鲁棒性分析的通用计算方法及其在合成基因网络中的应用

摘要

动机：鲁棒性是指系统在面对扰动时保持功能的能力。它对于自然和工程生物系统的正确运行至关重要。稳健性通常定义为特别的这就阻碍了北野最近倡导的生物稳健性理论的丰硕发展。

结果：在本文中，我们提出了鲁棒性的一般定义，适用于时态逻辑LTL（线性时态逻辑）中可表达的任何生物函数，以及广泛的模型类和扰动类型。此外，我们在BIOCHAM 2.8中提出了一种计算方法和实现，用于自动估计给定行为相对于给定扰动集的鲁棒性。我们的方法的适用性和生物相关性通过测试和改进合成转录级联的定时行为的稳健性得到了证明，该级联可用作合成生物学应用的生物计时器。

可利用性：BIOCHAM 2.8版和转录级联模型可在http://containtes.inia.fr/BIOCHAM公司/

联系人： gregory.batt@inria.fr

1简介

鲁棒性可以定义为系统在面对扰动时保持功能的能力。多年来，许多研究从理论和实验上证明了鲁棒性是许多生物过程的关键特性，并提出了促进鲁棒性的机制（例如Barkai和Leibler，1997; 电池等。,2007; Chaves公司等。,2007; 奇利贝蒂等。,2007; 戴维森和莱文，2008; El-Samad公司等。,2005; Gonze（消失）等。,2002; 英格里亚，2004; 沈等。,2008; 希纳尔等。,2007; 斯特林等。,2004年b; 冯·达索等。,2000). 健壮性现在被视为生物系统的基本特征之一，因为它允许生物系统在存在分子噪声和环境波动的情况下正常运行。优秀的评论调查了生物稳健性的作用，并讨论了它与生物系统的进化性、生物网络的模块性以及稳健性和脆弱性之间的权衡的有趣关系（例如Kitano，2004; 斯特林等。,2004年a; 易等。,2000). 特别是，在合成生物学的背景下，这些是设计层面需要考虑的关键问题。

直观地看，健壮性的概念似乎很容易定义。我们考虑（i）一个特定的系统，（ii）一个特殊的函数和（iii）一组特殊的扰动，并评估扰动如何影响（或不影响）给定的函数。然而，除了北野这个明显的例外(2007)，还没有提出鲁棒性的一般形式化定义。稳健性的精确定义通常具有高度的问题特异性。这使得很难讨论和比较在不同上下文中发现的健壮性，甚至在类似上下文中，但使用不同形式的健壮定义进行计算。在北野(2007)提出了生物鲁棒性理论的数学基础，旨在为鲁棒性提供一个统一的视角。

虽然从理论角度来看非常有趣，但北野的定义在应用于特定问题时可能过于笼统。实际上，该定义依赖于所谓的评估函数，该函数使用未指定的、依赖于问题的实值性能函数进行定义。这里，我们建议使用新引入的时序逻辑公式违例度的概念来定义评估函数（Fages和Rizk，2008). 直观地说，违例程度反映了扰动系统的特定行为（以数字时间轨迹形式给出）与预期参考行为（以时间逻辑公式表示）之间的距离。由于（i）时态逻辑是表示语言，用于形式化动力学系统的时态行为，以及（ii）违例程度可以自动计算，所以我们对Kitano定义的实例化既有一般的和计算的我们工作的主要贡献是，我们提出了一种计算方法，并实现了鲁棒性的自动估计，该估计适用于广泛的动力学特性和各种可能的扰动。我们只是要求描述预期行为的属性可以用时序逻辑表示，系统的行为可以用数值轨迹表示（可能通过确定性或随机模型的数值模拟获得）。

这项工作的第二个贡献是，我们提出了两个紧密相关但不同的稳健性概念，这些概念在出版物中被滥用，即绝对稳健性表示系统在扰动下的平均功能，以及相对稳健性对于给定的系统标称行为，量化扰动对标称行为的影响。我们相信，区分这两个概念将有助于阐明对生物系统鲁棒性的分析。毫无疑问，正式的定义有助于作出这种区分。

我们的方法的适用性和生物学相关性通过对内置的合成转录级联的时间响应的稳健性的分析来说明大肠杆菌该系统表现出高的细胞间变异性，从而防止将其用作生物计时器。我们寻找能够提高“适时”行为稳健性的参数修改。

