小分子热休克蛋白B8（HspB8）促进与肌萎缩侧索硬化（ALS）相关的错误折叠蛋白的自噬清除

摘要

一些神经退行性疾病，包括肌萎缩侧索硬化症（ALS），其特征是存在错误折叠的蛋白质，被认为会引发神经毒性。一些家族型ALS（fALS）与散发性ALS（sALS）在临床上无法区分，与超氧化物歧化酶1（SOD1）基因突变有关。已经表明，突变体SOD1错误折叠，形成不溶性聚集体并损害蛋白酶体。使用转基因G93A-SOD1小鼠，我们发现脊髓运动神经元积累突变SOD1也过度表达小分子热休克蛋白HspB8。使用运动神经元fALS模型，我们证明HspB8减少聚集并增加突变SOD1的溶解度和清除率，而不影响野生型SOD1周转。值得注意的是，即使蛋白酶体活性被特异性阻断，HspB8也会作用于突变的SOD1。自噬的药理学阻断导致突变SOD1聚集体的显著增加。在自噬通量阻断期间进行的免疫沉淀研究表明，突变SOD1与HspB8/Bag3/Hsc70/CHIP多异聚复合物相互作用，已知该复合物可选择性激活错误折叠蛋白的自噬清除。因此，HspB8通过自噬增加突变SOD1清除。转基因G93A-SOD1小鼠的腰椎脊髓中也观察到自噬激活，因为受影响的存活运动神经元中存在多个自噬溶酶体结构。最后，我们将我们的观察扩展到一个不同的ALS模型，并证明HspB8对TDP-43的截短版本具有类似的作用，TDP-43是另一种参与fALS和sALS的蛋白质。总之，这些结果表明，运动神经元中HspB8表达的药理调节可能对揭示fALS和sALS的分子机制具有重要意义。

简介

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，其特征是某些运动神经元的逐渐丧失(1). ALS的一个特征是存在不溶性物质，包括参与主要细胞内降解途径的蛋白质和人类TAR DNA结合蛋白TDP-43（见下文）(1,2). 虽然对这些内含物的作用存在很大争议，但普遍认为它们的形成与蛋白质错误折叠有关，并可能改变运动神经元功能，影响其生存。因此，通过协助蛋白质折叠，可以减少蛋白聚集和/或导致ALS运动神经元细胞死亡的其他级联事件。

80%以上的ALS病例是散发性的（sALS）；在罕见的家族型（fALS）中，约五分之一与铜/锌超氧化物歧化酶1（SOD1）基因突变有关(三)更不用说TDP-43（一种在sALS和非SOD1-fALS内含物中发现的主要成分）编码基因的突变(4,5). 然而，由于sALS和fALS在临床上难以区分，并且不同的研究人员开发了SOD1突变动物和细胞模型，因此这些模型被广泛用于研究该疾病(1). SOD1是一种清除氧化自由基物种的必需酶；虽然许多突变的SOD1保持其酶活性，但部分失去对氧自由基的保护可能会导致SOD1相关fALS运动神经元死亡(6). 然而，运动神经元死亡显然主要是由于与突变SOD1错误折叠相关的神经毒性功能增强(7).

一些研究表明，伴侣有助于去除错误折叠的蛋白质。其中一种伴侣蛋白小热休克蛋白B8（HspB8，也称为Hsp22）的突变是导致远端遗传性运动神经病变II型（dHMN）的原因(8)和常染色体显性遗传的Charcot-Marie–Tooth（CMT）病2L型(9). 有趣的是，HspB8可以有效地去除含有延长的聚谷氨酰胺束的错误折叠蛋白质(10–12)负责其他神经退行性疾病（参见13).

因此，我们在动物和细胞模型中评估了HspB8是否在ALS中发挥保护作用。结果表明，HspB8在转基因G93A-SOD1（tg G93A-SOD1）小鼠中表达上调，并且HspB8选择性地从运动神经元细胞中去除神经毒性突变体SOD1，恢复正常的蛋白酶体活性。这种作用是由自噬体-溶酶体途径（APLP）的激活特异性介导的。HspB8还可抵消TDP-43聚集体的形成。这表明运动神经元中HspB8的诱导可能成为不同形式ALS的一个新的有用靶点。

结果

在本研究中，我们初步分析了HspB8对突变SOD1的溶解度、聚集率和降解的作用，SOD1是导致某些fALS患者运动神经元死亡的原因。在第二组实验中，我们还评估了HspB8对TDP-43溶解度和清除率的影响。

为此，我们利用了永生运动神经元NSC34细胞(14). 这些细胞是胚胎运动神经元与神经母细胞瘤融合产生的杂交细胞。我们制备了表达人SOD1的NSC34细胞，无论是野生型（wtSOD1）还是突变型（G93A-SOD1。NSC34细胞和G93A-SOD1小鼠在我们的实验室中被广泛用于分析错误折叠蛋白对运动神经元的影响(6,15,16).

