溃疡性结肠炎伴或不伴原发性硬化性胆管炎患者肠道微生物的特征

摘要

背景和目标：

溃疡性结肠炎（UC）和原发性硬化性胆管炎（PSC）之间存在无法解释的联系，肠道微生物群是一个重要因素。本研究的目的是比较患有和不患有PSC的UC患者的肠道微生物群结构。

方法：

从奥斯陆大学医院、卡尔加里Foothills医院和多伦多西奈山医院的生物库中鉴定出患有PSC[PSC-UC]和不患有PSC[UC]的UC患者。从结肠组织中提取微生物DNA，并对Illumina MiSeq上16S rRNA基因的V4区进行测序。使用微生物生态学定量观察[QIIME]将序列分配给操作分类单元[OTU]。对PSC-UC和UC表型之间的微生物α多样性、β多样性和相对丰度进行了比较。

结果：

总共包括31名PSC-UC患者和56名UC患者。主坐标分析[PCoA]表明，样本采集城市是分类特征的最强决定因素。在奥斯陆队列中，与UC相比，PSC-UC的Chao 1指数略有下降[对=0.04]但在卡尔加里队列中没有显著差异。使用β多样性测量未观察到PSC表型的聚类。对于多个微生物属，UC和PSC-UC在名义上存在显著差异，但结果对假发现率校正不可靠。

结论：

在不同队列的UC患者中，没有发现PSC特异性强的微生物相关性。招募中心对微生物组成有很大影响。未来的研究应该包括更大的队列，以增加力量和控制混杂因素的能力。

1.简介

人类肠道微生物群是一个由10个组成的群落¹¹–10¹⁴肠道内的生物体。¹肠道微生物群组成和功能的变化越来越被认为在炎症性肠病以及其他慢性炎症性疾病的发病机制中发挥着重要作用。^2,三原发性硬化性胆管炎是一种以胆管炎症和纤维化为特征的免疫介导的慢性肝病。这是一种没有有效治疗的进展性疾病，其中很大一部分患者进展为肝硬化，需要进行移植。⁴在PSC患者中，IBD（主要是溃疡性结肠炎[UC]）的并发率为60-80%，2-4%的IBD患者发展为PSC。^5,6

UC和PSC之间的重叠部分可以通过共同的遗传易感性来解释。⁷多态性，包括与UC和PSC相关的变异体，可能会改变能够入侵肠-肝的有害肠道微生物群的丰度。或者，这些多态性可能会放大胆道上皮对微生物抗原的敏感性，从而导致炎症和纤维化。然而，迄今为止，遗传学只解释了疾病风险的一小部分，表明环境因素也很重要。在一系列潜在的候选环境因素中，肠道微生物组分很受关注，因为它们可能通过局部作用介导肠道炎症，并通过微生物因子的肠-肝循环介导肝脏炎症，如细菌过度生长大鼠的胆管炎模型所示。⁸PSC的第一次治疗试验是用抗生素进行的，尽管迄今为止尚未证明临床有效，但抗生素似乎确实会影响疾病活动参数。⁹本研究的目的是比较有PSC[PSC-UC]和无PSC[UC]的UC患者的肠道微生物群结构，以确定PSC特异性微生物谱。