本文的其余部分组织如下。在下一节中，我们将简要描述Fages和Rizk中引入的违例度概念(2008). 在第3节，我们提出了鲁棒性估计的建议方法及其在BIOCHAM 2.8中的实现。在第4节，我们详细介绍了我们的方法在合成转录级联稳健性分析中的应用。

2临时逻辑属性的违反程度

我们首先定义了线性时序逻辑（LTL）在时间数字轨迹上的布尔语义(第2.1节). 然后，我们展示了如何使用第2.2节，我们可以定义时序逻辑公式的连续满意度(第2.3节)更好地适应稳健性的定量概念。

2.1数字道的时序逻辑语义

在本文中，我们认为生物系统的行为是由数值时间轨迹描述的。这些轨迹可以通过实际系统上的实验或随机或确定性模型的数值模拟获得。正式地说，a数值轨迹是描述系统随时间演变的元组的有限序列：T型=(秒₀,秒₁,…,秒_n个)，使用是严格增加的时间点序列，以及是状态变量值及其导数的向量t吨_我.英寸图1a、 描述了蛋白质浓度的假设演变。关联的跟踪是T型=((0, 6, 1.3), (2, 8, 0.8),…, (24, 5, 0)).

我们使用LTL来表示生物系统的动力学特性。时间逻辑已被开发用于指定（通常是离散的）动态系统的行为（艾默生，1990). 典型的属性包括可达性（系统可以达到给定的状态）、必然性（系统必然会达到给定状态）、不变性（属性总是真的）、响应性（事件必然触发特定的行为）和事件的无限次出现（如振荡）。在Antoniotti中可以找到系统生物学中时间逻辑表达的示例等。(2003); 电池等。(2005); 贝尔诺等。2004); Calzone公司等。(2006)查布里埃尔和法赫斯(2003). LTL公式是使用原子命题和LTL运算符构建的。

在我们的方法中，原子命题π表示对时间、蛋白质浓度及其衍生物的实际线性约束。原子命题的无限集用∏表示。

LTL运算符包括常用的逻辑运算符，例如否定（\），逻辑和（∧），逻辑或（ν） 和含义（→）和特定的时态操作符，例如下一个(X（X）)，未来(F类)，全球(G公司)和直到(U型).X（X）ϕ,F类ϕ,G公司和U型ψ、 分别是指在下一个时间、未来某个时间持有一个财产，在未来所有时间持有或持续持有，直到另一个财产ψ持有。这些操作符可以组合起来表示复杂的动力学特性。例如，跟踪T型在中表示图1a满足公式₁=F类([答]>7 ∧F类[答]<3），表示在某个时间点，蛋白A浓度超过7，然后低于3。由于否定可以被推到具有算子通常的对偶性质的原子命题，并且原子命题集是通过否定来封闭的，因此我们在不损失一般性的情况下只考虑无否定的LTL公式。

LTL公式的标准语义通常定义为无限执行，即无限跟踪。因为在我们的例子中，跟踪是有限的，所以必须调整LTL的通常语义。让T型=(秒₀,秒₁,…,秒_n个)是有限数值迹，π∈∏是一个原子命题，ψ，ψ是LTL公式。然后，LTL公式关于有限迹的语义归纳定义为T型⊧iff秒₀⊧，和我们的LTL语义与在最后状态上的自循环完成的有限轨迹上使用的标准语义一致（Fages和Rizk，2008). 这种语义不同于Eisner的中性语义等。(2003)对于下一个算子的有限迹，在它们的定义中，最后一个状态总是错误的，而在我们的例子中，它具有对偶性X（X）ϕ=X（X）和任何一种X（X）或X（X）黇保持不变。在实际中，下一个算子主要用于检测局部极值，这种解释差异并不显著。

• 秒 _我⊧πiff用通常的语义满足π，

• 秒 _我⊧∧ψiff秒_我⊧和秒_我⊧ ψ,

• 秒 _我⊧νψiff秒_我⊧或秒_我⊧ ψ,

• 秒 _我⊧X（X）敌我识别我<n个和秒_我+1⊧，或我=n个和秒_n个⊧ ϕ,

• 秒 _我⊧F类iff∃j个∈[我,n个]这样的话秒_j个⊧ ϕ,

• 秒 _我⊧G公司iff∀j个∈[我,n个],秒_j个⊧ ϕ,

• 秒 _我⊧ ϕU型ψiff∃j个∈[我,n个]秒。秒_j个⊧ψ和∀k个∈[我,j个−1],秒_k个⊧ ϕ.

