它存在于多能期的细胞中。综上所述，数据表明iPSCs中的P56S突变不会干扰多能性。

P56S VAPB突变不抑制iPSC运动神经元的分化和维持

为了确定来自多能干细胞的ALS8患者的运动神经元是否显示缺陷，我们根据先前的方案诱导了ALS8-ipCS和对照组的运动神经元分化(33)稍作修改（参见材料和方法）。为了鉴定运动神经元，我们使用了一个报告者构建的Hb9（启动子/增强子）-GFP(血红蛋白9：：GFP）(33). 我们首先在悬浮液中创建了类胚体（EB），并从iPSC中诱导神经细胞。培养4周后，我们通过运动神经元祖细胞标记物Islet-1的表达证实了神经元分化（图三A） 和有丝分裂后神经元标记物Map2（图三B和C）。然后我们分离EB并将其涂布在涂布的盘子上。分化7周后，我们观察到HB9型：：GFP报告者，在对照细胞和ALS8-iPSC衍生细胞中，提示从ALS8-iPSC和对照iPSC诱导运动神经元(D类). 最后，iPSC-derived运动神经元与C2C12成肌细胞共同培养，可以结合α-银杏毒素，显示神经肌肉接头的形成（图三E和F）。在这些条件下，ALS8-iPSCs可以分化为运动神经元，其效率与对照组相似，约为5%，表明P56S突变型VAPB不抑制运动神经元的分化和维持(补充材料，图S4).

ALS8突变不会导致iPSC-derived运动神经元的细胞质内含物

细胞蛋白异常内含是许多神经退行性疾病的共同特征。类似地，ALS8突变体VAPB的细胞质内含物可能是ALS8的关键病理特征。在培养细胞中(11,29,34–38)，只苍蝇(21,25,39)和老鼠(40)突变体VAPB的表达导致细胞质内含物，细胞质内含体也将WT形式招募到内含物中(25,29). 为了确定VAPB蛋白内含物是否为ALS8患者的早期病理特征，我们对来自对照组和ALS8-ipCS的运动神经元进行了免疫染色。我们使用维持分化7周的运动神经元。VAPB在源自ALS8-iPSCs的运动神经元的细胞质中广泛表达，类似于对照运动神经元（图三G和H）。与高水平表达突变VAPB的细胞相比（图2A） ，我们没有在运动神经元中观察到VAPB蛋白的细胞质内含物。

P56S突变导致VAPB蛋白泛素化(21,34)，泛素化VAP通常积聚在细胞质内含物中(21). 因此，我们询问通过干扰泛素/蛋白酶体系统来增加VAPB水平是否会增强泛素化VAPB和正常细胞培养条件下不会出现的细胞质聚集体。蛋白酶体系统可以被蛋白酶体抑制剂MG132抑制(41). 我们检测了来自对照组和ALS8-iPSCs的成纤维细胞和运动神经元中存在MG132的泛素化蛋白和VAPB内含物。在MG132存在的情况下，我们检测到成纤维细胞和运动神经元中泛素染色增加，表明蛋白酶体功能受到成功抑制（图4). 然而，与对照细胞相比，我们没有观察到ALS8处理的成纤维细胞中泛素化蛋白的积累增加（图4A） ●●●●。同样，与对照细胞相比，我们没有观察到接受MG132治疗的分化运动神经元中泛素化蛋白的积累增加（图4B） ●●●●。令人惊讶的是，在MG132治疗后，对照组和ALS8成纤维细胞均显示VAPB水平降低，这表明除蛋白酶体外的蛋白质调节系统作用于VAPB途径（图4C） 。

运动神经元诱导过程中VAPB蛋白上调失败

我们试图确定与对照组相比，患者ALS8-iPSCs和运动神经元中VAPB蛋白的水平是否存在差异。有趣的是，与对照iPSC相比，ALS8-ipSC中VAPB蛋白的水平降低（图5A和B）。VAPB蛋白水平的降低与用于比较的iPSC克隆无关(补充材料，图S5). 然后我们检查了在运动神经元诱导过程中是否也观察到VAPB蛋白水平的降低。我们进行了免疫印迹分析，并比较了对照和ALS8-iPSC衍生血统中的VAPB水平。如图所示5C和D，在分化的所有阶段，源自ALS8 iPSC的细胞中VAPB显著减少。有趣的是，在对照iPSC的分化过程中，VAPB蛋白的水平逐渐增加（图5D） ●●●●。然而，在ALS8-iPSCs的神经元分化过程中，我们没有观察到VAPB蛋白的上调（图5D） 这表明ALS8突变在神经元和运动神经元诱导期间导致VAPB蛋白上调失败。为了确定VAPB蛋白的量是否控制在转录水平，我们进行了实时PCR分析。VAPB mRNA水平在对照组和ALS8成纤维细胞培养物之间没有差异，表明VAPB调节可能发生在翻译后水平(补充材料，图S6).

