葫芦素B和威瑟酮新组合诱导肿瘤细胞衰老的分子机制和治疗潜力

摘要

癌症是一种不受控制的增殖综合征，使用与严重不良反应相关的合成化疗药物进行治疗。为了应对全球癌症发病率呈指数级增长的情况，开发和应用新的天然化合物是必要的。将对癌细胞的选择性毒性作为优先标准，我们开发了葫芦素B和威瑟酮的组合，并利用非小细胞肺癌细胞分析了其抗癌潜力。我们证明，被称为CucWi-N的组合对癌细胞的选择性细胞毒性是通过诱导细胞衰老介导的，其特征是拉明A/C、CDK2、CDK4、细胞周期蛋白D、细胞周期素E、磷酸化RB、莫特林的减少以及p53和CARF蛋白的增加。它阻碍了癌细胞迁移，而癌细胞迁移是由莫他林、hnRNP-K、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶2和纤维连接蛋白的减少介导的。我们提供生物信息学分子动力学和实验数据支持CucWi-N（i）具有高能力靶向莫特林–p53相互作用和hnRNP-K蛋白，（ii）触发复制衰老并抑制癌细胞的转移潜能，以及（iii）抑制肿瘤进展和转移体内试验。我们认为CucWi-N是一种潜在的天然抗癌药物，值得进一步的机理和临床研究。

正常细胞在培养中只分裂有限的次数。与之形成鲜明对比的是，癌细胞最一贯的定义是其持续增殖。它们通常对压力和DNA损伤导致的生长停滞不敏感，而这些在正常细胞中受到严格控制。在分子水平上，一种或多种抑癌蛋白的失活和多种致癌信号的激活与致癌有关。恶性转化和转移癌细胞的蛋白质富集，包括基质金属蛋白酶、波形蛋白、血管内皮生长因子、莫特林和hnRNP-K(1–8)使肿瘤抑制因子失活并激活致癌信号传导。拉明A和C在癌细胞中经常上调，并负责核强度和增强DNA修复(9)受MRN（MRE11–RAD50–NBS1）综合体安全监管(10). 拉明A和MRN复合蛋白的耗竭已被证明会导致癌细胞衰老样生长停滞(11–13)并预测为癌症治疗的潜在靶点。

葫芦素B（19-（10→9β）-abeo-10-lanost-5-ene三萜/Cuc）是一种甾体生物活性物质，具有独特的苦味和细胞毒性，广泛存在于葫芦科植物中。尽管公认具有强大的抗癌特性(14)，在体内分析。美国食品和药物管理局1955年的一份报告、1983年的后续报告以及其他几项评估报告显示，动物体内过量摄入Cuc会导致腹部痉挛、腹泻、晕厥、急性肺水肿和呼吸异常(14). 威瑟酮（6,7-环氧-5,17-二羟基-1-氧代硅氧烷-2,24-二烯内酯/Wi-N），a C₆，C₇-环氧甾体内酯是桑尼氏威萨尼亚(15). 研究表明，通过消除莫他林（一种hsp70应激伴侣）与p53的相互作用，以及诱导p53介导的癌细胞生长停滞或凋亡，可以对癌细胞产生选择性毒性(16). 研究提倡Wi-N具有抗炎和抗应激的潜力(17，18). 它还延缓了正常细胞中应激诱导的过早复制衰老(19)，保护脑源性细胞免受氧化和谷氨酸应激(20)发现东莨菪碱诱导小鼠模型记忆丧失的恢复(21). 当与Wi-N联合使用时，维他福林A在正常细胞中的毒性降低，但在癌细胞中保留抗癌潜力(22).

在本研究中，我们配制了葫芦素B和威瑟酮（CucWi-N）的组合，并获得了一种对癌细胞具有选择性毒性以及强大的抗肿瘤和抗迁移活性的组合。生物信息学分析表明，CucWi-N对莫他林以及hnRNP-K蛋白的亲和力更高，也得到了细胞和分子分析的支持。我们报道，CucWi-N通过靶向参与增殖和迁移的蛋白质选择性地诱导癌细胞的复制衰老，并很好地转化为有效抑制肿瘤生长和转移体内.

