SARS-CoV-2蛋白质组和更大冠状病毒家族进化稳定功能和免疫原位点的鉴定

摘要

动机

自第一例确诊的新冠肺炎病例以来，全世界已感染1亿多人。全球抗击这种疾病的药物和疫苗开发工作已经产生了治疗新冠肺炎的疫苗和候选药物。然而，SARS-CoV-2变异体的传播威胁到这些治疗的持续疗效。为了解决这一问题，我们询问了整个SARS-CoV-2蛋白质组的进化历史，以确定进化上保守的功能位点，这些功能位点可以为寻找覆盖范围更广的冠状病毒家族的治疗方法提供信息。

结果

结合冠状病毒家族序列信息和当前疫情中观察到的突变，我们系统全面地定义了进化上稳定的位点，这些位点可能提供有用的药物和疫苗靶点，并且不太可能因新病毒株的出现而受到损害。几种经实验验证有效的药物与这些拟议的靶点相互作用。此外，相同的进化信息可以优先考虑交叉反应抗原，这些交叉反应抗原有助于指导多瘤疫苗策略，以实现对β-冠状病毒家族的非法广泛中和免疫反应。虽然研究结果集中在SARS-CoV-2上，但这些方法来源于进化原理，这些原理对生物体或感染因子不可知。

可用性和实施

这项工作的结果可以在以下网站上交互获得：http://cov.lichtargelab.org.

补充信息

补充数据可在生物信息学在线。

1引言

新冠肺炎是一种世界性的疾病。自2019年12月在中国湖北省武汉首次报告以来，世界卫生组织（WHO）已统计出全球200多万与新型冠状病毒相关的死亡人数和1亿多例感染者（截至2021年2月8日）(东等。, 2020). 虽然及时的公共卫生干预可以成功地减少发病率，但随后的感染浪潮和逃避当前治疗的新菌株的威胁仍然普遍存在(霍等。, 2021;克莱默等。, 2020;王等。, 2021;维布默等。, 2021;吴等。, 2021). 引起大流行的新型β冠状病毒（SARS-CoV-2）与其他人类冠状病毒病原体SARS-CoV，MERS-CoV密切相关(陈等。, 2020;卢等。, 2020)、HCoV OC43、HKU1，与人类感染性α冠状病毒HCoV 229E和HCoV NL63的关系更为密切(雷等。, 2018). 找到控制和预防进一步感染的方法是当务之急，其中包括发现靶向药物以损害病毒机制(基姆等。, 2021;锂等。, 2020;车辙等。, 2020)和抗原表位来开发强效疫苗(Poh公司等。, 2020;范多雷马伦等。, 2020). 这项研究通过利用来自严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型序列的进化信息和结构数据来搜索严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型基因组中每种蛋白质的可操作功能位点。

首先，我们注意到在正常情况下批准新药通常需要10年以上(达马等。, 2020;皮拉亚尔等。, 2020). 为了加速反应，许多当前的新型冠状病毒临床试验招募了过去针对寨卡病毒、SARS-CoV、埃博拉病毒和MERS-CoV的抗病毒药物(达马等。, 2020;约加勒卡尔等。, 2020). 为了测试更广泛的潜在药物以将其用于新冠肺炎治疗，一些研究筛选了数千种临床阶段或FDA批准的抗病毒活性小分子(里瓦等。, 2020;白色等。, 2021). 然而，这些大规模筛选中的抗病毒活性可能在一定程度上是细胞系特异性的(霍夫曼等。, 2020)因此临床相关性不明确。另一种筛选潜在药物重新调整用途的方法是进行对接(古德塞尔等。, 2020)SARS-CoV-2蛋白质组的临床阶段或FDA批准的药物(古普塔等。2020亿;奥尔特加等。, 2020). 然而，由于蛋白质表面空腔远远超过调节功能的实际配体结合位点，因此在目标蛋白质上选择正确的结合位点是关键和困难的(古普塔等。，2018). 在这里，我们基于进化信息系统地建议了大多数SARS-CoV-2蛋白的潜在药物靶点。由于这些位点是根据其保守的功能作用、广泛的泛冠状病毒/β冠状病毒相关性以及所有已知SARS-CoV-2变异体的最小变异性而选择的，因此在药物再利用的对接研究中应优先考虑这些位点。