突变体G93A-SOD1聚集并损伤永生运动神经元的蛋白酶体

已经分析了表达wt或突变体SOD1的NSC34细胞，以评估这两种蛋白质的生物化学行为的差异。数据（图1A） 结果表明，wtSOD1定位于细胞质和细胞核，未形成可见的聚集物。突变体G93A-SOD1被排除在细胞核之外，并形成几个大的细胞内聚集物。永生化运动神经元中产生的不溶性SOD1物种的数量在滤过阻滞试验中进行了量化（图1B）(6,16). 在本试验中，无论是在基础条件下还是在MG132处理后，wtSOD1几乎都无法检测到，这表明即使蛋白酶体受损，wtSOD1也不会聚集。在基础条件下，大量突变SOD1反而保留在膜上，证明G93A突变降低了蛋白质的溶解度。MG132处理后，突变体SOD1积累显著增加。Western blot分析（图1C） 结果表明，在表达wtSOD1的NSC34细胞中，该蛋白为单体形式。在蛋白酶体抑制剂MG132的存在下，wtSOD2的水平仅略有增加。相反，在表达突变型SOD1的NSC34细胞中，该蛋白的单体形式大量减少，同时形成了抗SDS的高M.W.物种，这可能代表错误折叠的突变型SOD的二聚体/寡聚体形式。蛋白酶体活性的抑制导致单体和低聚物物种的大量积累（也可在堆积凝胶中检测到）。为了确定在基础条件下或蛋白酶体损伤期间形成的SOD1聚集体是否具有某些生化相似性，我们使用两种实验方法分析了NSC34细胞中表达的突变SOD1的泛素化模式。免疫荧光显微镜数据（图1D） 表明在基础条件下形成的突变SOD1聚集体仅少量泛素化；在表达突变SOD1的几个细胞中可以明显地看到泛素阳性/SOD1-阴性聚集体。免疫沉淀研究也证实了突变SOD1聚集体缺乏泛素化(补充材料，图S1A). 这些数据与我们之前使用另一种容易折叠和聚集的蛋白质获得的观察结果一致，该蛋白质是雄激素受体（AR），含有一个聚谷氨酰胺束（ARpolyQ），负责ALS相关的运动神经元疾病，即脊髓和延髓肌萎缩症（SBMA或肯尼迪病）。事实上，我们证明ARpolyQ聚集过程发生在蛋白酶体失活之前（或独立于蛋白酶体失活性）(16). 因此，由于不溶性突变体SOD1的清除依赖于蛋白酶体，因此，预计能够损害蛋白酶体功能的生理或病理条件（氧化应激、热休克、有毒化合物等）可能会导致异常蛋白的细胞内积累增加，从而使蛋白质的生化行为恶化。

为了评估蛋白酶体活性，将SOD1s和YFPu蛋白酶体报告蛋白共同转染NSC34细胞(6,16). 结果（图1E和补充材料，图S1B)显示YFPu在表达wtSOD1的永生化运动神经元中完全降解，而在表达突变SOD1细胞中积累，证明这些细胞中的蛋白酶体受损。正如预期的那样，MG132处理后，表达wtSOD1或突变SOD1的细胞中YFPu的积累显著增强(补充材料，图S1B).

蛋白酶体损伤激活永生化运动神经元中HspB8的表达

已知细胞内对错误折叠蛋白的反应可激活伴侣系统，同时涉及经典热休克蛋白（Hsp70、Hsp40等）和小Hsps（HspB1、HspB8等）。小Hsps非常有趣，因为HspB1和HspB8的突变形式与不同形式的CMT 2型疾病以及远端神经病变有关(8,9,17)和共同伴侣Bag3，主要的HspB8相互作用体，在肌营养不良/周围神经病变中被发现突变(18). 此外，HspB8可对抗导致polyQ相关神经退行性疾病的蛋白质的聚集(10). 基于这些观察结果，我们分析了HspB8是否参与SOD1神经毒性的细胞内反应。我们最初证明HspB8在永生化运动神经元细胞中表达。事实上，HspB8 mRNA是可以检测到的（图2A） 并正确翻译（图2B） 在NSC34细胞中。我们还测试了可能导致运动神经元对ALS蛋白毒性敏感的应激细胞条件是否会改变HspB8的表达水平（图2B） ●●●●。血清饥饿只略微改变了HspB8水平；热休克后效果更明显。一般来说，这两种侮辱都不能很好地激活这个小Hsp(11,19). 有趣的是，当蛋白酶体受损（MG132）时，HspB8水平显著升高，蛋白酶体受损是ALS的典型症状。HspB8的增加可能取决于其积累（即降解减少）或基因表达增加（由于细胞的一般降解能力受到干扰）(11,19). 因此，我们使用promB8结构分析了NSC34细胞中的HspB8启动子活性。热休克（42°C）或血清饥饿并未改变HspB8启动子的基础转录激活（图2C） ●●●●。因此，热休克后HspB8蛋白水平的增加至少部分是由于其降解减少（热休克后出现了与细胞内错误折叠蛋白的竞争？）。为了确定合成增加是否有助于热休克诱导的HSPB8启动子活性升高，使用双荧光素酶系统进行评估(20)，因为先前实验中使用的β-半乳糖苷酶水平受到MG132的严重影响。在MG132处理的细胞中检测到HspB8启动子的相当高的激活率（比组成型启动子活性高5倍）（图2D） ●●●●。因此，HspB8蛋白的积累（图2B） 这不仅是因为它的降解减少了，而且还因为它的合成大大增加了。通过实时PCR测量HspB8 mRNA验证了数据（图2E） 免疫细胞化学（ICC）中的蛋白质（图2F） ；两种分析都证实，在蛋白酶体抑制期间，HspB8 mRNA和蛋白质水平增加。

由于蛋白酶体抑制诱导HspB8表达，突变SOD1过度表达导致蛋白酶体抑制（图1D） ，我们分析了突变SOD1对瞬时或稳定转染的（多西环素诱导的NSC34细胞）细胞中HspB8 mRNA水平的影响，该细胞是从罗马大学托尔韦加塔分校的M.T.Carr细胞中获得的。我们发现，即使HspB8 mRNA表达在SOD1酶的存在下趋于增加，蛋白质水平也没有显著影响（图2G和补充材料，图S2)SOD1。这也可能是由于使用了不同的表达系统。