值得注意的是，当数值轨迹对应于连续过程的离散表示时，我们使用的离散时间语义可能会导致特定事件被“错过”，而与数值积分方法可能产生的数值误差无关。例如，公式F类([答]≥10）在记录道上解释T型属于图1并最终表示[答]根据积分步长和精度，如果超过10，则可能会发现true或false。因此，在检查有限离散时间轨迹的时间属性时必须小心[有关讨论，请参阅Eisner等。(2003); 费内科斯和帕帕斯(2007)和马勒等。(2008)以及其中的参考文献]。

2.2从模型检查到约束求解

时态逻辑的布尔解释不适合定义稳健性的定量概念。事实上，这两个公式都不是₂=F类([答]>12 ∧F类[答]<3）和_三=F类([答]>14 ∧F类[答]<3）等待跟踪T型属于图1a.然而，直观地看₂比更令人满意_三，因为它只需要[答]达到12而不是14。

有趣的是，LTL公式可以被视为QFLTL公式的一个实例，该公式是通过新变量提取公式中出现的常数而获得的年∈ℝ^q个例如，to₁=F类([答]>7 ∧F类[答]<3），我们将公式⌀联系起来(年)=ϕ(年₁,年₂)=F类([答]>年₁∧F类[答]<年₂). 那么我们就有了₁=ϕ(7, 3). 此外，对于我们的示例跟踪，可以很容易地进行检查T型，𝒟_{T型,ϕ(年1,年2)}={年₁≤10 ∧年₂≥2}、10和2分别是[答]在里面T型.

更一般地说，这个变量抽象/实例化过程允许我们将LTL公式视为QFLTL中的一个点公式空间ℝ^q个，其中q个是出现在中的常数数量（或被变量替换的常数数量，如果不是所有常数都被抽象掉的话）。在图1b、 ¼₁, ϕ₂, ϕ_三和𝒟_T型,ϕ在这个公式空间中表示。

提供任何跟踪T型=(秒₀,秒₁,…,秒_n个)和式(年)我们在（Fages和Rizk，2008)满足域𝒟_T型,ϕ(年)可以通过在T型和的亚式(年)使用命题1的等式。 

原子命题（单位：）(年)是自由变量的线性约束年，满足域是可以用标准多面体库计算的多面体的有限并和交集。虽然这些操作通常是有效的，但在最坏的情况下，需要在公式空间维度中使用时间指数。然而，它们与状态变量的数量无关。

2.3违规程度

再次考虑我们的例子图1使用欧几里德距离，我们得到了虚拟磁盘(T型, ϕ₁)=0，表示公式满足T型、和虚拟数据(T型, ϕ₂)=2和虚拟数据(T型, ϕ_三)=4，反映了这一点T型远未达到_三比₂.

我们想强调的是，在时序逻辑公式中通过变量抽象常量是定义米制的关于公式集。所有集合运算和距离计算都在相应的度量空间中进行，称为公式空间。直接定义轨迹之间的距离似乎更直观。例如，费内科斯和帕帕斯(2006)与类似aim一起使用-定义轨迹上时序逻辑公式的连续解释-给定轨迹之间的距离T型以及满足公式⌀的轨迹集。我们的方法的一个主要优点是，公式空间的维数（抽象常数的数量）通常比跟踪空间的维数低得多（跟踪长度）。在低维空间中执行集合运算和距离计算可能会严重影响这些方法的实际适用性。唐纳森和吉尔伯特(2008)最近也基于时间逻辑公式的满足域的定义，提出了类似的违反程度的概念。然而，（有限）满足域的计算是通过对公式空间采样而不是通过约束求解来完成的。在本文中，我们将使用欧几里德距离。然而，可以使用许多其他距离（例如曼哈顿或切比雪夫），这取决于对距离的期望解释，以及我们将在下一段中看到的对稳健性的期望解释。