其次，我们注意到，了解SARS-CoV-2感染的免疫反应对疫苗开发至关重要(格里福尼等。2020亿). 大多数早期SARS-CoV-2免疫表位发现研究在很大程度上依赖于生物信息学预测工具以及在SARS-CoV和MERS-CoV中已经完成的序列和表位工作。B细胞线性和不连续表位预测工具已用于识别可能的SARS-CoV-2表位(艾哈迈德等。, 2020;巴塔查里亚等。, 2020;格里福尼等。2020a年)，以及最近的几项实验确定的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型免疫表位(勒伯特等。, 2020;Poh公司等。, 2020). 有趣的是，一些研究小组报告了未接触病毒的个体对SARS-CoV-2表位的显著T细胞反应性(格里福尼等。2020亿;勒伯特等。, 2020;马特乌斯等。, 2020). 马特乌斯等。这可能是由于SARS-CoV-2与其他常见的人类冠状病毒如OC43、HKU1、NL63和229E之间的交叉反应(马特乌斯等。, 2020). 在这里，我们报告了一种进化指标，它可以准确地将交叉反应表位与非交叉反应表位区分开来，并使用该指标来提示严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型中潜在的交叉反应表位。在疫苗开发中优先考虑这些交叉反应表位可能会导致整个β冠状病毒家族的广泛中和免疫，为单克隆抗体的开发提供起点，并在面临使其效力降低的变异时为更新现有疫苗提供指导。目前正在注射的阿斯利康、摩德纳和辉瑞疫苗针对的是SARS-CoV-2尖峰糖蛋白(巴登等。, 2021;波拉克等。, 2020;沃西等。, 2021)而此处突出显示的交叉反应表位出现在Spike蛋白和其他SARS-CoV-2蛋白中变化较小的区域。

这里，我们使用进化追踪（ET）方法，该方法预测蛋白质序列位置的重要性，从最重要（0.0）到最不重要（100.0）。这种相对系统发育排序反映了相关进化树分支内和分支间每个序列位置的变异熵，揭示了与功能和结构决定因素相对应的进化压力点，以及它们经常聚集的蛋白质位点(米哈莱克等。, 2004). 许多研究验证了这种预测结合和催化功能位点的方法(利希塔奇等。, 1996)，指导蛋白质工程(彼得森等。, 2015;谢诺伊等。, 2006;索娃等。, 2001)和预测功能(阿明等。, 2013). 当被视为进化景观的梯度时，ET的残基重要性排名可以与氨基酸替代对数比值相结合，以估计编码变异对蛋白质功能的可能影响，即进化作用（EA）(Katsonis和Lichtarge，2014年). 对完整病毒蛋白质组的首次ET和EA分析确定了SARS-CoV-2中进化重要的残基和功能位点。

2材料和方法

这里可以找到这些方法的简要描述；有关具体方法的更深入描述，请参阅补充文本。

2.1演化轨迹

为了绘制SARS-CoV-2蛋白的功能决定簇，我们应用进化追踪（ET）方法(利希塔热等。, 1996;米哈莱克等。, 2004). 该方法通过跟踪氨基酸在冠状病毒系统发育树中的差异，将每个氨基酸在进化过程中从最重要到最不重要的位置进行排序。这些排名因多序列比对（MSA）的精确选择而异。为了产生稳健的ET排名，对SARS-CoV-2武汉-Hu-1参考基因组（NC_045512.2）中的每个蛋白质进行了三次单独比对(吴等。, 2020)，通过查询三个蛋白质数据库（UniRef90、UniRef100和NCBI NR）以获取25%到98%之间的序列。这个程序过滤掉了过长或多余的序列。只有两种蛋白质与ET、NSP11和ORF10的匹配太少，这两种蛋白质的功能都未知(加德哈等。, 2021;潘采尔等。, 2020)并且具有非常短的参考序列（分别为13个和38个氨基酸，补充图S1,补充数据集S1). 使用之前提出的选择聚类权重（SCW）评估每个比对的所有其他蛋白质的ET得分以及比对的平均得分z（z）-分数(米哈莱克等。, 2004;Wilkins等人，2010年). 这个z（z）-然后将每个结构的得分排名为1-4，这表明三个数据库中每个数据库的ET得分表现相似，但三个数据库的平均ET得分更好z（z）-大多数情况下得分(补充图S1C). 通过将得分最高的区域与已知的功能位点进行比较，进一步研究ET排名。