2.材料和方法

2.1. 研究患者

三个学术医疗中心参与了本研究：奥斯陆大学医院中心、奥斯陆[奥斯陆]、卡尔加里Foothills医院和多伦多西奈山医院。对现有的组织生物库进行了审查，以通过可用的内镜结肠活检来识别PSC-UC和UC患者。UC的诊断是根据公认的临床、内镜和病理标准进行的。¹⁰PSC的诊断依据公认的临床、放射学和病理标准，包括：慢性肝酶升高；内镜逆行胰胆管造影或磁共振胰胆管造影上PSC的标准放射学证据；和/或符合PSC的肝脏活检；排除胆管炎的继发原因。^5,11如果受试者在内镜活检时接受抗生素、熊去氧胆酸、皮质类固醇、免疫抑制剂或生物治疗，则被排除在外。先前进行过原位肝移植的受试者也被排除在外。在审查生物库和应用排除标准后，n个=19奥斯陆PSC-UC，n个=18奥斯陆UC，n个=12卡尔加里PSC-UC和n个确定了12名卡尔加里UC受试者。MSH提供了另一个对照组n个=26名UC受试者[补充图1，可在ECCO-JCC在线获取补充数据]。为了最小化粘膜炎症对微生物成分的混杂影响，最终分析中只包括活检时内镜Mayo评分≤1的受试者；奥斯陆PSC-UCn个=19，奥斯陆UCn个=9，卡尔加里PSC-UCn个=12，卡尔加里加州大学n个=12，MSH UCn个=18[表1]。收集的数据包括UC病程、当前药物和活检时的内镜Mayo评分。通过回顾病史、肝酶、肝合成功能和影像学研究（如有），对UC队列中的受试者进行筛选，以排除PSC。从PSC-UC受试者收集的其他数据包括：PSC疾病持续时间、肝脏酶值和肝脏合成功能。另外三个来自MSH的健康对照组（使用snap冷冻和RNAlater溶液[Qiagen，Hilden，Germany]保存的内镜活检）也包括在研究中，仅用于评估活检保存方法对结肠组织微生物组成的影响；这些受试者没有被纳入任何其他分析。

2.2. 样本采集、处理和DNA提取

收集左侧结肠的内镜活检。考虑到队列中只有一部分患者患有左侧结肠炎，因此选择重点关注左侧结肠样本，以确保所有活检均来自受UC影响的结肠段。将来自奥斯陆和MSH的样品放入无菌、空的冷冻瓶中，在液氮中进行snap冷冻，并在-80°C下储存。来自卡尔加里的内窥镜活检标本收集在含有RNAlater的无菌小瓶中[德国希尔登市齐根市]，并保存在-80°C下。然后将来自奥斯陆和卡尔加里的生物样本在适当的储存条件下运输至MSH组织生物库进行处理。使用Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒提取组织细菌DNA【德国希尔登市Qiangen】，采用额外的打球步骤和蛋白酶K处理，以确保细菌细胞充分溶解。由一名技术人员使用相同的方案和相同的Qiagen提取试剂盒在单个中心[MSH]对所有样本进行DNA提取。

2.3. 肠道微生物群的分类特征

细菌的V4高变区16S核糖体核糖核酸[16S rRNA]在Illumina MiSeq平台[Illuminia Inc.，CA，USA]上测序，生成175个碱基对的配对读取。成对的末端读数被缝合在一起[大约97个碱基对重叠]，并在微生物生态学定量洞察[QIME]1.7.0中实施的数据管理管道中进一步处理。²质量过滤后读取次数少于1000次的样本被删除。使用基于参考和从头开始在QIIME中使用USEARCH算法进行搜索，该算法具有内置嵌合体检测步骤[http://qime.org/scripts/pick_otus.html].^12,13然后，利用UCLUST软件和Greengenes参考数据库[第13_5版]，以97.0%的序列相似性将非二倍序列聚类为操作分类单元[OTU]。分析中删除了不到五个样品中的OTU，并且没有属或种级别的分辨率，将预过滤OTU数量从3074减少到76。

2.4. 统计分析

在每个样本1000次读取的深度下进行稀释[1000次采样]，这些稀释值用于所有多样性分析。所有稀有物种的平均α多样性被用作每个样本总体α多样性的估计值。使用Bray-Curtis-Faith、加权Unifrac、Spearman、Euclidian和未加权Unifrach指数估计β多样性，^14,15并使用主坐标分析[PCoA]进行可视化，以确定数据中是否存在较大的变化模式。

