有限微阵列数据的转录组网络成分分析

摘要

总结：网络成分分析（NCA）是一种从基因表达数据和TF基因结合连接性网络推断转录因子（TF）活性和TF-基因调控控制强度的方法，由于数据分解中的可识别性限制，该方法可以分析与总样本大小相等的最大数量的调节器。因此，源信号成分的总数仅限于实验总数，而非生物调节剂的总数。然而，那些转录组数据点少于监管机构数量的网络值得关注。因此，有必要建立一个理论基础，以允许基于相对较少的数据点提取实际的源信号。另一方面，这种方法本身会增加导致多重解决方案的数值挑战。因此，需要解决这两个问题。

结果：我们改进了NCA用于转录因子活性（TFA）估计，这是基于大多数基因只受少数TF调节的观察结果。这个观察结果导致了一个新的可识别性准则的推导，该准则在数值迭代期间进行了测试，当TF的数量大于实验数量时，该准则允许我们分解数据。为了证明我们的方法适用于真实的微阵列数据并具有生物实用性，我们分析了酿酒酵母细胞周期微阵列数据（73个实验），使用从ChIP-ChIP结合数据导出的TF-基因连接网络（96个TF）。我们将NCA分析的结果与ChIP-ChIP回归方法的结果进行了比较，我们发现NCA和回归产生的TFA在质量上相似，但NCA TFA在统计检验中优于回归。我们还表明，NCA可以提取与已知细胞周期TF功能和细胞周期相相关的细微TFA信号。总的来说，我们在一个或多个实验中确定了31个TF具有统计周期性的TFA，其中75%是已知的细胞周期调节剂。此外，我们发现在两个或多个实验中周期性的12个TFA对应于众所周知的细胞周期调节器。我们还研究了TFA对连接网络选择的敏感性，我们使用不同的ChIP芯片构建了两个网络第页-价值截断。

可利用性：MATLAB的NCA工具箱位于作者网页

联系人： liaoj@sease.ucla.edu公司

1简介

1.1背景

转录因子（TF）单独或联合作用于靶启动子以控制基因表达。TF调节活性由高级细胞功能控制，如反映细胞生理和环境的信号通路，通常通过转录后调节，如磷酸化、寡聚化、配体结合或亚细胞易位。激活的TF通过与DNA或RNA聚合酶的相互作用控制转录起始。因此，原则上可以从它们控制的基因的转录水平推断TFA。在最简单的情况下，一个TF控制一个基因，这个TF的活性与它控制的基因成正比。然而，在现实中，TF-电机连接更为复杂，需要非平凡的数学来进行反褶积。

网络组件分析（NCA）(廖等., 2003;Tran公司等., 2005)是一种基于模型的分解方法，用于从转录组数据和转录因子（TF）-启动子连接性网络推导此类信息，即转录因子活性（TFA）和调控强度（CS）。连接性网是通过预处理ChIP-ChIP数据构建的，DamID甲基化分析或广泛的文献搜索(李等., 2002;van Steensel和Henikoff，2000年). 为了实现唯一的数学分解，需要满足三个可识别性标准(廖等., 2003;Tran公司等., 2005)，这决定了此方法的适用性。特别是，其中一个标准要求数据点的数量大于TF的数量。在这项工作中，我们放宽了这一理论限制，允许基于有限的数据点进行分析。

推导TFA的其他方法包括REDUCE（以及等效的矩阵REDUCE）方法，该方法通过回归将基因调节的线性模型拟合到mRNA表达数据(布塞梅可等., 2001;高等., 2004). 这些方法是“无簇”的，只需要输入启动子序列（或ChIP-ChIP结合数据）和mRNA表达数据。从这个集合中，REDUCE评估所有可能的候选基序，其中每个基序对应一个已知或未知（但共享序列）的调节因子。这些基序在基因之间是单独匹配的，作者选择最后一组调控基序作为相应基因表达方差减少最大的基序。这里，将归一化模体结合拷贝数作为TF对该基因的调节强度，并通过线性回归从基因表达数据中获得TFA谱。REDUCE的优点是它不受NCA的可识别性标准的限制，因为它的CS是固定的。然而，由于该方法使用结合位点的拷贝数作为调节强度的替代物，因此无法区分同一TF对不同基因的正调控和负调控，并且可能会损害TFA估计的准确性。

推断潜在监管信号的其他方法（非TFA就其本身而言)包括主成分分析（PCA）和独立成分分析（ICA）。这些方法通过一组被称为特征基因或表达模式的基础谱（载体）解释了基因表达谱的收集(改变等., 2000). 在PCA中，特征基因是正交的。在ICA中，表达模式在统计上独立且非高斯(Lee和Batzoglou，2003年;利伯梅斯特，2002年). 在这种情况下，独立性是一个比不相关性更强的假设。顶部k个重要的基载体描述了大多数观察到的基因表达变异，并且已经证明它们对应于细胞周期中的主要生物现象(更改等., 2000).