3鲁棒性定义和计算

3.1绝对稳健性

应该强调的是，这个定义非常一般的并且可以在许多情况下使用。不幸的是，北野没有提供多少关于如何定义所谓的评价函数D_一^秒系统的。该函数应确定系统在扰动下是否仍保持其功能，以及维持到何种程度。需要为特别的并重新实现了鲁棒性的计算。本文的一个主要贡献是证明，使用前面介绍的满意度概念，可以提供一个通用计算框架基于时间逻辑和北野的定义，可用于评估广泛类型的动力学特性和扰动的鲁棒性。

其中是时序逻辑中功能的规范T型_第页是表示系统在扰动下的行为的轨迹第页.这一概念稳健性对应于平均功能，即描述系统在扰动下的平均行为。为了说明这一点，请考虑图2描述性能的D类_一^秒-或者在我们的例子中，两个假设系统在面对扰动时的满意度第页由于这两个图具有相同的平均值，因此这两个系统在均匀分布扰动下的鲁棒性相等。例如，在生物工程背景下，如果“属性”反映了细胞输出的某些产品的数量，那么这两个系统实际上将平均产生相同数量的所需产品。

这种稳健性的概念在Ingolia中得到了应用(2004)，马等。(2006)和冯·达索等。(2000)研究大参数变化对果蝇属段极性图案形成。妈妈等。(2006)使用了需要“模式惩罚函数”的布尔标准笔(x个(t吨))低于给定阈值θ^*在600和800分钟时=0.0125。QFLTL公式ξ（θ）=G公司(时间∈[600, 800]→笔(x个(t吨))≤θ）表示惩罚函数在整个时间间隔内必须低于θ，并且系统行为的满意度T型_第页和（θ^*)提供了之间距离的定量度量T型_第页以及参考行为。

3.2相对稳健性

Gonze（消失）等。(2002)研究了低分子数对昼夜节律振荡周期的影响。随机模拟结果与相应确定性模型的行为进行了比较。周期被定义为蛋白质或mRNA浓度平均值连续两次向上交叉的时间间隔。人们可以使用我们的方法研究这种振荡，例如使用QFLTL公式F类(x个<米∧X（X）(x个>米)∧时间=t吨₁∧F类(x个<米∧X（X）(x个>米)∧时间=t吨₂))∧t吨₂负极t吨₁<b条表示两次连续向上穿越事件之间的最大时间小于b条，使用米的平均值x个，这需要事先计算。更复杂的时间行为，例如存在13个有丝分裂周期，随后G2停滞（Calzone等。,2007)，可以类似地表达，然后使用我们的方法进行分析。

3.3稳健满意度

这个概念允许我们区分是否可以放宽规范以满足所有扰动。在图1c、 可以保证系统始终呈现（可能是次优的）行为。此外，最近的财产非常满意（即可以为系统的设计提供有趣的提示：因为⁠，这表明只有第一个值（单位：[答]在T中）需要修改。

在电池中等。(2007)提出了一种方法来检查合成转录级联的（模型）是否满足给定参数集的输入/输出稳态特性。更准确地说，对于给定集合中的所有参数，都要求如果诱导剂浓度低(u个_{自动变速箱}<100），则在稳定状态下，荧光较低(x个_{环境足迹计划}<500），如果诱导剂浓度高(u个_{自动变速箱}>400），那么稳态荧光也是如此(x个_{环境足迹计划}>500000). 当考虑QFLTL公式时(米,M（M）)=u个_{自动变速箱}<100→FG公司(x个_{环境足迹计划}<米)∧u个_{自动变速箱}>400→FG公司(x个_{环境足迹计划}>M（M）)，还可以找到属性所有参数都满足。这可以通过计算所有满意度域的交集来实现_第页𝒟_{T型第页,ϕ}.房地产的稳健满意度(米,M（M）)提供了一个指标，表明我们的需求与强大的满足程度有多接近。

3.4实施

用于计算R（右）^秒_ϕ,P（P）,R（右）^秒,第页*_ϕ,P（P）和Rsd（卢比）^秒_ϕ,P（P）需要区分扰动集是有限的（例如基因敲除）还是无限的（例如正态分布参数变化）。在第一种情况下，可以精确计算值，而在第二种情况下可以通过对足够多的扰动集进行采样来估计值。

以下算法在免费提供的工具BIOCHAM的2.8版中实现，该工具是用于分析生物系统（Calzone）的建模环境等。,2006). 给定ODE模型如果，一套P（P）初始条件或参数的扰动，以及（QF）LTL特性(年)，该工具计算特性相对于给定扰动的鲁棒性、相对鲁棒性和鲁棒满意度。轨迹的计算T型_第页通过数值积分完成。满意度域的计算_{T型第页,ϕ(年)}通过对公式结构的归纳，为每个子公式直接实现定义。使用标准多面体库（Bagnara）在BIOCHAM中实现多面体操作等。,2008).