材料和方法

细胞、试剂和细胞毒性试验

电池（A549和TIG-3）和所有试剂的详细信息见补充图1Cuc、Wi-N和CucWi-N的细胞毒性通过MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵）测定法（M6494；生命技术公司），使用96-well板和M200 Pro微孔板分光光度计（Tecan Group Ltd.，Mannedorf，Switzerland）进行测定。与对照组相比，以百分比计算细胞存活率。细胞用0.5%结晶紫染色2小时。将平板清洗、干燥，并在显微镜下观察。对于克隆形成性，细胞（5×10²每孔）在6孔细胞培养皿中形成菌落约15天，每隔一天定期更换对照或CucWi-N培养基。

免疫印迹法

收集对照组和处理过的细胞，并将其放在RIPA裂解缓冲液（89900；Thermo Fisher Scientific）中进行裂解，该缓冲液中含有完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（4693159001；罗氏应用科学公司），置于冰上45分钟。使用Mini-PROTEAN Tetra cell设备（Bio-Rad，Hercules，CA）在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质裂解物，并通过Mini-Trans-Blot电泳转移细胞（Bio-Rad）转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore，Bedford，MA）上。如前所述，对所示抗体进行免疫印迹(16，22).

免疫染色

电池（2.5×10⁴在放置在12孔板中的盖玻片上，放置一夜，然后在对照或补充CucWi-N的培养基中培养。将细胞在甲醇和丙酮（1:1）的冰上固定5分钟，并使用前面描述的方法用指示的抗体进行免疫染色(16，22).

流式细胞术

电池（2×10⁵通过血清饥饿（72-96小时）同步化，然后在对照或补充CucWi-N的培养基中培养48小时。胰蛋白酶化细胞（2×10⁵)计数，洗涤两次，并重悬于300µL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。缓慢添加700μL冰镇100%乙醇并轻轻旋涡固定细胞。固定细胞颗粒在−20°C中培养过夜，以2000 rpm离心，用PBS洗涤并离心。通过在37°C下与100µg/mL RNA酶（EN0531；Thermo Fisher Scientific）孵育90分钟，RNA被降解。悬浮液以2000 rpm离心7分钟，再悬浮在200μL Guava细胞周期试剂（4500-0220；Millipore）中，在室温下黑暗中孵育30分钟，在1-2 mL PBS中稀释，然后在Guava PCA-96系统上进行数据采集和细胞周期分析。

衰老检测

细胞被镀并放置过夜，然后用CucWi-N处理。48–72小时后，按照制造商的方案（CS0030，Sigma-Aldrich）清洗、固定细胞，并对其进行衰老相关β-半乳糖苷酶染色。A549细胞在CucWi-N（低剂量）补充的培养基中以1:16的分裂比连续传代。收集细胞进行Western blotting、逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR），并在指定的传代进行免疫染色，并在-80℃下冷冻^o个C用于后续实验。细胞接受5µM阿霉素（D1515，Sigma-Aldrich）治疗1-2小时，以诱导衰老（作为阳性对照）。

Mortalin酶联免疫吸附试验

将蛋白裂解物（100µg）在室温下培养于96-well板（3632；Corning）中过夜，该板预先涂有涂层缓冲液（421701；BioLegend）和稀释缓冲液（DB）（421203；BioRegend）中的抗莫特林多克隆抗体（100 ng/mL）。用0.05%吐温20在PBS（WB）中清洗微孔，每次3×1分钟，并用抗莫特林单克隆抗体（100 ng/mL）在DB中重新加载。在室温下孵育平板过夜，然后分别清洗三次，每次1分钟，并在室温下用二级辣根过氧化物酶抗体（100 ng/mL）（31430；Thermo Fisher Scientific）在DB中孵育3小时。将平板清洗三次（每次×1分钟），然后与3,3′，5,5′-四甲基联苯胺底物（421101；BioLegend）孵育30分钟。添加停止溶液（423001；BioLegend），并使用分光光度计在450 nm处测量光密度。以DB中的重组莫特林蛋白为标准。使用标准斜率方程计算对照组的砂浆蛋白浓度，并绘制对照组的图表。