根据初步分析，表明由于样品的地理来源，存在较大的变异模式，分析分别比较奥斯陆和卡尔加里队列中的表型组，MSH样品仅包含在选定的子分析中。原始OTU计数转换为相对丰度，并根据样品中是否存在OTU进行二分。使用非参数Kruskal-Wallis检验比较了PSC-UC和UC表型之间的微生物相对丰度和α-多样性值。Fisher精确检验（FET）用于分析二分法结果。多次测试的错误发现率[FDR]修正适用于所有统计测试，以最小化I型错误，尽管名义上对-报告值<0.05，仅纠正对-<0.05的值被认为是显著的。使用R【3.1.0版】进行统计分析。

2.5. 道德考虑

所有受试者均提供了书面知情同意书。这项研究得到了所有机构研究伦理委员会的伦理批准。

3.结果

3.1. 研究队列的基线人口统计学

奥斯陆、卡尔加里和MSH队列的基线特征描述如下表1和补充表1[可在ECCO-JCC网站上获得补充数据]。所有受试者在内镜活检采集时均患有UC[内镜活检时的疾病持续时间见表1]除了奥斯陆UC队列中在诊断UC时进行内镜活检的受试者。受试者接受了最低限度的药物治疗，部分受试者接触了5-氨基水杨酸[5ASA][参见表1]但没有人在内镜取样时使用皮质类固醇、免疫调节剂或生物制剂。奥斯陆、卡尔加里和MSH队列中每个样本的平均阅读次数分别为3323、14103和15948。

3.2. 招募中心研究人群之间的异质性

在联合队列中，以及分别来自三个招募中心的UC和PSC-UC组中，评估了微生物组成研究中包含的样本的地理来源的混杂效应。β多样性和PCoA表明，招募中心不仅在整个研究队列中，而且在UC和PSC-UC组中对样本进行了不同的聚类[图1,补充图2-4，可在ECCO-JCC在线上获得补充数据]。在属水平上，一些生物似乎推动了这种集群。黄杆菌纲仅在MSH样品中检测到，尽管相对丰度较低[对=3.9 x 10^–13]。或者，假单胞菌属在所有卡尔加里样品中检测到低丰度，在MSH样品中检测频率较低[38%]，在奥斯陆样品中检测的频率较低[8%]，对=8.7 x 10^-10。在三个队列中，在显著不同的个体比例中检测到11种额外的生物体。与这一观察结果一致，17个分类群的相对丰度在每个中心都不同[标称对< 0.05]. 然而，只有相对丰富的黄杆菌纲经多次测试修正后仍显著。

除了样本地理来源的影响外，招募中心之间的活检处理也存在差异[表1]。为了评估这些差异是否代表一个显著的混杂因素，我们对一小部分通过snap冷冻和RNAlater保存样本的个体进行了亚分析[n个= 3]. 主要聚集发生在个体水平，从同一个人的同一活检位置采集的所有样本似乎聚集在一起，这表明保存方法对微生物组的组成影响相对较小[图2].

3.3、。表型组间α和β多样性的比较

分别在奥斯陆和卡尔加里中心调查了微生物多样性。在奥斯陆队列中，与UC相比，PSC-UC的Chao 1指数略有下降[对=0.04]，但在卡尔加里队列中，各组之间的多样性指数差异没有达到统计学意义。α多样性的其他测量值[香农，观察到的物种]并未表明主要结果组之间的微生物多样性存在显著差异[图3]。在表型组之间的PCoA分析中，使用任何测量的β多样性指数都没有观察到明显的聚类[图4,补充图5-7，可在ECCO-JCC在线上获得补充数据].