然而，ICA和PCA方法都未能纳入网络的生物结构，因此描述是基于统计特性的。为了提供生物学见解，可以通过稳健回归将这些基础向量与表达谱结合起来(杨等., 2002)或通过伪逆投影结合位点数据（ChIP-ChIP）(Alter和Golub，2004年). 后者提供了选择细胞周期和复制起始因子中TF-基因结合活性的动态时间视图。

PCA和ICA方法被证明有助于绘制高度协调的转录反应，如细胞周期，这令人鼓舞，因为它表明数据分解可以发现相关生物过程的独立特征。然而，正交（或独立）基向量不一定对应于潜在的生物特征，实际上可能取决于旋转。我们认为，正是网络的拓扑（或结构）对确定TFA非常重要，因为TF可能共同调节基因表达。这一见解是NCA的动机，NCA是一种考虑网络拓扑的方法，用于从动态非线性模型计算组件TFA和控制强度(花王等., 2005;花王等., 2004;廖等., 2003;Tran公司等., 2005).

1.2网络组件分析

NCA使用组合幂律模型将基因表达公式化为每个调节TFA贡献的乘积，该模型可以被视为任何多维非线性动力学系统的对数近似(阿尔梅达和沃伊特，2003年;萨瓦乔，1976年;托雷斯和沃伊特，2002年;Voit和Almeida，2004年). 它捕获了一些非线性协同效应，但在数学上仍然易于处理，并且通常适用于大多数基因。

NCA与PCA和ICA的不同之处在于，它通过TF和启动子（即A类矩阵）和已知的零TFA（即P（P）矩阵）。连接约束来自全基因组DNA结合分析或广泛的文献搜索。潜在TF与电动机相互作用的存在表明非零控制强度将被估计为A类。否则，中的相应元素A类被约束为零。

请注意A类和P（P）两者都是未知的，这使得NCA分解的目标类似于PCA和ICA。然而，PCA和ICA的结果在TF和基因之间产生了完全连接。生物网络并不总是满足正交或独立假设以及由此产生的完全连通性。然而，如果没有额外的约束（正交或独立），矩阵分解问题的解决方案就不是唯一的。

数据矩阵电子可以是由不同菌株、不同条件的平行实验组成的复合物，除了时间序列外，相应的列P（P）表示该条件下或该应变下的TFA比率。因此，如果已知TFA比率在实验条件和参考条件（例如TF剔除）之间没有变化，则相应的P（P）元素也可以被约束为零。如果零模式A类和P（P）满足一组数学标准，然后分解电子到A类和P（P），是唯一的(廖等., 2003;Tran公司等., 2005).

2个结果

2.1修订后的NCA第三条标准

为了确保矩阵分解问题的唯一解决方案，NCA要求满足三个标准(廖等., 2003,Tran公司等., 2005). 特别是，有一个标准要求P（P）矩阵必须具有全行秩。这意味着所分析的TFA数量必须小于或等于数据点的数量。该标准显著限制了可从微阵列数据中获得的TFA数量。为了缓解这个问题，我们注意到，大多数基因只受数量远小于所关注总TF的TF的调节。根据这一观察结果，第三条标准修改如下（见第5节的证明）。

给定数据矩阵电子，分解电子=AP公司+Γ，s.t。A类∈Z轴_A类,P（P）∈Z轴_P（P）对于给定的剩余Γ，如果每个约化矩阵都是标度因子唯一的（或本质上唯一的）P（P）_里(我= 1, … , N个)具有全行排名，并且P（P）∈Z轴_P（P）其他两个标准保持不变（见第5节）。

在这里电子是一个N个×M（M）基因表达数据矩阵N个基因和M（M）条件，A类由合适的零模式定义Z轴_A类和是N个×我，其中我是TFA的数量(N个<我)和P（P）是我×M（M），也由零模式定义Z轴_P（P）(Tran公司等., 2005).P（P）_里定义为由以下行组成的矩阵P（P）对应于行中的非零元素我属于A类在逐个基因迭代的过程中检查这个新标准。修订后的标准意味着每个基因的数据点数量必须大于或等于调节该基因的TF数量。这提高了NCA的适用性，因为对于大多数生物体来说，调节基因的TF的最大数量可能小于5或6。例如，至少在酿酒酵母由大量TF调节的基因可能占据整个基因组的一小部分(李等., 2002).