突变体G93A-SOD1诱导脊髓运动神经元HspB8表达

因此，我们分析了ALS小鼠模型中HspB8 mRNA和蛋白的水平。

首先，我们分析了非转基因（nont-g）、tg-wtSOD1和tg-G93A-SOD1小鼠在三个不同疾病阶段（症状前（PS）、临床症状期（CS）和终末期（ES）脊髓中HspB8 mRNA的可能变化。实时PCR（图三A） 显示HspB8的表达在非tg小鼠中随着年龄的增长而略有下降，在最年长时（agES）显著降低，对应于tg G93A-SOD1小鼠中的ES。在所有年龄段的tg-wtSOD1小鼠中，HspB8 mRNA表达均无显著变化。有趣的是，与PS或CS tg G93A-SOD1小鼠以及相应的agES tg wtSOD1鼠相比，在ES tg G93 A-SOD小鼠中检测到HspB8 mRNA表达的诱导。总的来说，数据强烈表明，正常动物的衰老过程可能会对错误折叠的蛋白质的神经毒性产生部分去保护作用，因为成年后HspB8的水平会下降。然而，在老年动物中，对突变SOD1的存在有相当大的反应被激活，这表明脊髓细胞倾向于提高其对错误折叠蛋白的反应能力，这与在NSC34细胞中获得的数据一致，在NSC34细胞中蛋白酶体损伤诱导HspB8过表达。

HspB8蛋白的免疫组织化学分析显示，在所有年龄段的非g和tg wtSOD1小鼠的腰椎脊髓切片中均呈弱而弥散的染色（图三Ba–f和补充材料，图S3A和B）。在ES tg G93A-SOD1小鼠中，明显存在强烈的标记，特别是在腹角、包含外侧和内侧运动神经元池的区域、白质和腹根出口区（图三Bg）。这在高倍放大下得到了证实，运动神经元可以被更好地识别（图三Bb、c、e、f、h、i）。对照非g和tg wtSOD1小鼠的运动神经元在其躯体和近端树突中仅显示微弱的标记（图三Bb、c、e、f和补充材料，图S3A和B），而在tg G93A-SOD1小鼠的腹侧脊髓中，运动神经元的神经纤毛、胞体和近端树突中均存在HspB8免疫反应性（图三Bh和i）。在PS和CS tg G93A-SOD1小鼠的脊髓切片中，与对照组相比，在腹角仅发现HspB8免疫反应性适度增加(补充材料，图S3A–D).

在免疫荧光共聚焦显微镜下分析突变SOD1和HspB8在腰椎脊髓中可能的共定位。与免疫过氧化物酶数据一致（图三)，HspB8在tg-wtSOD1小鼠的运动神经元中表达不良（图4A–A′），而在PS年龄的tg G93A-SOD1小鼠中，HspB8标记仅在积累人SOD1的运动神经元中强烈，而在含有低水平人SOD的运动神经元中弱（图4B–B′）。在ES的tg G93A-SOD1小鼠中，HspB8在含有人SOD1的几个运动神经元和神经膜中强烈表达（图4C–C′）。此外，用抗GFAP进行免疫荧光双重标记以观察星形胶质细胞显示，只有在ES tg G93A-SOD1小鼠的脊髓切片中，腹侧灰质和白质中的反应性星形胶质细胞也表达HspB8（图4D–E）。相反，凝集素LEA鉴定的小胶质细胞不表达HspB8(补充材料，图S3E).

这些数据支持这样的观点，即HspB8在对突变SOD1神经毒性更敏感的运动神经元和仅存在于ES tg G93A-SOD1小鼠的大量活化星形胶质细胞中选择性过度表达。因此，在PS阶段，HspB8 mRNA水平缺乏可检测的增加（图三A） 可以用运动神经元中HspB8表达的有限增加来解释，而在对整个脊髓样本进行的实时PCR中无法检测到。

HspB8表达通过蛋白酶体依赖性途径增加永生化运动神经元的清除率并去除突变的G93A-SOD1寡聚体和聚集体

由于伴侣蛋白的生物作用，我们测试了HspB8改变突变的SOD1溶解度、聚集率和/或蛋白酶体清除共同表达wt或突变的SOD1和HspB8.的NSC34细胞中不溶物的能力的可能性。荧光分析（图5A） 结果表明，在基础条件下，突变SOD1形成细胞内聚集物，被HspB8完全清除；突变的SOD1蛋白水平也显著降低，表明这种伴侣蛋白激活了SOD1降解。此外，虽然在表达HspB8的运动神经元中突变SOD1的水平可以忽略不计，但在wtSOD1水平和细胞分布方面没有检测到任何变化（图5A） ●●●●。定量分析（图1中的表1）5B） 结果表明，HspB8表达降低了含有聚集物的细胞总数和每个细胞的平均聚集物。

图5C显示了HspB8对永生化运动神经元中突变SOD1溶解度的影响。HspB8的过表达完全去除了突变SOD1的抗SDS高分子量低聚物，并增加了全长突变单体的清除率。有趣的是，HspB8也能有效地作用于NSC34细胞中表达的突变SOD1，并伴有MG132诱导的蛋白酶体损伤。通过过滤延迟试验测量不溶性突变SOD1的总水平，获得了类似的数据（图5C、 底部插图）。事实上，HspB8有效地抵消了突变SOD1不溶物总量的形成，证实了突变错误折叠的SOD1蛋白通过细胞内降解系统以HspB8-依赖/蛋白酶体诱导依赖的方式被清除。