伤口划痕分析

A549电池（1.5×10⁵每个孔）被镀在6孔板中，并允许过夜沉淀。使用无菌移液管尖端（200µL）进行线性划痕，以模拟无细胞区域。细胞在对照或补充CucWi-N的培养基中培养。在显微镜下监测细胞向划痕区域的移动。每24小时拍摄一次划痕细胞和迁移细胞的照片。

侵袭试验

使用BioCoat基质凝胶侵入试剂盒（3-354480；Corning）进行侵入测定。A549电池（5×10⁴每孔）悬浮在0.5 mL无血清Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM）中，将其置于侵入物的顶部，并在24孔板的底部填充0.75 mL补充10%胎牛血清的DMEM。48小时后，将插入物转移到新鲜平板上，并用PBS清洗三次。将悬浮在每个插入物底部Matrigel基底膜基质中的细胞固定在甲醇：丙酮（1:1）中，用0.5%结晶紫染色过夜，然后用超纯水清洗以去除多余的污渍。将插入物风干，在显微镜下观察并拍照。

逆转录聚合酶链反应

用Trizol（15596018；Ambion）溶解对照或CucWi-N处理的细胞5分钟，在氯仿（038-02606；Wako）中培养5分钟，并在室温下以12000 rpm离心15分钟。将清澈上清液转移到新鲜小瓶中，在室温下用异丙醇（166–04836；Wako）清洗10分钟，然后以12000 rpm离心15分钟。提取颗粒，在70%冰镇乙醇中再次悬浮，在8000 rpm下离心5分钟两次，然后空气干燥并在无核水中再次悬浮以形成RNA。按照制造商的说明，使用逆转录试剂盒（205313；Qiagen）制备互补DNA。通过将1µL互补DNA与0.1µL Ex-Taq（RR001，Takara）、2µL 10×Taq缓冲液、2¦µL dNTP和1¦ΜL正向和反向引物（如前所示）分别混合在12.9µL无核酸水中，制备用于扩增的主混合物，并使用“变性95°C，10分钟→放大95℃，45秒60℃，1分钟72℃，45秒钟（32–40个循环）→退火72℃，10分钟→4℃”协议。将扩增产物在含有0.0625µg/mL溴化乙锭（15585-011；Invitrogen）的1%琼脂糖凝胶上分离，并使用配备有电荷耦合设备相机的Lumino图像分析仪（LAS3000 mini；富士胶片，日本东京）获取。

生物信息学

Cuc和Wi-N与莫他林、p53和hnRNP-K的结合研究如下：

对接研究中蛋白质和配体结构的制备：对接研究中使用的所有蛋白质结构均取自蛋白质数据库mothlin（PDB ID:4KBO）、p53（PDB ID:4MZR）和hnRNP-K的KH3结构域（PDB ID:1ZZI）。这些结构是使用Schrödinger的蛋白质制备向导为对接研究准备的(23). 制备步骤包括添加氢原子、去除不良接触、优化键长、创建二硫键、封盖蛋白质末端、将硒代蛋氨酸转化为蛋氨酸残基、使用质体构建缺失氨基酸和缺失侧链(24)和能量最小化。

从PubChem获得的Wi-N（CID:21679027）和Cuc（CID:5281316）准备好使用LigPrep进行对接(25). 它产生小分子的不同互变异构体、立体化学和电离变体，然后是能量最小化和灵活过滤。

蛋白质分子与天然化合物的对接：使用Glide的超精密对接协议，靶向莫特林中的p53结合位点（253–282个氨基酸）、p53的莫特林结合位点（323–337个氨基酸）和包含KH3结构域的hnRNP-K残基与小分子对接(26). 使用LigPlus程序研究了蛋白质-配体复合物之间的分子相互作用(27).