2.2识别的概率方面

自A类和P（P）我们寻求本质上唯一的分解电子它们由可逆标度矩阵关联X（X）保持零模式A类和P（P）因此，$<trans data-src="A">A类</trans><trans data-src="¯">¯</trans><trans data-src="=">=</trans><trans data-src="A">A类</trans><trans data-src="X">X（X）</trans>$和$<trans data-src="P">P（P）</trans><trans data-src="¯">¯</trans><trans data-src="=">=</trans><trans data-src="X">X（X）</trans><trans data-src="−">−</trans><trans data-src="1">1</trans><trans data-src="P">P（P）</trans>$表示所有等效解决方案。如果X（X）是对角的，它表示合法的缩放因子。如果X（X）不是对角线，然后是中的任何非对角线元素X（X）将重组不同TF之间的贡献并退化结果。

如果违反NCA标准，则可能存在非对角线X（X）这样的话$<trans data-src="A">A类</trans><trans data-src="¯">¯</trans>$仍在Z轴_A类，但CS值退化。结果是无限次的分解电子进入之内A类和P（P）超越了简单的缩放。这对于数据分解来说是有问题的，因为当X（X）不是对角线，解可以是A类和行P（P）这个问题在任何矩阵分解为两个未知矩阵时都很常见，在多元回归和因子分析方法中也表现为共线性，通常通过岭回归或正交性的要求来解决(安德森，1984年). 注意，解的简并性并不代表系统的随机行为。这是不适定模型的结果。

在贝叶斯框架中，可识别性问题可以使用概率方法进行处理。由于违反可识别性标准而导致的退化解原则上可以使用信息先验来区分(萨巴蒂和詹姆斯，2005年). 然而，在大多数常见情况下，无信息先验会导致参数后验分布中的“方差膨胀”，这违反了可识别性标准(盖尔曼，2004). 这一点从一个简单的例子中显而易见[方程式（6）].

为了调查这个问题的重要性，图1c详细说明当我们增加一个非对角项时会发生什么X（X）在模拟数据中。结果是TFA每个点估计值的均匀分布₂因此，在贝叶斯NCA等概率方法中(萨巴蒂和詹姆斯，2005年)，方差膨胀将出现在A类和P（P）当不满足NCA可识别性标准时。

2.3执行第三条标准

在迭代过程中，可能违反了修改后的第三个标准。在这种情况下，当每个基因的调节TF违反标准3时，我们建议正交化每个简化矩阵（子网络）。这使得每个共同调节的TFA相互独立，减少了条件数并满足第三个标准。然后使用新的TFA继续NCA迭代。

2.4美白转换

对于分析大型监管网络的算法来说，计算时间是一个重要因素。对于NCA，通过白化程序对微阵列数据进行预处理可以获得更快的收敛速度。这种方法在神经网络和数据预处理应用中很常见，其主要特点是压平噪声并放大信号。可以在变换后的特征空间中进行优化，并且可以像使用ICA方法一样通过逆过程获得原始空间中的解(Hyvarinen和Oja，2000年).

3应用和结果

3.1网络组件分析面包酵母细胞周期

为了测试新算法的生物适用性，我们分析了面包酵母细胞周期数据(斯皮尔曼等., 1998). 我们将分析局限于α因子、cdc15、淘析和cdc28实验（73个数据点）。我们通过选择TF–基因与那些与ChIP-ChIP结合的基因的相互作用，从ChIP-cchip结合数据生成连接网络第页-值<0.001(李等., 2002). 如果结合第页-值<0.001且断开连接（在A类矩阵，否则）。请注意，连接的存在并不表示其最终值。分解后，边缘可能会变为～0，或变为某些调节强度值。中非零连接的初始值A类可以随机设置。此过程将生成连接网络(N个₁)涵盖约2200个基因的96个TF。其余17名TF因违反NCA条件2而被排除在外。请注意，如果我们使用先前的NCA标准，该网络的数据有限且无法识别（更多TF>实验）(廖等., 2003;Tran公司等., 2005). 然而，大多数基因受<7个TF的调节，因此我们可以应用我们的新标准和数值程序。我们使用白化和SO程序（如上所述）运行NCA，首先对连接网络中的非零CS值进行随机初始猜测。