对在洗涤剂性能增强的缓冲液中测试的突变SOD1不溶性聚集体的生化行为的分析表明，HspB8的过度表达几乎完全抵消了单体和高分子量物种中所有类型的突变SOD1不溶性物种（PBS-、Triton-、SDS-和甲酸抗性物种）的形成(补充材料，图S4A–D). 这些数据进一步支持了HspB8在蛋白酶体受损时也起作用的观点。事实上，从图5C和D以及补充材料，图S4即使存在MG132，大多数耐洗涤剂的高M.W.物种也被HspB8去除。有趣的是，当蛋白酶体被MG132抑制时，发现HspB8是一种抗氚的SDS可溶性形式(补充材料，图S4C). 这一观察的生物学意义尚待阐明。这些影响并不是由于HspB8诱导的细胞生长和存活的改变，因为细胞活性测试表明，过度表达HspB9和wt或突变SOD1的NSC34细胞没有变化(补充材料，图S5). 此外，数据还表明，HspB8过度表达有助于清除错误折叠的蛋白质，而不会从突变SOD1聚集体加工中产生神经毒性（寡聚/异构）物种。细胞存活率数据还排除了产生有害过程过度激活的代偿机制（即自噬细胞死亡/细胞自噬和凋亡机制，这两种机制均在神经退行性变中报告）。

HspB8对G93A-SOD1/NSC34细胞蛋白酶体活性的影响如图所示5D.在表达突变SOD1的NSC34细胞中，YFPu的积累被HspB8的当代表达完全抵消，在MG132的存在下，这种作用也很明显。因此，HspB8诱导的突变SOD1溶解度不会影响永生运动神经元中的蛋白酶体活性（这可能是由于要处理的错误折叠蛋白数量增加所致）。

因此，我们想评估HspB8对突变SOD1蛋白的作用是否由其伴侣性质特异性介导。为此，我们利用了两个HspB8突变体（K141N或K141E）的存在；这些HspB8突变体与HMN和/或CMT的发育有关(8,9)以伴侣活动显著减少为特征。我们在流式细胞荧光分析中使用GFP标记的G93A-SOD1初步评估了wt或突变HspB8s对突变SOD1总水平的影响。结果（图5E） 证明HspB8大大降低了GFP-G93A-SOD1的总水平(P（P）< 0.001). 当使用HspB8的K141E或K141N变异体时，突变GFP-G93A-SOD1的总水平保持不变，wtHspB9的作用消失(P（P）< 0.001). 为了证明伴侣活性特别针对易于聚集的错误折叠的SOD1形式，我们在过滤延迟测定中分析了相同的HspB8变体对被醋酸纤维素膜捕获的不溶性突变SOD1物种的影响。结果（图5F） 证明只有wtHspB8保持其伴侣活性，才能对抗永生化运动神经元中突变SOD1不溶性物种的形成；相反，在模拟转染的NSC34细胞和那些表达缺乏伴侣活性的HspB8 K141突变体的细胞中，存在相当水平的不溶性突变GFP-G93A-SOD1聚集体。这些数据有力地表明，从我们的永生化运动神经元NSC34细胞中去除突变的SOD1绝对需要HspB8伴侣活性。

HspB8通过激活自噬体-溶酶体途径诱导突变G93A-SOD1清除

由于HspB8依赖性地去除突变SOD1的不溶形式不需要功能性蛋白酶体，我们进一步分析了自噬系统是否可能是HspB9对ALS中错误折叠蛋白产生有益作用的细胞途径。事实上，有一致的分子证据表明APLP可以去除聚集的蛋白质(21)和HspB8在与Bag3相互作用后激活自噬(11,19,22,23,36). 因此，我们通过APLP评估了HspB8对错误折叠突变SOD1清除的影响(24). 最初，我们通过电子吸波分析NSC34细胞中HspB8激活APLP。在表达HspB8和G93A-SOD1的NSC34细胞的细胞质中（图6Aa–c）或wtSOD1(补充材料，图S6A–C)，我们检测到许多大小不同的小泡被双层膜包围，因此可以确定为自噬体，在没有HspB8的NSC34细胞中不存在。此外，ES tg G93A-SOD1小鼠腹侧脊髓的电子显微镜显示存在神经元内自噬体样囊泡（图6Ad和e），而agES tg wtSOD1小鼠的运动神经元仅含有lypofuscin(补充材料，图S6D和E). 这表明fALS小鼠存活的运动神经元可以激活自噬。

荧光显微镜(补充材料，图S7)表明HspB8过度表达大大加快了LC3的周转，正如绝大多数NSC34细胞（上部插图）中转染的GFP-LC3普遍减少所示。在较高分辨率下，表达HspB8且仍含有荧光的NSC34细胞显示出典型的强LC3点状分布，证明这种自噬标记物以LC3-II脂质亚型的形式与自噬体膜结合。相反，不表达HspB8的GFP-LC3细胞显示出更强烈但弥散的细胞质荧光分布，表明在这种情况下，自噬标记物是可溶性LC3-I非活性形式，不与自噬体膜结合。

为了量化HspB8对自噬的影响，并进一步表征APLP在ALS模型中的作用，我们采用了一种bafilomycin-synchronized APLP方案(24)通过流式细胞荧光分析，在有限的观察时间窗内测量LC3的周转。实验（图6B和C）在G93A-SOD1 NSC34细胞上进行的实验表明，HspB8仅在活性APLP的3 h内显著降低了细胞内LC3的水平。为了证明HspB8通过APLP系统发挥作用，我们对表达突变GFP-G93A-SOD1的NSC34细胞的细胞裂解液进行了过滤阻滞试验，并用APLP抑制剂巴非霉素处理（图6C） ●●●●。数据证实，即使在MG132存在的情况下，HspB8也诱导了总不溶物物种的急剧减少（约5-6倍）。结果表明，巴菲霉素可抵消HspB8诱导的对错误折叠突变SOD1蛋白形成的不溶物的清除。我们通过观察两种蛋白之间可能的相互作用，进一步研究了HspB8通过自噬激活突变SOD1降解的潜在机制。令人惊讶的是，使用抗SOD1抗体的免疫沉淀研究表明，在基础条件下，HspB8不会与SOD1直接相互作用(补充材料，图S8A). 在MG132处理的NSC34细胞中，SOD1酶与少量HspB8共同免疫沉淀(补充材料，图S8B). 这表明，泛素-蛋白酶体途径的扰动可能导致HspB8客户端蛋白的普遍积累被降解。