评估对接复合体的稳定性：使用Desmond中的默认参数模拟所有对接复合体(28). 将配合物溶解在TIP3水的三斜周期盒中，并用适当数量的反离子进行中和。然后使用最陡下降法将制备的系统进行能量最小化。平衡后，用周期性边界条件和OPLS3力场模拟每个蛋白质-配体复合物50 ns。在整个模拟轨迹中，蛋白质主链和配体相对于第一帧的稳定RMSD曲线被用作评估对接复合物稳定性的一个指标。

动物研究

从NihonClea购买Athymic balb/c裸鼠雌性小鼠（4周龄），并驯化2周。他们被保持在用水消毒的小动物立方体饮食中。分别用两种载体（0.1%羧甲基纤维素）对动物进行口服预处理(N个=6）或使用补充CucWi-N的载体（Cuc1+Wi-N 10 mg/kg BW）(N个=5）使用啮齿动物喂食管每隔一天在200µL悬浮液中放置一周。A549电池（5×10⁶在150µL PBS中）经皮下注射（用于皮下异种移植）于左右两侧（腹部），并通过尾静脉注射静脉注射（用于肺转移）。在异种移植瘤芽出现后，小鼠每周定期喂食三次，持续8周（共27次剂量）。定期监测肿瘤，并用游标卡尺测量肿瘤大小。肿瘤体积（V）的计算公式为V=（L×W²)/2用卡尺测量长度（L）和宽度（W）。在肿瘤生长到约1.5厘米长之前，通过颈部脱位杀死小鼠，并检查内部肿瘤和肺转移。将切除的肿瘤放在裂解缓冲液中进行蛋白质分析和溶血分析。用DB（0.85%NaCl，含10 mM CaCl）稀释从健康小鼠心脏提取的血液₂)通过轻轻移液获得2%的红细胞悬液（150μL），与CucWi-N（Cuc1+Wi-N 50µM，在100%二甲基亚砜中）（75μL）孵育。将混合物在室温下培养1小时，然后在室温下以16000 rpm离心5分钟。将上清液（200μL）装入96 well板孔中，以读取540 nm处的吸光度。吸光度比与溶血程度相对应。以DB中Triton X-100（0.2%）为阳性对照。按照制造商的说明，分别使用过氧化氢酶检测试剂盒（707002；Cayman Chemical）和硫代巴比妥酸反应物比色微孔板检测试剂盒，测量血浆中的抗氧化酶（过氧化氢酶）活性和丙二醛水平（FR40，Oxford Biomedical Research）。本研究严格按照日本国家先进工业科学技术研究所（AIST）安全与环境管理部动物实验委员会的建议（实验计划批准号：2012-025）进行。

统计分析

所有计算都是使用Microsoft Office完成的。统计显著性通过未配对计算t吨使用平均值测试GraphPad软件（2017），标准偏差、和N个来自三个独立的实验，并显示为*第页< .05,^**第页< .01,^***第页< .001.

结果

Cuc在人类癌细胞（A549）和正常细胞（TIG-3）中的剂量依赖性毒性试验显示其对后者具有较高的细胞毒性(图1A). 然而，在短期（48小时）细胞毒性试验中，Wi-N在2.5至10µM的剂量下对两种细胞类型均无毒性。接下来，我们尝试了两种化合物的各种组合，发现比例为1:500的Cuc:Wi-N对癌症的细胞毒性比正常细胞更强(图1B). 低剂量（Cuc=0.005µM，Wi-N=2.5µM）、中剂量（Cuc=0.01µM、Wi-N=5µM。这些剂量对正常细胞几乎无毒（>90%细胞存活率）。我们选择了这三种剂量(图1C)通过生化、分子和成像分析，分析其抗癌活性的机制。在细胞活性测定以及对对照细胞和处理细胞（低、中、48小时）的直接观察中，在癌症中观察到了剂量依赖性的应激形态（纺锤形扁平细胞和大细胞），但在正常细胞中没有观察到(图1D). CucWi-N处理的癌细胞也表现出剂量依赖性的克隆原性抑制(图1E). 值得注意的是，在短期（48小时）分析中，低剂量仅导致20%的存活率下降，导致菌落形成效率（10天）显著降低（80%）。与这些数据一致，生长分析显示，与正常细胞相比，持续治疗3天以上的低剂量CucWi-N对癌细胞增殖的抑制更为明显(图1F).