讨论

ALS是一种致命的疾病，其发病机制尚不清楚。家族性ALS小鼠模型的产生，特别是SOD1，有助于阐明疾病发病机制的几个重要方面，但仍缺乏精确的分子机制。重要的是，一些在动物系统中取得成功的药物测试没有成功地转化为人类(42). 在ALS患者中翻译这些策略缺乏成功可能是因为使用了单一动物模型，即携带高转基因拷贝数的SOD1小鼠(42,43). 因此，有必要创建其他小鼠模型以及药物测试策略。ALS8相关的神经退行性变途径似乎与其他ALS形式具有共同的特征(29)到目前为止，在散发患者中观察到VAPB蛋白水平下降，这表明它可能在多种疾病的发病机制中起重要作用(29,30). 因此，我们决定生产ALS8患者衍生的iPSC以及非携带者兄弟姐妹的iPSC作为对照。

所有成纤维细胞样本都被重新编程为多功能状态。他们的细胞和分子特征证明这些是真正的iPSC。我们发现对照组和ALS8细胞的VAPB分布模式没有明显改变，即使在神经元成熟所需的7–8周后，也无法在ALS8衍生运动神经元中识别内含物。此外，蛋白酶体抑制剂MG132的使用并没有加剧聚集不足。这种未能检测到聚集物的现象扩展到所有细胞类型——成纤维细胞、iPSC和诱导分化为运动神经元的细胞。值得注意的是，尽管转基因突变VAPB小鼠在～18个月大时出现细胞质内含物，但它们不会发展成MND(40). 运动神经元的寿命可能很短在体外可能不允许在我们的系统中检测骨料。细胞质内聚集物存在于许多不同形式的ALS中，包括SOD1（ALS1）(44,45)，TDP-43（ALS10）(6–8)，FUS/TLS（ALS6）(9)和VAPB本身(11,21,25,29,34–40). 许多聚集物对TDP-43也呈免疫阳性。然而，在SOD1模型中找不到它们(46)也没有在携带TDP-43蛋白A315T突变的转基因小鼠中记录到它们(47). 因此，这些聚集物与发病机制的关系尚不清楚。神经毒性可能不是由细胞质内含物本身引起的(47).

我们发现VAPB在多能干细胞发育早期表达，并且在运动神经元分化过程中蛋白质水平增加。与其他研究类似(48,49)我们的结果表明，导致MND的突变不太可能影响细胞重编程。当受影响的蛋白在多能期表达时，情况似乎也是如此，比如VAPB（本研究）和SMN蛋白，它们负责脊髓性肌萎缩(48). VAPB水平的重要性已记录在果蝇属神经肌肉接头。VAPB同源基因dVAP-33在苍蝇中的过度表达会减少神经肌肉接头处的发情节大小并增加其数量，而dVAP33的减少或丢失会导致发情节数量减少和大小增加(50). 因此，与非携带者同胞相比，ALS8患者的VAPB蛋白水平尤其是运动神经元中VAPB蛋白质水平的显著降低可能会产生生物学后果。与对照组相比，ALS8细胞的VAPB减少>50%。由于对照组和ALS8患者样本中VAPB转录量非常相似，我们建议其表达在蛋白质水平上受到调节。MG132处理后VAPB蛋白的减少与免疫细胞化学中缺乏聚集物一致。因此，阻断泛素途径并不能拯救VAPB水平。一旦在成纤维细胞中观察到VAPB减少，这些细胞就可以成为评估旨在纠正VAPB突变表型的策略的替代来源。ALS8患者VAPB蛋白减少有几种可能的解释。突变蛋白可能没有正确折叠，也不太稳定(51,52). 或者，突变链可能与野生型亚型形成二聚体(38,53)也会破坏野生型蛋白质的稳定性。这意味着ALS8突变作为一个显性阴性等位基因起作用，并且应该与先前记录的无效等位基因具有相同的特征(36). 此外，P56SVAPB的表达与VAP敲除对初级神经元的作用相似，因为两者都会导致细胞死亡(29). 我们的工作和其他方面的成果(29,36)支持P56S显性效应至少部分是由于VAPB功能丧失的假设。

