应用β和γ碳酸酐酶序列作为鉴定数据库注释的近交五指山小型猪全基因组序列中细菌污染的工具

摘要

苏斯克罗法或者说猪是几千年前被驯化的。通过各种本土品种，产生了不同的表型，如中国近交小型猪或五指山猪（WZSP），广泛应用于生命科学和医学领域。2012年对WZSP的全基因组进行了测序。通过对猪碳酸酐酶（CA）序列的生物信息学研究，我们在数据库中注释的WZSP CA中检测到一些β和γ类CA，而脊椎动物中以前没有描述过β或γ类CA。这一发现促使我们分析WZSP全基因组序列的质量，以确定可能的细菌污染。在本研究中，我们使用了生物信息学方法和网络工具，如UniProt、欧洲生物信息学研究所、国家生物技术信息中心、集成基因组浏览器、集成细菌、RSCB PDB和假单胞菌属基因组数据库。我们的分析确定猪有12个经典α-CA和3个CA相关蛋白。同时，证实WZSP中检测到的CA属于β-和γ-CA家族，属于假单胞菌属spp.和不动杆菌蛋白质结构研究表明，WZSP中鉴定的β-CA序列属于铜绿假单胞菌PDB ID:5JJ8，从WZSP鉴定的γ-CA序列属于铜绿假单胞菌PDB ID:3PMO。生物信息学和计算方法以及细菌特异性标记，如16S rRNA和β和γ类CA序列，可用于识别哺乳动物DNA样本中的细菌污染。

介绍

猪(苏斯克罗法)大约10000年前，它们通过人工和自然选择在亚洲和欧洲的多个地理区域驯化。特别是在作为主要中心之一的中国，驯化创造了许多具有不同表型的本土品种，包括高原型、长江下游流域型、西南型和华北型(1–3). 猪模型和小型猪品种的全基因组序列（WGS）在生物医学研究中非常重要，例如产生猪诱导的多能干细胞，用于治疗人类疾病，包括糖尿病和癌症，以及眼、神经变性和心血管疾病(4,5).

五指山猪（WZSP）是一种中国近交小型猪，具有体型小、体重约30kg、纯合子、遗传稳定性好、可预测性好等特点体内研究(6). WZSP于1987年由中国农业科学院动物科学研究所开发。方等。2012年执行了WZSP的WGS，定义了从220万拷贝（基因组的12.4%）的转移RNA中高水平衍生转座子(7). 此外，在WZSP的基因组中发现了许多人类基因和有效药物靶点。WZSP的WGS由北京基因组研究所的研究人员完成，为该小型猪模型在生物、医学和兽医研究中的应用提供了关键数据。

WZSP的基因组包含猪内源性逆转录病毒（PERV），可在生殖系中传播并感染人类细胞，导致严重的联合免疫缺陷(8). 因此，PERV被认为是WZSP等转基因猪向人类异种器官移植的巨大潜在风险。

碳酸酐酶（CA）是一种普遍存在的酶，在催化CO水合反应的酶活性部位含有锌、铁、钴或镉等金属辅因子₂至HCO_三⁻和H⁺用于pH稳态，并在许多生物化学途径和生理功能中发挥关键作用(9,10). CA被分为八个进化上不同的家族，包括α、β、γ、δ、ζ、η、θ和∏(11–14). α-CA存在于许多原核生物和真核生物中(15,16). 哺乳动物中有13种α-CA同工酶，其中12种存在于人类中，包括CA I–IV、CA VA和VB、CA VI、CA VII、CA IX和CA XII–XIV。CA XV存在于几种脊椎动物中，但至少黑猩猩和人类除外(17). 此外，有报道称存在三种非催化CA相关蛋白（CARP），包括CARP VIII、CARP X和CARP XI，这些高度保守的蛋白似乎发挥着关键的生物学作用(18–22). 尽管在一些原核生物和真核生物中已经报道了β-和γ-CA，但没有报告显示脊椎动物中存在β-或γ-CA(23,24).

Ensembl Genome Browser等数据库包含大量脊椎动物基因组数据资源，以支持进化和计算生物学等各个领域的相关研究，这些领域与WGS、脊椎动物基因表达研究和编码蛋白分析相关(25). 由于真核核酸样品受到真核宿主环境微生物群和正常菌群的细菌污染，原核生物中的一些污染基因和蛋白质序列在数据库中被错误地注释为真核生物(26).