对癌症和正常细胞对高剂量CucWi-N的生长和凋亡信号的分子分析显示，癌细胞中CDK2、CDK4、Cyclin D1和Cycline E下调。另一方面，正常细胞显示这些蛋白质中的大多数都增加了(图2A和B类)这表明癌细胞中的选择性生长阻滞是通过下调参与细胞周期进程的蛋白质介导的。对照组和治疗组细胞的凋亡蛋白无明显变化。细胞周期分析表明，CucWi-N导致癌细胞S期阻滞(图2C). 用高剂量CucWi-N处理4或24小时后，细胞的显微镜观察显示，早在处理4小时后，核膜发生变化，不规则形态变平(图2D). 我们预计这种变化可能由拉明A/C的变化介导。用拉明A/C特异性抗体对细胞进行免疫染色，发现其在癌症中表达下调，但在正常细胞中表达下调的时间在4–24小时内不明显(图2D). 我们还用特异性引物对对照细胞和处理细胞中的层粘连蛋白（A/C、B1和B2）进行了RT-PCR，结果显示，CucWi-N处理的癌细胞（而非正常细胞）中的层黏连蛋白A/C、A1和B2信使RNA（mRNA）减少。后者显示层粘连蛋白表达小幅但显著增加(补充图2).

根据早期数据，我们预测CucWi-N可能会诱导癌细胞的复制性衰老。在A549细胞中48小时的CucWi-N处理导致衰老相关的β-半乳糖苷酶染色细胞以剂量依赖性的方式出现(补充图3A). 为了研究，在连续培养体系中用低剂量的CucWi-N处理癌细胞。如所示图2E与对照细胞相比，处理后的细胞生长缓慢，在大约18天内生长明显，随后增殖逐渐下降，直到细胞在大约60天内停止分裂(图2E). 分子分析表明，生长缓慢停滞与蛋白质（pRB）的逐渐下调有关^磷（hnRNP-K和莫他林）严重参与癌细胞的细胞周期进展和持续增殖。此外，指示细胞周期停滞和衰老诱导的蛋白质（p16^{INK4A（墨水）})参与DNA损伤信号传导和生长停滞的细胞（CARF和p53）上调(图2F和G公司，补充图3B). 对照组和治疗组细胞pRB和p53的mRNA分析显示pRB（pRB）和小幅增长第53页在处理过的细胞中(补充图4)和与衰老相关β-半乳糖苷酶和p16增加所确定的后者衰老诱导相一致^{INK4A（墨水）}(补充图3). MRN复合物的增加也支持DNA损伤信号的诱导和生长停滞(图2H). 接下来，我们利用阿霉素诱导的衰老模型，确定CucWi-N诱导的癌细胞选择性生长停滞是否由该轴介导。值得注意的是，CucWi-N处理的癌细胞显示MRN复合物的部分消除；其衰老衍生物MRE11和RAD50轻度下降；NBS1未显示任何变化(图2H)提示CucWi-N诱导的癌细胞选择性生长停滞可能通过下调复合物的一个或多个成员介导。

接下来，我们通过伤口抓伤和细胞侵袭实验检查了控制和处理细胞的迁移能力。CucWi-N处理的癌细胞显示出剂量依赖性的迁移和侵袭抑制(图3A和B类). 对参与这些表型的蛋白质（莫特林、hnRNP-K、血管内皮生长因子、波形蛋白、基质金属蛋白酶2和纤维连接蛋白）的表达分析表明，CucWi-N诱导的减少。值得注意的是，高剂量和低剂量处理的细胞都显示出这些蛋白表达的显著下调(图3C和三维). 此外，可以看到莫特林的染色模式从核周（典型的癌细胞）转移到全血细胞浆（典型的正常细胞），并表示衰老诱导(29，30).