4在转录级联鲁棒性分析中的应用

我们考虑设计一个合成转录级联，用于合成生物学应用中事件的时间序列。这个瀑布是由Hooshangi及其同事建造的(2005)在这里，我们研究了期望行为的健壮性，以及使其更健壮的可能性。为此，在引入系统后，我们形式化了预期行为，开发了一个考虑到观察到的可变性的系统模型，并应用前面介绍的方法来研究预期属性的稳健性。

4.1系统描述

我们认为转录抑制的级联大肠杆菌（胡香木等。,2005). 网络表示为图3a.它由四个基因组成：四氯化碳,lacI公司,计算机接口和环境足迹计划分别编码三种阻遏蛋白，TetR、LacI和CI，以及荧光蛋白EYFP。由于EYFP蛋白，系统的荧光是测量的输出。该系统可以通过在生长介质中添加或移除小扩散分子aTc来控制。更准确地说，aTc与TetR结合并减轻对lacI公司因此，aTc浓度可作为系统的可控输入。很明显，系统在稳定状态下的输出（即荧光）对于低输入（即aTc浓度）为低，对于高输入为高。此外，研究表明，系统对诱导剂添加的时间响应的特征是荧光快速增加，之前有明显的滞后相。不幸的是，还观察到了细胞间的高变异性。细胞反应的异质性使得很难将该系统用作生物计时器，例如用于胡香木提出的发育程序等。(2005). 在这种情况下，对于许多合成生物学应用来说，即使细胞发送信号的比例很低，也可能会过早或过长，从而影响整个系统的正常运行。我们的目标是精确地研究获得一个强大的“定时”系统的可能性，即确保所有细胞确实会在给定的时间窗口内改变状态。

4.2指定预期行为

4.3系统可变性建模

有许多方法可以对细胞变异性建模（参见Manninen示例等。,2006). 我们的目标是构建一个简单的模型，使预测的行为和标准偏差与可用的实验数据一致。我们首先开发了一个类似于Batt的简单ODE模型等。(2007)而是使用Hill函数，参数与实验数据相吻合(图4a和B）。这些参数参考值表示为第页^*在续集中。其次，我们考虑了建模细胞变异性的各种方法，包括带有加性或乘性噪声的随机微分方程，以及带有（对数）正态分布的随机参数变异。我们在对数正态分布参数的预测和观测平均值与标准偏差之间取得了良好的定性和定量一致性，如所示图5所以我们选择这些对数正态参数分布作为我们的“扰动模型”。使用随机微分方程或正态分布参数，我们无法在模型预测和实验观测之间找到一致性（数据未显示）。这可以部分解释为细胞间变异性很高。特别是，在某个时间点，观测到的变异系数达到1.4，这意味着标准偏差高于平均值。

4.4提高期望行为的稳健性

在指定了“适时”行为并找到ODE模型和扰动模型后，我们想知道系统是否稳健地适时，以及在何种程度上。当考虑16维参数空间中5000个对数正态分布参数值时，我们估计系统的鲁棒性为⁠：规范未得到充分满足。正如预期的那样，该属性保留引用参数值第页^*（即。标准偏差(T型_第页^*，）=1），因此鲁棒性和绝对鲁棒性相等(⁠⁠). 满意度的分布表示为图5d、 这表明尽管大多数定时跟踪满足规范，但情况并非总是如此。平均而言，每个数值模拟持续150 ms，每个满意度计算持续50 ms（～500个时间点/轨迹；双核，2 GHz，2 GB RAM）。对于这种应用和我们的所有计算，限制因素是数值模拟。

原始参数之间的比较第页^*和所谓的优化参数结果表明，EYFP生产率和希尔系数η显著增加。考虑到人们希望确保低状态和高状态之间的快速转换，这些参数显然是优化的目标。由于调整Hill系数在实验上很困难，因此我们寻找并找到了Hill系数不变的参数，以确保稳健的适时行为。

数值积分表明，实际获得的预期行为更加稳健（相比之下图5c和第6页). 有趣的是，变异系数表明，当时间限制保持不变（对于时间<150），否则显著增加（150<时间<450，参见图6b） ●●●●。研究此功能是否系统地出现在参数变化中，以提高所需行为的稳健性，将是一件有趣的事情。这可以揭示稳健性和脆弱性之间的权衡（北野，2004).