2.2变异调整ET位点预测

基于线性序列和结构约束预测了变异调整的ET位点。根据其ET排名，残基被指定为潜在治疗位点的成员，从GISAID检索到的SARS-CoV-2序列中缺乏变异体(Shu和McCauley，2017年)、Genbank(本森等。, 2018)和中国国家生物信息中心(Zhao等人，2020年)以及表面可达性和结构接近性。将结构确定的治疗位点与已知与SARS-CoV-2蛋白结合的药物的药物结合位点进行比较。为了将这种方法推广到没有结构的蛋白质，基于ET排名、当前突变谱和线性连接性预测了线性位点。使用Jaccard相似性和Fisher's Exact检验对结构预测位点和线性预测位点进行比较，以确定该方法在缺乏蛋白质结构的情况下的有效性。还询问了一些ET指标，以确定其突出潜在交叉反应免疫原表位的能力。最佳指标sumEA/sum（100-ET排名）用于预测交叉反应性T细胞表位，这些表位是良好的潜在治疗位点。此公式中使用的变量影响分数EA在支持信息中有更详细的描述。简单地说，它将进化梯度（由ET近似）与替代量（由变电站对数概率近似）相结合，以计算给定变量在健身环境中旅行的进化距离。将在严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型表位和相应的普通感冒冠状病毒表位之间观察到的变异的EA评分相加，旨在估计它们之间的功能距离。然后，根据表位所覆盖氨基酸位置的ET得分总和确定的表位的总体系统发育保守性来调整sumEA得分。

3结果

3.1 SARS-CoV-2的进化轨迹

为了绘制SARS-CoV-2蛋白的功能位点和决定簇，我们应用ET(补充图S1A,补充数据集S1)和相应的系统发育树(补充图S2–S4)26种SARS-CoV-2蛋白中的24种（参见补充方法和材料)，我们的方案计算了99.5%SARS-CoV-2氨基酸残基位置的ET重要性排名(补充数据集S2)从三个蛋白质数据库（UniRef90、UniRef100、NCBI NR）中的每一个生成，并将它们组合成单个平均值。除了考虑序列在比对中的多样性和广度外，我们还使用量化ET排名在3D结构中分布的统计方法评估了这些排名的质量；选择簇权重（SCW）z（z）-分数(米哈莱克等。, 2004). 该指标衡量排名靠前的ET残基在结构上相对于结构上得分的随机分布的聚类程度（参见补充材料和方法). 在以前的研究中，ET排名较好的残基（接近0）倾向于聚集在活性位点、蛋白质相互作用位点或其他功能位点(利希塔奇等。, 1996;米哈莱克等。, 2004;威尔金斯等。, 2010). 在这里，顶级残基的聚集在一些SARS-CoV-2蛋白质和复合物中特别突出，包括NSP5主蛋白酶、NSP7/NSP8/NSP12 RNA依赖RNA聚合酶复合物和NSP10/NSP16 RNA帽甲基转移酶复合物，可以被视为蛋白质结构中的暖色残基组(图1). 在分析的38个蛋白质结构中，有28个是SCWz（z）-得分为随机背景之上的2个标准偏差，这表明高等级ET残基在这些蛋白质结构中的分布不是随机的，并证实了比对是有信息的，并且由此得出的ET排名是有意义的(补充图S1,补充数据集S3). 对于未达到显著水平的蛋白质z（z）-得分与比对中缺少序列有明显的相关性（例如NSP1、e、ORF3和ORF7a），或者结构属于较大蛋白质中的一个小结构域（例如NSP3中的大结构域和S蛋白质中的HR2结构域）。