在本研究中，我们使用β-和γ-CA通过生物信息学和数据挖掘方法将基因序列作为标记。

方法

CA的识别斯克罗法链球菌

鉴定CA同工酶的基因组学和蛋白质组学信息斯克罗法链球菌，国家生物技术信息中心（NCBI）数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) (27)用于确定相应基因的染色体位置和外显子计数。此外，UniProt数据库中的数据(https://www.uniprot.org/) (28)用于定义CA同工酶的亚细胞定位S.scrofa公司。

β-和γ-CA序列分析

在该分析中，β-CA蛋白序列来自醋酸杆菌（UniProt ID:A0A1U9KGA1）和γ-CA蛋白序列福氏志贺氏菌（UniProt ID:P0A9X0）用作查询序列。使用Ensemble Genome Browser的BLAST算法对β-和γ-CA查询序列进行基本局部比对搜索工具（BLAST）分析(https://asia.ensembl.org/index.html) (25). 为了在BLAST分析中找到相似的序列，Pig-Wuzhishan（组装：minipig_v1.0；加入：GCA_002844635.1；基因构建发布：2019年9月）由物种选择器部分选择，并使用灵敏度正常的TBLASTN搜索工具通过蛋白质查询搜索翻译的核苷酸数据库。在下一步中，使用UniProt数据库的BLAST同源搜索工具分析WZSP的已定义β-和γ-CA蛋白序列。在最后一步中，使用欧洲生物信息学研究所数据库的Clustal Omega算法，对本评估中涉及的所有β-和γ-CA蛋白序列进行多序列比对（MSA）分析(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo网站/) (29). 为了减少蛋白质序列的大小和MSA分析的输出数字，分别选择了含有酶活性位点的β-和γ-CA蛋白质序列的69和60个氨基酸序列。

细菌污染物中β-和γ-CA序列的基因组分析

β-CAs和γ-CAs的编码基因假单胞菌属使用BLASTP搜索工具在假单胞菌属基因组数据库，版本20.2(https://www.pseudomonas.com/) (30)使用1e-4作为默认值截止。此外，β-和γ-CA的编码基因来自不动杆菌Ensemble细菌数据库分析了作为另一种潜在污染物的spp(http://bactera.ensembl.org/index.html) (31).

蛋白质结构分析

RCSB蛋白质数据库（PDB）分析了来自细菌污染物的四个β-CA蛋白序列，包括UniProt ID:A0A0Q8Y2C1、A0A4R3W4C9、A0A656JXK1和A0A062C2I7，以及来自细菌污染物（包括UniProt ID:A0A4R5W1J2、A0A125QD08、A0A4R3W9L6、A0A2N1E8I6、A0A0A062BNN8和A0A419V156）的六个γ-CA蛋白质序列(https://www.rcsb.org/) (32)确定与查询细菌污染物的β-和γ-CA蛋白序列最相似的结晶和3D模型蛋白。

结果

α-CA的鉴定斯克罗法链球菌

该分析确定了12种α-CA同工酶，包括CA I–IV、CA VA和VB、CA VI、CA VII、CA IX和CA XII–XIV，以及3种CARP，包括CARP VIII、CARP X和CARP XI斯克罗法链球菌结果表明，1号染色体含有CA IX和CA XII的编码基因；第4染色体包含CA I–III、CA XIII、CAXIV和CARP VIII的编码基因；第6染色体包含CA VA、CA VI、CA VII和CARP XI的编码基因；第12染色体包含CA IV和CARP X的编码基因，第X染色体包含CA VB的编码基因斯克罗法链球菌预测CA I–III、CA VII、CA XIII和CARP VIII是细胞质的；CA VA和CA VB为线粒体；CA VI、CARP X和CARP XI为分泌型；CA IX、CA XII和CA XIV是跨膜的，CA IV是膜结合的(表1).

β-和γ-CA序列分析

预测的WZSP CA序列的BLAST同源性分析首次从A.aceti公司和γ-CA序列痢疾志贺菌WZSP的β-CA和γ-CA序列的更详细BLAST同源性分析显示，与来自假单胞菌属spp.和不动杆菌为了证实所定义序列的同一性，β-CA序列的MSA显示了五种高度保守的氨基酸，包括半胱氨酸、天冬氨酸、精氨酸（CXDXR）和组氨酸和半胱氨酸（HXXC），这是已知的β-CA酶的特征。类似地，预测的γ-CA序列显示了γ-CA的四个高度保守的氨基酸特征，包括谷氨酰胺和组氨酸（QXXXXXH）以及两个组氨酸（HXXXXH）(表2;图1).