4.5参数对稳健行为的影响

为了更全面地了解预期行为的稳健性变化，我们对参数空间进行了大参数变化的采样，并对每个参数进行了稳健性计算。

更准确地说，我们考虑参数空间上以参考参数值为中心的网格第页^*对应于两个参数（κ）的±10倍参数变化_{环境足迹计划}和γ；2D网格）或八个参数(κ⁰,κ、γ和u个_{自动变速箱}; 8D网格）。然后，对于作为相对稳健性计算参考值的每个网格点，我们估计了当所有16个参数都变化时网络行为的稳健性。请注意，我们将初始aTc浓度视为一个参数。γ参数对应于所有降解参数γ的比例因子_lacI公司, γ_{计算机接口}和γ_{环境足迹计划}，带γ^*=1.它用于评估生长速率变化的影响，类似地影响所有蛋白质稀释率，从而影响所有降解率。鲁棒性基于50个扰动（即参数）进行估计，在快速收敛的情况下，估计值小于50。

对于二维栅格，可以直观地显示结果。在图7，满意度、稳健性和相对稳健性在（κ_{环境足迹计划}，γ）参数空间。似乎γ的约束比κ的约束更严格_{环境足迹计划}.无论是满意度还是稳健性，γ都必须保持在一个较窄的区间内，而κ_{环境足迹计划}只是必须超过某个值。这一结果可以用以下事实来解释：高荧光蛋白产生率有助于系统产生快速而显著的反应，而蛋白质降解率γ的变化对行为有细微影响，因为它降低了荧光蛋白及其阻遏物的浓度。似乎名义行为，甚至是平均行为，对于增长率的变化来说相当脆弱。

稳健性环境看起来就像满意度环境的模糊版本。这对应于这样一个事实，即用于计算鲁棒性的细胞间变异性对应的参数变化通常小于探索参数空间时考虑的参数扰动。然而，还应强调的是，稳健性考虑了所有维度和特定分布中的参数变化（此处为对数正态，具有各种噪声强度σ）。因此，图7b不仅仅是模糊版本的图7a。

在图7c、 看起来，量化平均行为与名义行为之间差异的相对稳健性可以有效地识别满意度发生显著变化的区域。在系统设计的背景下，这些信息非常有趣。这可以与满意度对参数扰动的敏感性进行比较。然而，与灵敏度相反，相对鲁棒性考虑了给定的扰动模型。

我们认为8D网格定义如下。每个网格由三个参数值定义(第页_我¹,第页_我²和第页_我^三)在每个维度上。这些值，或者更准确地说，它们的对数，是通过平均划分参数域[ln得到的(第页_我/10） ，ln（10第页_我)]在三个子区间中，通过在每个子区间中随机选择一个值。一阶和最重要的二阶灵敏度指数如下所示表1它们对应于在三个类似定义的网格上获得的平均值（每8D网格约20小时）。

对一阶灵敏度指数的分析证实了我们之前的发现，即γ变化对级联的稳健行为有非常强烈的影响。仅此参数的变化就造成了20%的鲁棒性变化。相反，aTc变化似乎对级联行为的影响很小。虽然这似乎与输入/输出行为的超敏性相矛盾（Hooshangi等。,2005)它只是表明用于诱导级联的aTc浓度高到足以使网络对更大的aTc变化不敏感。

该分析的一个令人惊讶的结果是，基础和调节EYFP产生率的变化具有非常不同的重要性，κ⁰_{环境足迹计划}和κ_{电子飞行计划}(表1). 鉴于规范对“低”和“高”EYFP水平施加了类似的限制，并且这些水平与比率κ成比例，处于温和近似值下⁰_{环境足迹计划}/γ_{环境足迹计划}和κ_{环境足迹计划}/γ_{环境足迹计划}分别地，人们可以预期κ的敏感性指数相似⁰_{环境足迹计划}和κ_{环境足迹计划}事实上，低EYFP水平也依赖并以非线性方式依赖CI的稳态值，其本身与κ成正比_{计算机接口}/γ_{计算机接口}.因为κ_{计算机接口}变异对级联的稳健行为有强烈影响，我们的结果表明，当未诱导时，EYFP的基础生成是由于CI对启动子的不完全抑制，这解释了κ_{计算机接口}差异，而不是启动子的结构性泄漏，解释了κ的低效应_{环境足迹计划}⁰变化。该假设也与我们发现的二阶敏感性指数相一致：S公司_{κ计算机接口}, γ>S公司_{κ⁰电子飞行计划,γ}.