为了探测大蛋白中这些较小的结构域，我们进一步研究了ADP-核糖磷酸酶（ADPRP）和木瓜蛋白酶样蛋白酶（PL^{赞成的意见})NSP3的域。NSP3是一个有趣的案例，因为排名靠前的ET残基在其PL中很好地聚集^{赞成的意见}域，但不在其ADPRP域中(补充数据集S3). 为了更好地解析NSP3的ET排名，我们为每个NSP3结构域的特异性子序列生成了新的比对、系统发育树和ET残基排名（见补充材料和方法). 在这一重点分析中，损益^{赞成的意见}域现在产生了约50%的序列，导致顶级残基的聚类增加(补充图S5). 对于ADPRP域，包含了跨越生命三个域和远距离相关病毒的数千个额外序列，这导致ET排名与PL中聚类的重要性相媲美^{赞成的意见}域。我们在特定NSP3结构域的系统发育树中发现的差异证实了之前在不同冠状病毒属甚至β冠状病毒分支内观察到的交替结构域配置(雷等。, 2018). SCW的改进z（z）-得分对应于ADPRP结构域配体结合位点内的一簇高度排列的ET残基(补充图S5D)这在NSP3参考序列的完整分析中缺失。在更好地解析了NSP3域中的ET排名后，我们返回主数据集，查看ET排名在其他蛋白质中捕获功能位点的情况。

3.2系统学保守的配体结合位点

SARS-CoV-2配体结合位点目录可作为确定治疗靶点优先级的及时资源。先前的研究表明，进化序列信息与酶活性位点密切相关，可以作为功能特征的三维模板(阿明等。, 2013)并确定变构位点(巴特等。, 2020;罗德里格斯等。, 2010). 在此，我们以NSP12、NSP15和NSP16为例，说明ET捕获的进化序列信息如何预测病毒蛋白的配体结合位点。如所示图2A-C排名靠前的ET残基围绕NSP12（RNA）、NSP15（GpU）和NSP16（m7GppA和SAM）的天然配体聚集。为了量化该结果，通过Fisher精确测试确定了NSP3、NSP12、NSP13、NSP14、NSP15和NSP16配体5℃范围内ET等级≤30的残基的富集。在每种情况下，都有统计学意义上的丰富（补充图S6，补充数据集S4）。我们还发现，在所分析的11个配体结合位点中，有9个位点，我们的分析比之前报道的使用百分比同一性度量对SARS-CoV-2蛋白质组的分析更能识别已知的配体结合部位(补充图S6,补充表S4) (古普塔等。2020a年). 此外，ET还预测了几个新的功能位点(图2D和E). 在棘突蛋白（S）上，一个这样的ET簇与S2’蛋白酶裂解位点和融合肽部分重叠，这对SARS病毒的膜融合和传染性至关重要(马杜等。, 2009). 在核蛋白（N）的N末端结构域上，一簇高度排列的ET残基重叠(林等。, 2014;赛卡通杜等。, 2007)推测的RNA结合位点，可能有助于形成包裹RNA基因组的N蛋白-RNA螺旋丝(陈等。, 2007). 这些结果表明ET可以提供目前没有可用的配体结合结构的替代药物靶点。

除了对蛋白质功能很重要外，理想的药物靶点应在当前疫情中很少发生突变，以避免出现潜在的耐药性。因此，我们将重点放在截至2020年12月8日可用的139 607个高质量全长SARS-CoV-2序列中没有任何突变的位置。为了将蛋白质组范围内的ET序列和突变图谱转化为药物开发的有用信息，我们定义了无突变、表面暴露的残基簇，这些残基被ET高度排序，并且彼此相差不超过5º(补充数据集S5)作为变量调整的3D站点。由此产生的潜在药物靶点目录包括每个结构约4个位点的103个位点，其中最大的结构（Spike全长模型，6vsb_1_1）具有最多的位点。对于NSP12、NSP15和NSP16，变异体调整的3D位点与已知的配体结合位点重叠。