鉴于早期的报告，Wi-N通过消除莫特林-p53复合物和重新激活p53蛋白来激活癌细胞的生长抑制信号(31)，我们目前研究了Cuc是否可以以类似的方式发挥作用。分子动力学分析表明，它可以在Thr267和Gly269处与莫他林结合（结合能为−4.212 kCal/mol），参与莫他林与p53的相互作用(图4A和C类). 有趣的是，与莫特林结合的MKT-077被用作阳性对照，并显示出较低的结合能（−2.042 kCal/mol），这表明Cuc可能是一种更好的莫特林抑制剂(图4C). 接下来我们研究了Cuc与p53的结合。虽然它与p53残基Thr118和Lys321有相互作用，但未观察到与p53的莫特林结合域（残基323–337）的相互作用(图4B). 这些数据表明，CucWi-N活性的增强可能涉及其他机制。接下来，我们使用hnRNP-K作为目标分子，对Cuc和Wi-N进行分子对接分析(图4D和E类). Cuc和Wi-N的单独结合显示出相当的能量（分别为−2.93和−2.34 kCal/mol）(图4C). 这两种化合物（Cuc和Wi-N）都结合到hnRNP-K蛋白KH3结构域中的单链DNA结合位点(图4F). 然后我们将两个分子（Cuc和Wi-N）放在一起进行分子对接分析。有趣的是，我们发现Cuc与hnRNP-K–Wi-N络合物的结合效率是Wi-N与hnRNP-K–Cuc络合物结合效率的两倍（−4.69 kCal/mol）（结合能−2.62 kCal/mols）(图4C). 在对三链络合物（Cuc:Wi-N:hnRNPK）进行50 ns长的模拟过程中，除了稳定对接的Wi-N外，涉及hnRNP-K的Cuc和Lys87残基的一个氢键在整个过程中都是稳定的，这表明络合物的高度稳定性(图4F，补充图5). 共有八个氢键（在Cuc:Asp23、Lys87、Ser85和Wi-N:Lys22、Arg59残基处）在模拟过程中瞬时形成，有助于其最大的结构稳定性。简而言之，Wi-N绑定到hnRNP-K使Cuc更容易访问口袋。分子对接分析数据表明，CucWi-N可能通过联合靶向莫他林和hnRNP-K蛋白，对癌细胞增殖和迁移信号产生更强的失活作用。接下来，我们研究了这些蛋白质在用单个化合物或其组合处理的细胞中的亚细胞定位和表达水平。如所示图4G和H（H）CucWi-N处理的细胞比Cuc或Wi-N单独处理的细胞表现出更强的莫他林和hnRNP-K的下调作用。RT-PCR显示灰泥信使核糖核酸(补充图6).

在裸鼠皮下异种移植瘤进展模型中，喂食CucWi-N 9周的动物显示皮下肿瘤抑制(图5A和B类). 他们还显示肺内转移病灶减少(图5C)，血液总丙二醛水平降低(图5D)和过氧化氢酶活性增加(图5D)共同倡导CucWi-N的抗癌、抗转移和抗氧化作用。它既没有引起体重减轻或毒性，也没有引起血液溶血，表明它是安全的(图5B和E类). 对来自对照组和治疗组动物的皮下肿瘤进行蛋白质分析。如所示图5F，并符合在体外数据显示，我们观察到负责癌细胞迁移、侵袭、存活和应激信号传导的关键蛋白持续下调(图5F)认可CucWi-N的癌症治疗潜力。