二阶灵敏度指数分析表明，产量和降解率的联合变化在稳健性变化中起着重要作用。这并不奇怪，因为如前所述，比率κ_我/γ_我在很大程度上决定了蛋白质的稳态水平。

5讨论

我们提出了一个通用的计算框架，用于定义生物函数对一组扰动的鲁棒性。该框架是通用的，因为它适用于（i）任何可在时序逻辑LTL中表达的生物函数，LTL是一种用于指定计算机科学和工程中广泛使用的动力学行为的表达语言，以及（ii）任何扰动集，前提是扰动系统的行为可以作为数值时间轨迹获得，例如通过ODE的数值积分。在此设置中，鲁棒性的计算是完全自动化的，并在自由软件BIOCHAM（Calzone）中实现等。,2006). 当形式化稳健性概念时，我们发现可以提出几个定义。人们可以显著区分绝对鲁棒性，量化受扰系统的平均性能，以及相对鲁棒性，定量因扰动导致的性能退化/改善。为了说明我们的方法的适用性并证明其生物学相关性，我们考虑了提高转录级联对添加诱导物的时间反应的稳健性的可能性。细胞间的显著差异使得很难将此系统用作合成生物学应用的可靠生物计时器。我们发现参数修改可以稳健地获得所需的定时行为。此外，我们还探讨了可能的大参数变化对所需行为鲁棒性的影响。通过全局灵敏度分析，我们获得了一些有趣的结果，这些结果可能有助于系统的优化。

我们方法的核心是满意度时间逻辑公式。在系统和合成生物学中，许多计算方法使用相当简单的系统性能度量，用于参数搜索、鲁棒性计算或局部和全局灵敏度分析。找到系统性能的相关度量限制了上述方法的适用性。此类测量的示例包括响应增益、稳态扰动或振荡周期扰动（Felix和Wagner，2008; 冯等。,2004; Gonze（消失）等。,2002). 相反，使用满意度作为性能度量，可以利用时序逻辑的表达能力，从而大大扩展这些技术的适用性。在里兹克等。(2008)，我们表明，使用满意度，可以有效地找到观察到复杂动力学行为的参数值。在本文中，我们展示了如何使用相同的概念来定义和估计LTL中可表达的任何动态行为相对于一组扰动的鲁棒性，以及如何应用全局敏感性分析来发现参数变化对预期行为的任何LTL规范的鲁棒性的影响。已经提出了使用时序逻辑来定义生物系统鲁棒性的其他方法（Batt等。,2007; 沈等。,2008). 然而，这些方法使用时态逻辑的布尔解释，而mboxis并不适合定义稳健性的定量概念。

鲁棒性和可进化性以及鲁棒性和模块性之间的关系在系统生物学中得到了广泛的研究（Ciliberti等。,2007; 北野，2004). 然而，在合成生物学中，并没有太多的工作集中于稳健性分析。由于显而易见的原因，在细胞变异和环境波动的情况下实现稳健的行为是合成生物学的中心问题。因为大型合成网络很可能是模块化的（Chin，2006; 麦克丹尼尔和韦斯，2005)我们可以设想一种方法，其中每个模块都被设计为稳健地呈现给定的行为，从而可以保证当包含在更复杂的系统中时，模块仍能按预期工作。在这种情况下，输入/输出鲁棒性（Shinar等。,2007)和绝缘（Vecchio等。,2008)都是特别有趣的概念。

致谢

我们感谢Ron Weiss、Priscilla Purnick和Weiss实验室的其他成员进行了富有成果的讨论并提供了实验数据。我们感谢欧洲项目Tempo、INRIA Colage和INRA AgroBi项目的部分支持。

利益冲突：未声明。

参考文献