为了评估这些经变异调整的3D位点是否与药物靶点相对应，我们检查了它们与5个SARS-CoV-2蛋白-药物复合物晶体结构中观察到的位点的重叠。值得注意的是，所有五种药物在细胞或生化检测中均显示出抑制作用（参见补充数据详细信息）。将变异体调整后的3D位点映射到5个SARS-CoV-2蛋白-药物复合物上，如图3，所有五种药物都存在于蛋白质表面的囊袋中，这些囊袋位于或非常接近预测的变异体调整3D位点的至少一个残基。NSP5的变异体调整3D位点没有很好地恢复，主要是因为单个SARS-CoV-2测序条目（菌株MT745875）中蛋白酶活性位点中的几个残基发生突变（G143S、S144E和C145I），包括催化胱氨酸残基。S144E和C145I均由密码子中的两个核苷酸替换引起，仅在该菌株中观察到（20年6月24日取样）。目前尚不清楚这是一个测序伪影，还是代表一种真正的活性位点可塑性，这种可塑性损害了NSP5的活性位点作为一个稳定的药物靶点。然而，它确实说明了在选择药物靶点时准确检测新出现的序列变异的重要性。这方面的一个更清楚的例子是替吡西尔结合的NSP15活性位点，尽管该活性位点对整个冠状病毒家族在进化上很重要，但由于在当前疫情中观察到多种变体的存在，预计该活性位点不是一个好的药物靶点。总的来说，这些结果表明，预测的变异调整3D位点可以恢复实验测试的药物结合囊，并建议可以在计算对接方法中针对新位点。此外，由于这些位点在多个冠状病毒属中是保守的，预计这些预测的变异调整3D位点与识别SARS-CoV-2抑制剂以及更为远缘相关的冠状病毒相关。

3.3保护线性场地

变异体调整的3D位点可能被证明对指导药物设计很有价值，但这些方法依赖于具有高分辨率晶体结构，并且一些结构要么尚不可用（例如NSP2、NSP6、M和一些辅助蛋白质），要么不覆盖大多数蛋白质（NSP3和NSP4）或分辨率太低，无法进行准确的对接研究（NSP12、NSP14、S、N、ORF3a和ORF7a的外结构域）。然而，ET操作蛋白质序列，因此即使在缺乏3D结构的情况下，也可以识别在系统发育上重要的线性序列片段(Lichtarge等人，2002年). 在我们发现变异调整的3D位点的方法中，我们将ET残基排序信息与SARS-CoV-2分离物的测序数据相结合，得到沿蛋白质组的线性肽，这些肽在进化上很重要，在当前疫情中也没有变化(补充图S7,补充数据集S6). 为了评估这些经变量调整的线性站点的价值，我们询问他们是否可以重述经变量调整后的3D站点。将NSP12的变量调整线性位点映射到可用的NSP12结构上，如图4A，大多数三维和线性场地相互重叠。3D位点中143个残基中的84个（59%）也被确定为NSP12的线性位点（总共92个残基为线性位点）。变异调整的线性位点和3D位点也与其他SARS-CoV-2蛋白重叠良好，这是通过Jaccard相似性和Fisher精确检验量化的(补充数据集S7). 这些数据表明，变异调整的线性位点包含功能相关信息，因为它们重述了蛋白质或结构域的变异调整的3D位点，而不需要3D结构数据。在缺乏蛋白质结构的情况下，这些线性位点可用于设计抑制肽(顾等。, 2005;吴等。, 2020).

这些线性位点还与解决大流行、疫苗和单克隆抗体开发的第二种主要方法相关联。尽管新冠肺炎疫苗现已上市，但在英国出现了几个新的变体（B.1.1.7）(兰伯特等。, 2020)和南非（B.1.351，也称为501Y.V2）(特加利等。, 2020)在Spike蛋白的受体结合域中有多个取代。两者都对几种单克隆抗体具有耐药性(霍等。, 2021;维布默等。, 2021). 虽然B.1.1.7对恢复期血浆的抵抗力增加了约2倍，但B.1.351更令人担忧，因为它对从约80%的患者获得的恢复期血浆抵抗力可能增加了约11至33倍(霍等。, 2021;维布默等。, 2021). 理想的情况是，针对相关冠状病毒未来爆发的有效保护将包括广泛的中和作用，免疫系统识别冠状病毒物种之间共享的表位。一项研究表明，从未接触过SARS-CoV-2的幼稚患者，其T细胞亚群可以与普通感冒冠状病毒和SARS-CoV-2共享的同源表位发生交叉反应，这一研究支持了提高广泛抗体反应的前景(马特乌斯等。, 2020). 在这种情况下，我们注意到ET排名反映了系统发育树上的同源性程度，因此我们推断，将ET得分加总到确定的T细胞表位长度上可能能够估计其交叉反应的潜力。