3.4. 表型群间属级分类的比较

对奥斯陆和卡尔加里的PSC-UC群和UC群在属水平上的分类群进行了比较[表2]。PSC-UC和UC之间一些属的相对丰度不同，具有标称统计意义[对<0.05]，但经多次测试校正后，这些差异并不显著。此外，发现与结果名义上相关的生物体在队列之间并不一致。

4.讨论

在这项来自三个中心的30多名PSC-UC患者和50名UC患者的研究中，我们无法证明在我们的UC患者队列中与PSC相关的属水平上的微生物丰度持续存在显著差异；此外，在研究人群中，以标称显著性阈值确定的生物体并不一致。与根据Chao1指数评估的UC受试者相比，奥斯陆PSC-UC的微生物α多样性略有下降，这表明我们的结果组之间微生物群的组成可能不同；然而，我们可能缺乏检测组织水平差异的统计能力。本报告中更重要的观察结果之一是招募中心对微生物组分的强大影响。我们的数据表明，样本的地理来源显著影响肠道微生物组的组成，其影响远远掩盖了我们队列中的任何疾病特异性影响。

有充分证据表明，IBD和PSC之间存在强烈的相关性，这表明存在一种共同的致病因子或炎症途径，可引发和/或使肠道和肝脏炎症持续存在。最近对小鼠的研究表明，肠道微生物群就是其中一个候选菌。⁴人类研究为这一假设增加了砝码，表明PSC肝脏标本中存在微生物抗原，并且在PSC患者的胆道培养物中可以检测到细菌。¹⁶最近一份来自单个中心的报告使用系统发育微阵列对一小部分PSC、UC和非炎症对照组进行了检查，结果表明与UC受试者相比，PSC中的微生物多样性和丰富度降低。此外，未经培养的梭状芽孢杆菌II与UC相比，PSC显著降低，这一发现我们没有重复。¹⁷尽管有这份初步报告，但迄今为止关于肠道微生物群对PSC的贡献的研究很少。该领域数据缺乏的一个促成因素是难以通过依赖培养的技术表征肠道微生物群。下一代测序技术的最新进展使复杂的微生物群落能够以独立于培养物的方式进行表征。这些技术使用细菌DNA序列作为特征，可以估计生物体的特性、相对丰度和功能；16S核糖体RNA[rRNA]基因测序已成为广泛接受的最准确测定肠道细菌组成的方法。¹⁸

本研究中缺乏与PSC密切相关的微生物，这可能反映了UC中与PSC相关的微生物真正缺乏差异贡献。然而，我们认为，这种缺失更可能反映出一些研究设计和技术因素导致统计能力下降。招募足够数量的患者进行我们这样的转化研究可能具有挑战性，尤其是在研究PSC等低发病率疾病时。尽管许多大型学术中心合作进行了这项研究，纳入研究的受试者数量相对较少，因为我们试图招募肠道炎症轻微或无炎症的药物最少受试者，因此我们的研究可能没有足够的能力检测出与PSC的显著微生物相关性。我们重点招募同质病例和对照队列，以减少潜在的混淆；然而，尽管做出了这些努力，研究人群之间的显著异质性可能阻碍了我们检测关联性的能力。研究队列在招募部位的位置、IBD病程、5-ASA使用比例和活检保存方法方面存在显著差异，所有这些都可能妨碍我们检测UC中与PSC表型相关的微生物的能力。从技术角度来看，尽管我们使用了最先进的下一代测序技术[通过合成测序Illumina]，但更深入的测序可能会发现与PSC相关的低丰度生物体。

长期以来，对肠道微生物群进行评估的小鼠研究显示出强烈的“笼子效应”，即使在饮食和其他环境因素受到控制的情况下，与隔离饲养的动物相比，共同饲养的动物肠道微生物群的相似性也要大得多。¹⁹鉴于大多数人类微生物群研究无法在这种受控条件下进行，而且我们的研究包括来自不同地理区域的人群，我们担心招募中心会造成严重混淆。这就是我们观察到的，补充城市对肠道微生物组成有很大影响。这些差异可能是由多个因素驱动的，包括每个地区不同肠道微生物群的水平和垂直传播、饮食因素、环境因素以及不同地区之间的宿主遗传差异。