因此，我们推测，突变SOD1和HspB8之间缺乏相互作用可能是由于当其被HspB8s识别时，突变SOD1快速降解，因为HspB8-有效地靶向突变SOD1s进行自噬清除。显然，由于其性质，突变的SOD1/HspB8复合物的特征是半衰期很短，可以通过自噬快速去除。因此，我们推测自噬的阻断应诱导HspB8/SOD1复合物的积累。为此，我们采用了不同的实验范式，其中（i）我们使用3-MA阻断了自噬的启动，试图阻止HspB8/SOD1的分离和降解，（ii）我们允许自噬启动，但使用巴非霉素阻断了自吞噬体-溶酶体的完全激活。这可能允许HspB8释放突变SOD1，并将其插入自噬机制。获得的结果（图6D） 与我们的工作模式完全重叠。事实上，当3-MA通过药物阻断SOD1突变体的自噬介导清除时，我们能够检测到SOD1突变与HspB8的共同免疫沉淀。我们还包括Bag3、Hsc70和CHIP的免疫检测。事实上，最近已经证明，错误折叠的蛋白质被HspB8识别，然后插入到一个多异源复合物中，该复合物包括HspB8,Bag3，Hsc70和CHIP，允许p62识别目标蛋白并形成自噬体(25). 使用抗SOD1抗体对未经处理的3-MA-或巴非霉素处理的表达突变SOD1的NSC34神经元进行的免疫沉淀显示，当错误折叠的SOD1被识别并立即靶向自噬降解时，在基础条件下存在HspB8或Bag3的微弱条带。用3-MA阻断自噬可以阻止自噬体组装，错误折叠的突变SOD1不能插入自噬体内。错误折叠的SOD1未从细胞中清除，并与HspB8、Bag3、Hsc70和CHIP共同免疫沉淀在错误折叠的蛋白质插入自噬体所需的多异源复合物中。

巴非霉素阻断自噬并不能阻止自噬体的组装。在这些条件下，错误折叠的突变SOD1可以插入到自噬体中，并明显从HspB8/Bag3/Hsc70/CHIP复合物中释放出来。由于所有这些蛋白在3-MA阻止SOD1插入自噬体时与错误折叠的SOD1共免疫沉淀，运动神经元中的HspB8活性直接负责突变SOD1的自噬清除。由于HspB8的过度表达足以重新激活突变的SOD1自噬清除，因此在这种观点下，HspB9可能是整个降解途径的限制因素。

HspB8伴侣效应通过自噬帮助去除TDP-43不溶物和聚集物

最近，大多数sALS和一些fALS与TDP-43蛋白阳性内含物的存在有关(2,5); 已在ALS中发现TDP-43突变（主要是C末端）(4). 这些都是错义突变，但一个移码突变会产生一个提前终止密码子（p.Y374X），产生一个C末端截断的TDP-43蛋白(26,27). 在sALS患者的尸检样本中，内含物含有TDP-43 C末端(2)，但神经细胞培养物中N端和C端TDP-43片段聚集(28)可能参与触发异常蛋白质折叠(28,29). C末端将TDP-43保留在细胞核中，对溶解度和细胞定位至关重要，其缺失导致形成大的细胞核和细胞质聚集物(29). 利用该系统，我们评估了HspB8是否能够抵消因去除蛋白质C末端区域（ΔC TDP-43）而导致的TDP-43错误折叠和聚集。图中的结果7A显示全长TDP-43（FL TDP-43）的细胞内定位，与ΔC TDP-43相比。虽然FL TDP-43仅定位于细胞核中，但ΔC TDP-43存在于细胞核中(29,30)并聚集在细胞质中。HspB8没有改变FL TPD-43的行为，但它从细胞中完全去除了ΔC TDP-43，表明它可以激活异常ΔC TDP-43构象的降解。此外，ΔC TDP-43形成了在较高M.W.迁移的寡聚物物种，这些寡聚体物种几乎被HspB8表达完全移除（图7B） ●●●●。只有可忽略不计的截断单体蛋白残留。最后，过滤延迟分析表明，HspB8的过度表达也大大降低了不溶性ΔC TDP-43的总量。总的来说，这些数据表明，HspB8对不同类型ALS中涉及的ΔC TDP-43也具有活性。我们使用上述bafilomycin-synchronized APLP协议量化了HspB8对自噬的影响，以通过流式细胞荧光分析测量TDP-43 ALS模型中的LC3周转。数据（图7C） 显示HspB8仅在活性APLP的3小时内显著降低细胞内LC3水平。与突变SOD1的情况一样，过滤延迟分析表明，HspB8也通过APLP系统在TDP-43的情况下发挥作用。事实上，巴非霉素治疗抵消了HspB8诱导的不溶性物种清除，这些不溶性物质是由表达ΔC TDP-43的NSC34细胞的细胞裂解液中TDP-43蛋白的错误折叠片段形成的（图7D） ●●●●。