3.2计算TFA的方法比较：NCA和REDUCE

为了将这些结果与REDUCE（例如矩阵REDUCE）进行比较，我们获得了布塞梅可等. (2001)和高等. (2004)这些数据包括从113个TF分析中报告的37个TFA，涵盖约750个实验数据点的约6000个基因。作者确定，在113个转录因子中，只有37个ChIP-ChIP结合模式是一个或多个实验中基因表达的重要预测因子。当REDUCE单独分析每个微阵列实验时，我们可以提取细胞周期TFA数据点，而不会影响结果。常见的实验包括α因子阻滞、cdc15、淘析实验(斯皮尔曼等., 1998). 此外，高等. (2004)分析了来自朱等. (2000)这包括α因子治疗中的fkh1/fkh2双敲除，以及fkh1/fkh2的双敲除细胞周期实验。cdc15数据在time包含一个复制t吨=160，因此我们对这两个数据点进行了平均，以供进一步分析。

这个面包酵母细胞周期是周期性的，大约每60分钟分裂一次。一个有趣的问题是，哪些TF具有周期性TFA，因为这些TFA可能表示调控/协调的转录反应，并可能提供额外证据，证明TF实际上是细胞周期调节器。我们使用稳健估计器测试了每个细胞周期实验中TFA的周期性(阿赫德斯马基等., 2005)调整了标准错误发现率（FDR）第页-值<0.05。我们在任何排他性实验（cdc28，fkh1/fkh2敲除）中都没有检测到周期性，然而，在常见实验中，我们确实检测到REDUCE和NCA的周期性TFA(表1). 在NCA的情况下，一些TFA在两个或多个实验中是周期性的。在REDUCE中，大多数TFA仅在一个细胞周期实验中具有统计学周期性。对于cdc15数据，我们采用了额外的Bonferrori第页-值修正（0.05/23），因为数据可能会因热冲击停止方法引起的周期性应力响应而产生噪音(张，1999).

图2显示了一些常见细胞周期TF的NCA和REDUCE计算的TFA的图。总的来说，结果表明减少TFA(图2a-f，虚线）比NCA TFA噪音更大(图2a-f实线），但在质量上彼此一致。例如，图2a表明NCA和REDUCE对众所周知的细胞周期调节器的结果相似ACE2公司两种方法都预测了在细胞分裂附近出现峰值的周期性相位，该峰值的特征是ACE2公司早期G的调节₁特异性基因转录(斯皮尔曼等., 1998).图2b显示的TFASWI4号机组在细胞周期内出现两个主要峰值，这两个峰值都对应于晚期G₁转录活性(斯皮尔曼等. 1998). 因此，与原始的周期性测量不同(斯皮尔曼等., 1998)我们能够提取和检测与细胞周期相关的多个周期性峰值。

剩余的REDUCE TFA(图1d–f)当相应的NCA TFA为时，不具有统计周期性。最可能的原因是，由于拟合固定的CS值，REDUCE引入了数值误差。值得关注的是数字1.图1c显示了大约在一个细胞周期内达到峰值的NCA TFA。该峰值与当前已知的数字1; 一种TF，在启动时对交配因子（α-因子）起调节细胞周期阻滞作用(门登霍尔和霍奇，1998年).

3.3错误连接的影响是什么？

假连通性包括不正确的边（假阳性）和未通过结合位点分析或实验方法检测到的真边（假阴性）。TFA对错误连接的敏感性面包酵母细胞周期已在之前进行过调查(杨等., 2005). 作者通过随机删除和插入TF和基因之间的连接，改变了每个网络多达10%的连接。他们发现，大多数TFA，尤其是细胞周期调节器，都是健壮的，不受扰动的影响。

在这项工作中，我们使用两个由ChIP-ChIP数据构建的连接网络，使用不同的第页-价值截断。此处网络N个₁从具有绑定的ChIP-ChIP数据中选择第页-值<0.001（如上所述），以及网络N个₂与ChIP-ChIP绑定类似选择第页-值<0.01。我们消除了任何不满足NCA条件2的基因和TF。在N个₁我们在96个周期性TFA中发现31个（FDR第页-值<0.05），23是已知的细胞周期调节器(表1). 在N个₂我们在112例（FDR）中发现29例周期性TFA第页-值<0.05），14种是已知的细胞周期调节因子。在这两个网络中，我们确定了九个著名的细胞周期调节器，并计算了它们在两个网络之间的相关系数N个₁和N个₂(表2). 这些结果与之前NCA通过子网络分解对类似细胞周期数据获得的结果一致(杨等., 2005)以及其他统计方法的结果，以确定细胞周期调节的TF，该TF是通过对与ChIP-ChIP TF结合或不结合的基因组之间差异表达的非参数测试计算得出的(济等., 2005). 因此，只要满足NCA标准，TFA计算对于连接网络选择是鲁棒的。