我们还评估了我们研究中的另一个重要混淆因素，即活检保存方法。奥斯陆和MSH的活检标本被快速冷冻并保存在-80°C，而卡尔加里的标本则保存在-80C的RNAlater溶液中。为了更好地了解组织保存方法对微生物组成的影响，我们使用三名拥有snap冷冻和RNAlater保存的活检标本的受试者，检查了活检保存技术对微生物构成的影响。我们没有观察到活检保存技术对肠道微生物群组成的任何显著影响，这与以前解决这个问题的数据一致。²⁰这些重要实验参数的特征显著影响了研究设计，因为我们选择将病例对照分析分别集中于奥斯陆和卡尔加里队列，并将MSH样本排除在主要分析之外。

我们相信，这项多中心研究对患有和不患有PSC的UC受试者的肠道微生物群进行了检查，为今后解决这一问题的研究提供了重要的经验教训。它表明了微生物群研究面临的挑战，因为微生物群受多种因素（包括身体部位、年龄、位置、生活方式、饮食和宿主遗传）的驱动而发生显著变化，此外，在这些研究中，表型和样品处理的标准化也很重要。^21,22反映了遗传关联研究的早期经验，当前的微生物群研究可能无法充分检测出重要的微生物群-表型关联，未来的研究可能需要更多的数据。在本研究中，我们证明了补充部位对肠道微生物组成的强烈影响。在设计未来的多中心微生物群研究时，必须考虑到这一影响，并建议在将个别研究的结果推广到一般PSC人群时必须谨慎。在未来的研究中，对患有和不患有UC的PSC受试者进行准确的表型分析对于确保病例和对照人群尽可能同质化至关重要，这将是一个持续的挑战。对于PSC中微生物群的研究而言，粪便样本的更一般肠道微生物特征，还是内镜组织样本的更具体、局部特征是最佳的，这仍然是一个悬而未决的问题。这方面的信息来自一份侧重于克罗恩病患者治疗队列的报告，该报告表明，粪便样本在分类或功能水平上与粘膜组织样本的微生物失调反应方式不同。然而，与粘膜相关的生物体并不局限于任何特定的肠道位置，而且很容易在粪便和组织样本中观察到，尽管其丰度不同。²在就表征肠道微生物群的最佳生物样本类型达成共识之前，我们认为未来的研究应在其研究设计中收集这两种生物样本类型。下一代测序技术不断进步，成本相应降低，使得每个样本产生的序列数量增加。这一变化的结果是，在未来的研究中，更深入的测序将是可行的，其结果是，低丰度生物体可能被描述为特征，可能会发现本研究中未观察到的与PSC相关的新微生物。尽管描述患有和不患有PSC的UC受试者肠道微生物群的组成是重要的第一步，但通过测定PSC病例和对照组中的微生物功能，可以对PSC发病机制有更深入的机械认识。

总之，本研究描述了患有和不患有PSC的UC患者的肠道微生物群特征。它证明了UC中许多肠道微生物群与PSC表型之间名义上的显著关联。然而，所研究的欧洲和北美队列中的相关生物有所不同。虽然证明了名义关联性，但没有确凿的PSC相关微生物信号。然而，我们对迄今为止在微生物组研究中被低估的实验因素有了重要的了解，这些因素将影响未来研究的设计。需要进行大型、设计良好的前瞻性研究，对肠道微生物群进行更精细的描述，以确定肠道微生物群对PSC发病机制的贡献。

基金

本研究由PSC Partners和国际炎症性肠病研究组织（IOIBD）资助。DK是加拿大卫生研究院（CIHR）/加拿大胃肠病学协会（CAG）/Abbvie炎症性肠病研究基金会（Abbbie Inflammatory Bowel Disease Fellowship）的接受者。MSS由西奈山医院消化系统疾病Gale和Graham Wright主席以及加拿大克罗恩和结肠炎[CCC]和国家糖尿病、消化系统和肾脏疾病研究所[NIDDK][DK-062423]的资助提供支持。

利益冲突

作者没有需要披露的任何冲突[财务、专业或个人]。

致谢

没有与本文相关的其他确认信息。

会议报告：口头报告，美国肝病研究协会[AASLD]，美国华盛顿特区，2013年11月。

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