讨论

在本研究中，我们发现突变体G93A-SOD1聚集并损害以G93A-SOD1 NSC34细胞为代表的fALS运动神经元模型中的蛋白酶体系统。蛋白酶体损伤与伴侣蛋白HspB8表达增加相关。我们还发现，HspB8已经在PS tg G93A-SOD1小鼠的一些腰椎运动神经元中过度表达，这些神经元也表达高水平的突变SOD1。这种现象变得更加明显，涉及更多运动神经元和星形胶质细胞，疾病进展到ES。这与之前的二维免疫印迹结果一致，二维免疫印记显示，tg G93A-SOD1小鼠脊髓中部分泛素化的洗涤剂不溶性人SOD1逐渐增加，但不适用于wtSOD1小鼠(31). 因此，HspB8的表达模式与不溶性突变体SOD1的累进积累相关，可能是为了去除这些动物运动神经元细胞死亡的错误折叠蛋白。此外，通过分析HspB8对运动神经元细胞中突变SOD1生化特性的影响，我们发现HspB9几乎完全抵消了不溶性物种的形成，减少了突变SOD的聚集。HspB8伴侣活性还清除细胞中的单体突变SOD1，可能是通过细胞内降解系统协助其降解。值得注意的是，HspB8对wtSOD1降解的影响很小，因此这种伴侣只能选择性地识别错误折叠的构象。这一方面与SOD1相关的fALS特别相关；事实上，功能性SOD1酶的减少可能决定了细胞内对神经毒性自由基物种的保护缺失(6). 通过这种选择性机制，HspB8可以防止活性SOD1酶的损失，对运动神经元细胞产生第二种有益作用。有趣的是，HspB8诱导的突变体SOD1清除并不一定需要蛋白酶体的活性，因为突变SOD1的不溶物、聚集体和单体形式即使在蛋白酶体抑制期间也会被清除。因此，另一种降解途径必须负责通过HspB8去除突变的SOD1神经毒性物种。我们发现，在fALS的动物模型和细胞模型中，APLP系统在突变错误折叠的G93A-SOD1的存在下被激活，因为在这两种情况下，自噬体都是通过电子显微镜分析特别观察到的。这些数据与先前的观察结果非常一致，表明蛋白酶体和自噬都能清除突变的SOD1(32)，并提示自噬在SOD1相关的fALS小鼠中被激活(33,34). 在我们的研究中，我们证明了HspB8的表达不仅与突变体G93A-SOD1的蛋白酶体依赖性清除增加相关，而且与细胞内自噬体和自噬标记LC3的周转增加相关，自噬标志LC3在APLP激活后降解。HspB8还严重改变LC3的细胞内分布，从弥漫染色（可溶性LC3-I型）到典型的点状染色（脂质化LC3-II型，锚定在自噬体膜上以刺激其与溶酶体融合）。最后，我们证实了HspB8通过APLP发挥作用，因为APLP抑制剂bafilomycin可以抵消HspB8-诱导的突变SOD1不溶物降解。根据目前的结果，HspB8通过自噬激活突变SOD1清除的机制更加明确。一些数据表明，HspB8与Bag3形成稳定的复合物以刺激自噬(11,12). 值得注意的是，Bag3基因敲除小鼠出现肌肉萎缩(35)突变型Bag3与肌营养不良和周围神经病变有关(18). 这些发现表明，HspB8及其伴侣Bag3可能对运动神经元和肌肉细胞的存活起着重要作用。HspB8和Bag-3之间的相互作用域最近已被完全表征(36)HspB8靶向错误折叠的蛋白质进行自噬降解的途径在肌肉细胞中已被揭示(25). HspB8与Bag-3复合，随后招募Hsc70和CHIP；这种异聚物能够识别p62辅助的错误折叠蛋白并激活自噬(25). 有趣的是，已发现Hsc70在不同疾病阶段tg-fALS小鼠脊髓中洗涤剂不可溶部分的突变SOD1中高度富集(37). 最后，CHIP是HspB8/Bag3/Hsc70/CHIP的一个成分，是突变SOD1的一个众所周知的相互作用体(38). 还证明泛素化Hsc70通过与CHIP相互作用诱导突变SOD1降解(38).

用抗SOD1抗体在NSC34永生化运动神经元中进行免疫沉淀，并用3-MA阻断自噬体的形成，明确证明突变SOD1清除HspB8是通过自噬介导的。事实上，在基础条件下，只有少量的HspB8或Bag3与突变SOD1结合，当错误折叠的SOD1可能被识别并立即以自噬降解为目标时。事实上，通过自噬阻止错误折叠的突变体SOD1清除的自噬体组装的抑制，导致其在不仅含有HspB8，还含有Bag3、Hsc70和CHIP的多异质复合物中积累；这些蛋白质都是错误折叠的蛋白质插入自噬体所必需的(25). 因此，我们的数据强烈表明，HspB8作为整个系统的第一要素发挥着关键作用。这些补充数据为HspB8对突变SOD1的作用提供了分子解释，并加强了自噬流量减少可能是错误折叠蛋白质积累的原因的假设。因此，HspB8在运动神经元疾病中起着重要作用，因为自噬介导的降解系统（HspB8/Bag3/Hsc70/CHIP）的一种成分（HspB8）的简单过度表达似乎足以恢复活性过程。这种观点认为HspB8是该过程的限制因素。这些数据也可能解释为什么tg-ALS小鼠脊髓前角运动神经元过度表达HspB8；这可能是试图通过自噬或对蛋白酶体抑制的反应来消除神经毒性错误折叠的蛋白质。同样的机制也可能发生在星形胶质细胞中，星形胶质细胞在ES时也过度表达HspB8。

我们还发现，与之前的数据一致，缺乏C末端结构域（ΔC TDP-43）的TDP-43在细胞浆中定位错误(28,29)生成低聚物不溶形式。我们的数据表明，HspB8完全抵消了ΔC TDP-43寡聚物的形成，并大大减少了运动神经元中ΔC TDP-43不溶物的总量。即使在TDP-43的情况下，我们的数据也证明了HspB8活性是由自噬介导的。这些观察结果与数据一致，数据表明自噬参与基础TDP-43代谢；事实上，自噬抑制会增加TDP-43的积累，而雷帕霉素是mTOR（自噬调节中的关键蛋白）的抑制剂，可以恢复TDP-43核定位，阻止其细胞质积累(39). 在我们的研究中，APLP抑制导致HspB8介导的TDP-43不溶性物质降解的损失。