3.4 TFA的统计显著性

研究人员可能有兴趣识别一个或多个TFA相对于参考被显著扰动的实验。为了确定统计显著性，我们使用网络连接模式和基因洗牌（置乱）为每个实验数据点构建了一个零假设分布。分布是通过置换测试的多次迭代建立的（～100）。根据这个分布，我们计算出Z轴-每个实验数据点的原始TFA得分。结果是第页-每个数据点的值，该值确定计算的TFA是否与零假设不同。

4讨论

NCA是一种从基因表达数据和连接性网络推断TFA和CS的方法。然而，以前的数学要求将任何单个分析中推断的TFA总数限制在实验样本大小。在这项工作中，我们开发了一个新的可识别性标准，该标准放宽了这一要求，使得数据点的数量只需超过调节任何单个基因的TF的最大数量。由于大多数基因受少于五个TF的调控，NCA只需要五个转录组数据点，但可以分析的TF远远多于数据点的数量。

4.1 NCA与计算TFA的线性方法的比较

另一种类似于NCA的方法是REDUCE，它从基因表达数据和连接网络计算TFA。与REDUCE类似，NCA使用连接网络作为全球调控网络的模型。这些方法之间的显著差异在于，NCA将CS建模为基因表达数据的函数，而REDUCE将CS固定为结合亲和力（由ChIP-ChIP分析或启动子结合位点分析确定）。因此，与NCA不同，REDUCE不区分同一TF对不同基因的正调控和负调控，这可能会影响TFA估计的准确性。众所周知，结合强度与调节活性无关。因此，使用绑定数据作为固定CS可能会影响TFA估计。

另一方面，NCA也类似于PCA或ICA方法，因为它指定了保证唯一双线性数据分解的约束。这些约束来自连接网络。从二元网络的角度来看，PCA和ICA假设TF和基因完全连接。此外，主成分分析（PCA）和独立成分分析（ICA）要求每个基向量是去相关的或独立于其他基向量。因此，这些分解代表了对基因调控的统计解释。我们认为，直接整合连接网络而不是通过投影方法或回归方法，可以更详细地描述TF级别的生物现象，从而更准确地量化TFA和CS。

4.2可识别性的重要性

NCA可识别性违规会导致表示TFA线性组合的无限解。因此，这些退化结果无法从生物学角度进行解释。规避此问题的一种可能方法是使用贝叶斯方法，该方法对不同的解决方案使用不同的先验概率(萨巴蒂和詹姆斯，2005年). 在此框架中，基于给定的先验概率分布，区分由于不可识别性而产生的等价解。如果有信息丰富的先验分布，这种方法可能会很好地工作。然而，如果没有这些信息，违反可识别性标准会导致方差膨胀，并且区分等价解的能力会退化。如果网络的很大一部分违反了可识别性标准，这种情况尤其严重。因此，在分析之前检测问题是否存在非常重要。

总之，我们注意到确定双线性数据分解（如NCA）的可识别性很重要。在这方面，本文提供了一个新的标准，允许通过确定性和概率方法从较少的数据中确定实际的TFA。

5网络组件分析的标准证明3

   

• 标准1:A具有完整的列秩。

• 标准2：每个简化矩阵G公司_瑞吉(j个= 1, … , 我)，定义于Tran公司等. (2005)并且在定义2中，具有L−1的秩。

• 标准3：每行电子由行P（P）它们是线性无关的。

条件1和条件2与之前在Tran公司等. (2005)，条件3将在下一节中得到证明。

5.1第三个标准的证明：

因此，必要的条件是z（z）≥q个.如果第页=M（M）=最小值(我,M（M）)，然后z（z）≥我−M（M），因此中非零元素的数量A类_我（即调节基因i的转录因子的数量），我=我−z（z），必须小于M（M）（即实验次数）。

这项工作得到了国家科学基金会拨款CCF-0326605和UCLA-DOE基因组和蛋白质组学研究所的支持。S.J.G.的部分支持来自UCLA-IGERT生物信息学培训（NSF-IGERT 9987641）。L.M.T.得到了UCLA-IGERT生物信息学培训（NSF-IGERT 9987641）的支持。

利益冲突：未声明。

参考文献

作者注释