讨论

致癌过程包括随着时间的推移发生离散的分子变化，导致细胞和组织的异常生长，随后侵袭邻近和远处的部位。尽管过去二十年来，癌症诊断和治疗取得了显著进展，但癌症死亡率呈指数级增长，预计到未来十年将翻一番。所有癌症都是由快速分裂的癌细胞组成的，这些癌细胞失去了分化特征，容易受到结构变化和损伤的影响。这些特性经常被用作抗癌药物发现和验证的分析系统。传统的合成化疗药物价格昂贵，会产生多种不良反应和耐药性，因此需要不断开发低毒、经济的抗癌药物。大量草药中的活性抗癌成分已被鉴定(32); 这些生物活性物质的协同治疗通过各种机制减少了癌症的发展和/或进展(14). 我们最近发现，白头翁根提取物具有抗癌潜力山芝麻及其生物活性Cuc(30). 后者已在其他几项研究中得到承认(14). 不幸的是，它引起了急性毒性体内对正常细胞也有毒性在体外(30). 为了选择性地募集Cuc对癌细胞的细胞毒性潜力，我们设计了其与Wi-N的混合物，该混合物已被证明对正常细胞的毒性可忽略不计(16，33，34). 它还显示出对正常细胞有副作用（防止氧化和化学应激，延长寿命）(19). Wi-N与Withaferin A联合应用已被证明对癌细胞具有选择性毒性，并具有抑制肿瘤生长和转移的治疗潜力体内(22). 据此，我们开发了CucWi-N（Cuc和Wi-N的摩尔比为1:500），并发现其具有显著的抗癌活性。对于正常细胞来说，这是相对安全的。剂量反应数据表明，即使是低剂量的CucWi-N也能抑制癌细胞的克隆形成和增殖。癌症患者的效果明显强于正常细胞(图1)，得到了分子数据的支持，包括癌细胞中CDK2/4和CyclinD1/E的选择性下调导致S期阻滞(图2). 显微镜下观察对照组和CucWi-N处理的细胞，后者表现为受力和扁平形态；早在4小时时就观察到核膜的变化，与早期报告一致(35). 此外，我们发现CucWi-N处理的正常细胞表现出应激表型的恢复。如早期研究所述，这可能归因于Wi-N(19，20).

鉴于核膜中观察到的变化，我们预测并验证了CucWi-N治疗会导致层粘连病（层粘连依赖性核介导的细胞形态学破坏）(9，36)癌细胞中的选择性(图2). 此外，通过低剂量亚毒性的癌细胞连续传代，我们证明CucWi-N可导致复制性衰老(图2)-椎板病的预期结果(37). pRB的逐渐下调支持了CucWi-N诱导的癌细胞衰老^磷、hnRNP-K和莫他林，以及CARF、p53和p16的激活。pRB磷酸化及其从pRB–E2F复合物中释放对细胞周期进展至关重要(14). hnRNP-K是一种富含分裂和迁移细胞的多功能蛋白，与癌细胞的增殖和迁移能力有关(2，三). 莫他林是一种应激伴侣，与癌细胞的增殖和抗凋亡特性有关。总的来说，pRB下降^磷、hnRNP-K和mothalin的表达表明，CucWi-N治疗后，癌细胞的增殖和细胞周期阻滞减少。此外，莫特林染色模式从核周（癌细胞的特征）转变为全血细胞质（正常细胞的特点）支持衰老的诱导(4，7，29). p53（肿瘤抑制因子）和CARF蛋白的增加进一步支持了这一数据，这些蛋白已被确定为调节应激、衰老和生长停滞的细胞内蛋白标志物(38，39)在复制性衰老开始时被上调。RT-PCR分析显示，在CucWi-N处理的癌细胞中，Lamin减少，p53增加。另一方面，mothalin mRNA无变化，pRB下降，表明这些蛋白在蛋白水平上优先受影响，以执行CucWi-N诱导的癌细胞衰老。

一些研究报告了MRN复合体（由MRE11、Rad50和NBS1蛋白组成）在基因组稳定性、DNA修复机制和衰老诱导中的关键作用(10). 其抑制导致对DNA损伤无反应，逐渐导致衰老(40). MRE11是端粒酶阳性细胞DNA修复机制的核心；其缺失与端粒损伤和核酸酶功能缺陷有关(41). NBS1在端粒交替延长机制中起着关键作用，端粒维持和癌细胞永生。NBS1基因敲除导致DNA损伤反应受损，双链DNA断裂累积，加速衰老(42). 值得注意的是，虽然MRE11已被证明在端粒酶为基础的永生中发挥关键作用，但NBS1被证明在交替延长端粒机制中起核心作用。我们发现CucWi-N处理可显著抑制癌细胞中的MRE11和NBS1(图2D)这表明它可能对端粒酶阳性和端粒细胞交替延长都有效。此外，阿霉素诱导的衰老细胞中的这些变化不如癌细胞中的明显，这归因于后者选择性诱导衰老。