患者和对照组之间VAPB比率水平的降低强化了iPSC技术可以重现患者原始细胞状态的想法(32,54,55). 事实上，ALS8患者样本中运动神经元的VAPB减少，这表明VAPB的正确量可能对其生存至关重要。散发性ALS死后组织中VAPB蛋白水平的降低以及SOD1突变小鼠中伴随ALS进展而出现的VAPB蛋白质水平的降低加强了这一假设(29). 有趣的是，伴随着神经元分化，WT培养的细胞呈现出突变培养中未观察到的VAPB水平的增加。众所周知，VAPB处理在某些脑区和发育过程中是不同的(27,53). 我们假设，即使在存在少量VAPB的情况下，ALS8携带者在达到生命的第四个或第五个十年之前也是正常的，此时水平变得极低。我们的结果表明，iPSCs可以重述ALS8的某些方面，并用于提取与人类运动神经元发育相关的新的生物信息。我们相信，这种细胞模型有潜力补充其他人类和动物模型，以加速发现治疗ALS和其他形式的运动神经元神经退行性变的新化合物。

材料和方法

皮肤活检

所有程序均经圣保罗大学（巴西USP）、圣保罗联邦大学（巴西UNIFESP）和加州大学圣地亚哥分校（UCSD）委员会批准后进行。经验丰富的神经科医生对ALS8患者进行了分析，根据临床表现确定了疾病。最初，从淋巴细胞中提取DNA。突变c.c>T₁₆₆（P56S）由确认海III酶消化和包含外显子2的扩增子测序(11). ALS8家族是根据可用性选择的，以满足至少两个受影响的兄弟姐妹和一个来自相同生殖器的正常兄弟姐妹的标准。局部麻醉后，由一名神经科医生用3mm的穿孔机进行皮肤活检。外植体收集在含有5%（v/v）抗生素（Pen/Strep 10 000 U/ml）的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）（1×）中。用DMEM（1×）与10%（v/v）胎牛血清和2%（v/v）抗生素进行成纤维细胞培养。

细胞重编程

如前所述执行细胞重新编程(32). 简单地说，四个山中因素(c-Myc公司,2004年10月3日,Klf4公司和SOX2标准) (31)用逆转录病毒系统感染低代成纤维细胞。2天后，受感染的人成纤维细胞被转移到辐照小鼠胚胎成纤维细胞（Chemicon）饲养层上的人胚胎干细胞条件下。病毒转导后10-15天出现类hESC细胞。通过形态学选择iPSC菌落，并在Matrigel-coated培养皿（BD Bioscience）和mTeSR1（Stem Cell Techonologies）中手动移动至无饲料状态。在分化方案开始之前，iPSC是手动传递的，并保持在无饲料状态。从一个对照组和两个患者中选择三个克隆，以进一步表征每个家族。

畸胎瘤形成

约3×10⁶将iPSCs皮下注射到异氟烷麻醉的裸鼠（CByJ.Cg-Foxn1-nu/J）的背侧翼。注射后5至6周，对畸胎瘤进行解剖，在10%福尔马林磷酸盐中固定过夜，并将其包埋在石蜡中。切片用苏木精和伊红染色以作进一步分析。这些方案之前由加州大学圣地亚哥研究所动物护理和使用委员会批准。

运动神经元分化

运动神经元的分化基于先前的方案(33)进行了一些修改。简言之，分化期为7-8周，对照组和患者样本的最终效率均为5%。第0天，在F12/DMEM（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）将无饲料条件下的合流iPSC移至N2培养基。第二天，一种BMP信号抑制剂，背吗啡-1µ米添加了（Calbiochem）。第三天，使用dispase（0.5 mg/ml）分离菌落，并在37°C下旋转形成EB。细胞在这种条件下再维持4周，逐渐添加神经元存活和分化诱导剂，如下所示：第9天，添加分化维甲酸（1µ米)添加抗坏血酸（200ng/ml）；第16天，添加声波刺猬（SHH-500 ng/ml:R&D Systems）、脑源性神经因子（20 ng/ml:Peprotech）、生长源性神经因素（20 ng/ml:Perotech），同时去除背吗啡。在第30天，细胞被镀在聚甲状腺素/层粘连蛋白涂层板上，并在培养基中再保存3-4周。细胞贴壁后，通过将SHH降低至100 ng/ml和添加环磷酸腺苷（1µ米).血红蛋白9：：使用慢病毒系统将GFP报告子构建转移到细胞(33). 在分离时或将细胞接种于poli-O/L后2天，将慢病毒添加到培养物中。对于神经肌肉接头分析，我们使用C2C12成肌细胞（ATCC），如前所述(33). 简单地说，运动神经元祖细胞被置于肌管顶部约4周。固定细胞，并通过结合α-银杏毒素与Alexa 568（1:200，分子探针，Invitrogen）检测神经肌肉接头的形成。