因此，HspB8伴侣蛋白的活性可能与在大多数散发性ALS病例、一些与SOD1突变无关的fALS以及额颞叶痴呆中TDP-43阳性聚集物中积累的几种神经毒性蛋白的降解有关(2,4,5). 对fALS或sALS相关基因的筛查表明，除其他外，sALS和SOD1相关fALS病例的尸检腰椎脊髓中HspB8的表达显著增加(40). 不幸的是，该研究没有考虑到HspB8 mRNA表达增加是否仅限于ALS患者的脊髓运动神经元。我们在tg G93A-SOD1小鼠脊髓中的免疫组织化学研究清楚地表明，运动神经元细胞中HspB8过度表达是对突变SOD1积累的反应。因此，动物模型和sALS患者数据都强烈支持这样的假设，即HspB8可能被激活，以响应运动神经元中突变错误折叠蛋白的异常行为，从而抵消其神经毒性。有趣的是，最近有报道称，缺乏伴侣活性的HspB8（K141N和K141E）突变体运动神经元在原代培养物中的表达与轴突变性有关(41)这种效应对脊髓运动神经元是特异性的。HspB8还可阻止含有突变型HspB5（α-β-晶体蛋白）的前淀粉样低聚物中间产物（淀粉样低聚物）的包涵体的形成，这种小Hsp可导致结蛋白相关心肌病（DRM）(42). 在这种情况下，HspB8显著改善表达突变型HspB5的R120G tg小鼠的心脏功能和存活率(43).

总的来说，这些结果表明，运动神经元中HspB8表达的药理调节可能对揭示fALS和sALS的分子机制具有重要意义。

材料和方法

材料和其他方法可在补充材料.

质粒

pCDNA3-wtSOD1和pCDNA3-G93A-SOD1表达wtSOD2和突变型G93A-SOD1(44). pECFP-wtSOD1和pECFP-G93A-SOD1表达带有青色荧光蛋白（CFP）标记的wt和突变人类SOD1(6). YFPu表达CL1标记的YFP，一种蛋白酶体活性报告蛋白(6,16). pEGFP-wtSOD1和pEGFP-G93A-SOD1表达绿色FP（GFP）标记的wt和突变的SOD1（参见补充材料详细信息）。pCNEO-cMyc-HspB8表达大鼠HspB8（来自加拿大J.Landry）(45). pCIHspB8-K141N和pCIHsp B8-K141 E表达HspB8，赖氨酸141分别变为天冬酰胺或谷氨酸（来自荷兰南卡罗来纳州）(10). pGL3-增强子和pRL-TK来自Promega（美国威斯康星州麦迪逊）；pCMVβ和pEGFP-N1来自Clontech实验室（美国加利福尼亚州山景城）。promB8是在我们的实验室中生成的，它包含由−3000/+523人类HspB8启动子区域控制的萤火虫荧光素酶cDNA（参见补充材料详细信息）。pFLAG-FL TDP-43和pFLAG-ΔC TDP-43表达FLAG-tagged wt全长人类TDP-43以及C末端截断形式（来自意大利E.Buratti）(29). pEGFP-LC3表达GFP标记的大鼠LC3（来自日本吉森县T.Yoshimori）(46).

细胞培养和转染

永生化运动神经元细胞系NSC34(14)如前所述，已常规维持并转染[Lipofectamin（Invitrogen）/转铁蛋白（Sigma）2:1](15).

NSC34稳定转染的细胞系（来自意大利M.T.Carr）表达myc标记的人类wtSOD1或G93A-SOD1，并按照Ferri等. (47).

动物

使用C57BL/6JOlaHsd（C57/G93A）遗传背景下的转基因SOD1G93A小鼠和相应的非tg同窝出生的小鼠。按照之前的描述对小鼠进行维护(48)并根据机构指南，符合国家（D.L.no.116，G.U.suppl.40，1992年2月18日，Circolare no.8，G.U.1994年7月14日）和国际法律和政策（EEC理事会指令86/609，OJ L 3581987年12月1日，12日；NIH实验室动物护理和使用指南，美国。国家研究委员会，1996年）。

为了评估疾病的分期，从14周龄开始，每周两次，由同一名操作员对小鼠进行握力和旋转性能缺陷测试。当小鼠握力首次受损时，就考虑了症状的出现。随后体重减轻。在运动功能障碍进展的症状前（PS，12周）、临床症状（CS，平均18周）和末期（ES，平均24-25周）处死小鼠。

小鼠脊髓切片的免疫组织化学

样品制备在补充材料。对以下小鼠进行了分析(n个=每个组和每个年龄3个）：非tg，转基因G93A-SOD1，在疾病进展的PS、CS、ES年龄的转基因wtSOD1，用作主要抗体：兔抗HspB8的多克隆抗体（来自加拿大J.Landry；稀释度1:200），小鼠单克隆抗人SOD1（MBL，日本；稀释度1:3000）和小鼠单克隆抗GFAP检测星形胶质细胞（Invitrogen，1:2500），二次生物素化抗血清（山羊抗兔和马抗鼠，Vector，1:200）和亲和素-生物素过氧化物酶复合物（ABC，Vectors）显示，使用二氨基联苯胺作为染色原。

对于免疫荧光，使用与不同荧光色素结合的二级抗体（山羊抗兔Alexa 488，Invitrogen，1:200；驴抗鼠CY3，Jackson，1:1400）来可视化HspB8、SOD1和GFAP，而生物素化番茄红用链霉亲和素RedX（Invitrogen）显示的凝集素（LEA，1:2000；Vector Laboratories）检测小胶质细胞。使用配备75 mW Kripton/Argon混合气体激光器的TCS-NT共焦激光扫描显微镜（德国海德堡莱卡激光技术股份有限公司）对样品进行分析。