层蛋白A/C、B1和B2蛋白在核膜中形成网络结构，在核结构的组织和包括hnRNP-K和mortalin在内的分子的核质转运中起着基本作用(43). 研究表明，椎板的缺陷会导致椎板病，如传导性心脏营养不良和脂肪营养不良(44). MKT-077是一种莫特林抑制剂，通过PARP和Lamin a的裂解介导，可导致广泛的caspase依赖性凋亡细胞死亡(45). 福斯特和同事(46)结果表明，层粘连蛋白A的缺失导致了mortalin的交联和折叠，这有利于动态肌动蛋白丝的形成，而不是应力纤维。根据这一信息，提示CucWi-N介导的莫他林、hnRNP-K和Lamin A/C的减少可能是相互关联的。

Cuc和Wi-N与莫特林、p53和hnRNP-K的分子对接分析表明，虽然Cuc对莫特林蛋白有很强的亲和力，并在其p53结合位点内形成稳定的氢键，但在p53蛋白的莫特林结合位点内未发现稳定的键合(图4A和B类). 然而，Wi-N已被证明通过与这两种蛋白质结合来消除莫他林-p53复合物(15). Cuc与莫他林p53结合位点有很高的亲和力，从而阻断p53-莫他林复合物(图4A和C类)，导致p53的重新激活，从而分别导致野生型和突变型p53癌细胞的生长停滞或凋亡(8，47). 与Wi-N（对p53和莫他林以及hnRNP-K具有较高的对接亲和力）结合，其作用增强。已证明，莫特林具有促增殖、抗凋亡和促迁移的特性，可促进致癌。它已被证明与野生型和突变型p53蛋白相互作用(47)并分别抑制其转录激活和凋亡功能。CucWi-N可能激活癌细胞中的这些功能，导致生长停滞和凋亡。莫他林是热休克蛋白家族的一员，通过泛素-蛋白酶体途径受到严格调控(48). 失活或药物诱导的错误折叠蛋白预计会经历蛋白酶体降解，这可能是莫特林蛋白减少的原因，但并非如图4G和补充图6分别为。CucWi-N诱导莫特林降解的确切机制值得进一步研究。已证明莫他林可以调节细胞迁移和转移(29)，其在CucWi-N处理的细胞中的减少可能是其迁移和侵袭减少的原因(图3).

Cuc和Wi-N对接显示出与hnRNP-K蛋白的相对亲和力(图4D–F). 值得注意的是，当Wi-N与hnRNP-K预对接时，Cuc显示出高结合亲和力(图4C). 这些数据可能解释了CucWi-N组合具有更高的治疗潜力。体内裸鼠肿瘤进展数据和对照和CucWi-N-fed小鼠肿瘤蛋白分析表明，CucWi-N对小鼠无毒，具有较强的抑瘤和抗转移能力(图5). 此外，尽管在对照裸鼠中，通过尾静脉注入血流的细胞可以定植到肺部，但CucWi-N-fed小鼠的肺部肿瘤结节数量和大小显著减少。癌细胞转移涉及hnRNP-K、莫他林和EMT蛋白（包括基质金属蛋白酶和波形蛋白）的上调。值得注意的是，CucWi-N抑制了癌细胞的迁移和侵袭能力在体外，我们观察到肺转移减少体内这可能归因于hnRNP-K、莫他林、血管内皮生长因子、波形蛋白、基质金属蛋白酶2和纤维连接蛋白蛋白的下调(图3).

在本研究中，我们假设并旨在开发一种来自印度人参和中国人参的生物活性物质的组合，该组合可作为天然、经济、安全的抗癌药物。细胞表型和分子分析提供了证据，证明它对正常细胞是安全的，并导致癌细胞的复制性衰老。我们已经证明，CucWi-N以莫特林和hnRNP-K蛋白为靶点，导致拉明和MRN复合蛋白的减少，从而导致癌症细胞衰老和迁移减少。我们建议CucWi-N作为一种有效的癌症预防和治疗抗癌鸡尾酒，值得临床评估。

基金

该研究得到了生物技术部（DBT）（印度政府）和国家先进工业科学技术研究所（AIST，日本）基金的支持。

致谢

作者感谢Krishna Sai MLNV、Rajkumar Singh Kalra、Sajal Afzal、Anupama Chaudhary和Yue Yu的宝贵投入。苏坎·加格是本州国际基金会奖学金的获得者。

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