蛋白酶体抑制试验

MG132（Sigma）用于阻断蛋白酶体系统。多次尝试优化MG132浓度。成纤维细胞用10µ米MG132。运动神经元用5µ米抑制剂24小时。

核型分析

Cell Line Genetics（美国威斯康星州麦迪逊）和Molecular Diagnostic Services，Inc（美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行了标准G带染色体分析。

免疫细胞化学

用4%多聚甲醛固定细胞，然后在含有5%（v/v）驴血清的PBS中渗透并用0.1%（v/v）Triton X封闭1h。在4°C下培养一级抗体过夜。在二级抗体孵育（Jackson Laboratories和Alexa Fluor Dyes，Life Technologies）1h之前，将样品清洗三次。一级抗体浓度为：α-hVAPB小鼠单克隆A1315F3G10 1:500；α-泛素兔多克隆1:1000（Dako）；α-纳米鼠单克隆抗体1:100（BD Bioscience）；α-Oct3/4小鼠单克隆抗体1:250（Santa Cruz）；α-Lin28山羊多克隆1:400（研发系统）；α-MAP2小鼠多克隆1:200（Milipore）；α-TDP-43兔多克隆1:500（Novus Biologicals）；α-GFP鸡多克隆1:500（Aves Lab）和α-ChAt 1:100（Chemicon）。图像通过奥林巴斯FV1000共焦显微镜和蔡司免疫荧光显微镜获得。

蛋白质印迹分析

收集细胞，将其重新悬浮在含有1%（v/v）蛋白抑制剂混合物（Sigma）的1×RIPA裂解缓冲液（Milipore）中，研磨并在10 000下离心克在4°C下保持20分钟。在4–12%预铸Bis–Tris丙烯酰胺梯度凝胶（Invitrogen，Life Tech）中分离出10微克蛋白质提取物，转移到硝化纤维膜上，并用一级抗体探测：α-hVAPB小鼠单克隆A1315F3G10 1:1000或α-泛素兔多克隆1:1000（Dako），随后是辣根过氧化物酶缀合的第二抗体。通过ECL化学发光（Amersham）进行可视化。使用抗β-actin 1:5000（Ambion）和tubulin 1:5000（Ambion）的抗体对膜进行剥离和再防护，以产生蛋白质负载的控制。为了进行半定量分析，使用Typhoon 8600扫描仪（分子动力学）对胶片进行扫描，并使用ImageJ对微管蛋白和β-肌动蛋白的带信号强度进行分析和校正。

RNA提取和RT-PCR

使用Trizol提取总RNA。通过使用Super Script III第一链合成系统从Invitrogen进行RT–PCR进行逆转录酶反应。使用以下引物通过PCR扩增cDNA合成：纳克F5′-cctctgtgattgtgg-3′和纳米R5′-ctggaccttgtcttccttt-3′；小时10月4日（F）5′-gggagggaggactagg-3′和h2014年10月5′-tccaaccagttgccccaaac-3′。我们使用SYBR Green Mix和GAPDH引物进行实时PCRF类5′-TGCACCACACTCGCTTAGC-3′和R（右）5′-ggcatggactgtggtcatg-3′；VAPB公司F类5′-caatagtctatagctctgag-3′和R（右）7500实时PCR系统上的5′-gtccatcttccttgaactg-3′（应用生物系统/生命技术）。使用7500 Software v2.0.4提取并分析结果。

补充材料

HMG在线提供补充材料。

资金

这项工作得到了圣保罗保护基金会（FAPESP-CEPID）的支持；国家科学技术研究所（INCT）；国家环境保护委员会（CNPq）；肌肉营养不良协会拨款（MDA185410）和保罗·冈蒂霍研究所（IPG）。FAPESP-CEPID和INCT为支付本文的开放存取出版费用提供了资金。

致谢

我们感谢Johnny Ngsee博士提供VAP质粒。

利益冲突声明。未声明。

参考文献