未经初级抗血清处理的对照切片未进行免疫染色。

NSC34细胞的荧光、免疫荧光和显微镜观察

样品制备在补充材料.分析SOD1s、TDP-43s、HspB8和泛素[一级抗体：小鼠单克隆抗FLAG（Sigma），牛奶中1:200，兔多克隆抗HspB8]抗体，牛奶中1:100，小鼠单克隆抗体ub（Santa Cruz），牛奶里1:200；二级抗体：Alexa 488抗兔，Alexa 48抗小鼠和Alexa 594抗小鼠（Invitrogen），奶中1:1000]使用Axiovert 200显微镜（德国奥伯科钦蔡司研究所）和光度CoolSnap CCD相机（美国新泽西州特伦顿Ropper Scientific）。使用Metamorph软件（Universal Imaging，Downingtown，PA，USA）处理图像。

Western blot分析和过滤迟滞试验

如前所述进行了蛋白质印迹分析(6)详细信息总结于补充材料使用了以下一级和二级抗体：（i）YFPu，小鼠单克隆抗GFP（Zymed，San Francisco，CA，USA；牛奶中1:1000）；（ii）对于SOD1，兔多克隆抗Cu/Zn超氧化物歧化酶SOD1（SOD-100；分析设计；牛奶中1:1000）；（iii）对于TDP-43，小鼠单克隆抗FLAG（Sigma；牛奶中1:1000）；（iv）对于肌动蛋白，山羊多克隆抗肌动蛋白（肌动蛋白I-19；圣克鲁斯；牛奶中1-1000）；（v） 兔抗HspB8多克隆抗体（来自J.Landry；牛奶中1:1000）或（vi）小鼠单克隆c-Myc（9E10）（圣克鲁斯；牛奶中1:1000）；（vii）对于GFP-SOD1s，过氧化物酶标记的山羊抗-GFP（载体实验室；TBS-T中1:5000）；（ix）泛素的小鼠单克隆抗-ub（Santa Cruz；牛奶中1:1000）；山羊抗兔、山羊抗鼠和驴抗山羊过氧化物酶结合二级抗体（Santa Cruz；TBS-T中1:5000）。

如前所述，在0.2µm醋酸纤维素膜（德国达塞尔沃特曼）上进行过滤延迟试验(6)详细信息总结如下补充材料。按照西方印迹法所述，对槽印迹进行了探测。使用NIH ImageJ软件分析斑点的光学强度。

mRNA表达分析

如前所述，进行了RT-PCR和实时PCR(49–51)详细信息总结于补充材料根据伦理批准的方案，从小鼠的腰椎脊髓中获取总RNA。对每个样本进行重复分析，然后用GAPDH的值对HspB8值进行归一化。

免疫沉淀分析

样品制备在补充材料用于识别SOD1、HspB8和其他蛋白质的多异质复合物的抗体如下：抗Cu/Zn超氧化物歧化酶SOD1（SOD-100；分析设计）免疫沉淀和免疫印迹检测SOD1的兔多克隆抗体，抗c-myc（9E10；Santa Cruz）小鼠单克隆抗体识别转染的HspB8、抗Bag3（Abcam）兔多克隆抗体、抗Hsc70（Stressgen）兔多抗体、抗CHIP（Calbiochem）兔多克隆抗体。

转录活性

如前所述进行了转录活动(20)使用Perkin Elmer（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）生产的LucLite试剂盒，并用β-半乳糖苷酶分析或双荧光素酶分析系统（Promega）进行标准化（参见补充材料详细信息）。

细胞荧光分析

对GFP-LC3或GFP-G93A-SOD1转染的NSC34细胞进行细胞荧光分析（参见补充材料详细信息）。使用FACS Calibur（BD Pharmigen）检测GFP荧光，并使用CellQuest（BD Pharmigen）软件分析结果。

统计分析

使用单尾Student’s进行统计分析t吨-使用PRISM软件（GraphPad，加州圣地亚哥，美国）对两组比较进行测试，对三组或更多组比较进行单向方差分析。

补充材料

HMG在线提供补充材料。

基金

这项工作得到了意大利Telethon的支持（向A.P.、C.B.、S.D.B.授予编号为GGP0663的拨款，并向A.P..授予编号GGP07063的拨款）；意大利大学和研究部；意大利劳工、卫生和社会事务部（向A.P.和conventzione Fondazione Mondino/UNIMI授予2007-36号赠款；向A.P.2008年-15号赠款）；米兰大学（Universita’degli Studi di Milano）和卡里普洛基金会（授予A.P.第2008-2307号）；Thierry Latran基金会，法国（2009年至A.P.）。共焦显微镜是在米兰大学的Interdipartitmentale di Microscopia Avanzata中心（CIMA）进行的。

致谢

我们感谢N.R.Cashman（加拿大安大略省多伦多大学桑尼布鲁克分校神经退行性疾病研究中心医学系和女子学院健康科学中心）提供的NSC34细胞，感谢Maria Teresa Carr（意大利罗马大学托尔韦加塔分校）提供的稳定转染的SOD1_NSC34细胞系，感谢J。Landry（加拿大拉瓦尔大学癌症研究中心）检测pCNEO-cMyc-HspB8和抗HspB8抗体，T.Yoshimori（日本大阪大学微生物疾病研究所细胞调控系）检测pEGFP-LC3，E。针对pFLAG-FL TDP-43和pFLAG-ΔC TDP-43的Buratti（意大利的里雅斯特帕德里西亚诺科学园区国际基因工程和生物技术中心）。

利益冲突声明。未声明。

参考文献