细菌污染物中β-和γ-CA序列的基因组分析

分析表明β-和γ-CA来自假定细菌污染物的基因位于假单胞菌属spp.和不动杆菌进一步评估显示，所有来自假定细菌污染物的编码β-和γ-CA可能都是细胞质蛋白(图2-4).

蛋白质结构分析

结晶β-和γ-CA蛋白结构的3D模型与本研究中描述的细菌污染蛋白最为相似，在RSCB PDB数据库的NGL（WebGL）查看器中可视化（登录代码5JJ8和3PMO）(图5). 细菌β-和γ-CA蛋白的可视化图像分别显示了β-CA蛋白典型的同二聚体和同三聚体结构(33).

讨论

α-CA被经典地认为是脊椎动物中唯一的CA家族。根据这些观察结果，我们的研究表明斯克罗法链球菌有12个α-CA同工酶和3个与人类相似的CARP(26). 这些α-CA具有与人类酶一致的亚细胞定位，包括细胞质CA I–III、CA VII、CARP VIII和CA XIII；膜结合CA IV；线粒体CA VA和CA VB；分泌型CA VI、CARP X和CARP XI；和跨膜CA IX、CA XII和CA XIV(15).

令人惊讶的是，我们使用查询细菌β-和γ-CA序列进行的第一次研究分析在WZSP中检测到了对应的CA序列，事实上，MSA分析证实这些序列属于β-和β-CA家族。WZSP中已鉴定的β-和γ-CA的BLAST搜索同源性分析显示与来自假单胞菌属spp.和不动杆菌此外，通过假单胞菌属基因组数据库和Ensembl细菌数据库显示存在相应的β-和γ-CA基因组中的基因假单胞菌属spp.和不动杆菌具有编码CA的细胞质亚细胞定位。

先前的研究表明，宿主肠道相关菌群和环境微生物群，例如空气中的微生物，以及用于DNA分离的设备和溶液的细菌污染，都可能代表鸟枪宏基因组测序样品的潜在干扰物质和污染源，导致假阳性结果(34–36). 出于类似的原因，WZSP用于WGS项目的分离DNA样本很可能被假单胞菌目的细菌成员污染，包括假单胞菌属spp.和不动杆菌spp.，从而在S.scrofa公司此外，通过对细菌污染物中β-和γ-CA序列的蛋白质结构建模进行进一步分析，发现污染物中的β-CA序列与细菌污染物中的5JJ8晶体结构相似铜绿假单胞菌污染物中的γ-CA序列与来自铜绿假单胞菌，这两项都证实细菌污染物的β-和γ-CA序列属于假单胞菌序列。

在DNA-Seq和RNA-Seq项目中，有不同的管道用于基因组读取的去污，例如分层聚类算法(37)、RapMap(38)，去污矿工(39)，测序质量评估工具或SQUAT(40)、地图引导脚手架或MaGuS(41)和海怪2(42)，可以提高基因组样本的质量。无DNA试剂和试剂盒用于减少测序项目中的细菌污染(43). 测序方案中每一步的内部控制都可以检测到外源DNA或RNA的微量片段，以降低细菌污染的风险(44). 然而，我们的结果表明，由于微生物污染，基因组数据库中的序列确实包含不正确的序列，这突出表明需要高质量的内部控制和生物化。

结论

除了上述用于检测动物WGS项目中细菌污染的方法外，生物信息学和计算方法以及细菌特异性标记，如CA序列，可以通过在数据库中实施生物化来检测和降低WGS项目中的微生物污染风险。在鸟枪基因组项目期间，重要的是控制短尺寸文库、contigs和支架的质量，并对溶液、试剂和设备进行内部检查。这可以降低数据库中错误DNA和蛋白质序列注释的风险。

致谢

我们感谢伊朗伊斯兰共和国国家遗传工程和生物技术研究所（NIGEB）为开展本研究准备了条件。没有资助组织在研究设计中发挥任何作用；收集、分析或解释数据；撰写手稿时；也不包括公布结果的决定。

基金

伊朗伊斯兰共和国国家遗传工程和生物技术研究所（NIGEB）（致R.Z.E.）。

作者贡献

所有作者都参与了该研究的设计。R.Z.E.和S.P.设计了这项研究。R.Z.E.进行了检测α-、β-和γ-CA序列的搜索，进行了生物信息学和计算生物学研究，并起草了初稿。S.N.H.参与了数字的艺术准备，并准备了提交给期刊的手稿。所有作者都参与了进一步版本的写作，并阅读和批准了最终手稿。

利益冲突。

提交人声明他们没有利益冲突。

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