作为第一步，我们总结了40个SARS-CoV-2表位中每一个表位的ET等级，这些表位已被证明与患者源性T细胞反应，因此可以通过预测与Mateus检测的161个常见感冒冠状病毒表位的交叉反应性来对其进行排名等。尽管ET等级相加可以确定SARS-CoV-2表位，但这些表位更有可能是交叉反应的(补充图S8)，它没有解释潜在交叉反应同源物中的特定氨基酸差异。换言之，ET等级可以预测严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型表位通常是否会发生交叉反应，但不能预测哪些表位同源物会发生交叉反应。

为了提高我们对特定表位同源物预测的分辨率，我们接下来将突变影响预测因子EA与ET总排名相结合。EA计算氨基酸变异对蛋白质功能的预测影响，帮助解释编码变异(Katsonis和Lichtarge，2014年). 对SARS-CoV-2表位和另一种病毒（sumEA）中同源表位之间氨基酸变化的预测影响进行汇总，同时调整SARS-CoV-2表位的整体进化重要性[总和（100-ET排名）]，得出了一个能够将交叉反应表位与未发生交叉反应的表位分开的指标(图4B,补充图S8,补充数据集S8). 然后将该指标sumEA/sum（100-ET排名）应用于21个未经测试的SARS-CoV-2 T细胞表位及其常见的感冒同源物(马特乌斯等。, 2020). 从总共92个同源物中，我们鉴定出23个可能与5个SARS-CoV-2表位之一发生交叉反应(图4C,补充数据集S9). 这5个SARS-CoV-2表位以及其他9个经实验证明具有交叉反应性的表位可用于多针孔疫苗接种策略，该策略可对当前流行的冠状病毒SARS-CoV-2以及可能的未来疫情提供广泛的中和反应。在这项分析之后，进一步证实了Spike蛋白的815–825残基构成了新生儿和新冠肺炎患者中最常见的表位(施罗克等。, 2020). ET特别强调了这11个残基是进化上特别保守的氨基酸，因此我们的指标预测了Mateus研究中使用的15个氨基酸长表位的交叉反应性等。这一结果和我们方法的普遍性表明，在其他病原体家族中可以快速识别出高度交叉反应的表位。

4讨论

在应对SARS-CoV-2大流行方面取得了迅速进展；从测序到结构测定，以及药物和疫苗开发(Jeong（郑）等。, 2020;锂等。, 2020;彭等。, 2020;桑德斯等。, 2020;吴等。, 2020). 在这里，我们利用冠状病毒系统发育学、序列和结构信息，提供了一个功能图，其中的位点不仅在冠状病毒家族中是稳定的，而且对当前大流行的突变也是稳定的。这些位点是泛冠状病毒/β冠状病毒治疗的首选战略靶点，它们不太可能受到SARS-CoV-2变异体快速出现耐药性的影响。除了集中进行治疗研究外，本文提供的数据还可以指导旨在确定成功治疗的作用机制的定向突变研究，不仅在当前疫情的背景下，而且在未来的冠状病毒疫情中。

这项研究有局限性。我们结果的质量取决于可用同源序列的数量和范围，一些SARS-CoV-2蛋白如NSP1和辅助蛋白没有达到显著水平z（z）-得分或在最终排列中有许多不同的序列。无法恢复更多的序列信息可能是因为这些蛋白质的进化速率较高，这限制了我们识别具有很少序列一致性的远亲同源物的能力。更有可能的是，这些外周基因最近通过冠状病毒家族中发生的频繁重组事件被招募(苏等。, 2016).

在NSP3蛋白的结构域水平上出现了等效的基因招募，其结构域数量可变（10–16），其中一些结构域是含有SARS-CoV和SARS-CoV-2的β冠状病毒b分支所特有的。因此，毫不奇怪，全长NSP3的初始比对和相应的ET排名受到差异较小的PL的严重影响^{赞成的意见}冠状病毒分支和家族中存在的结构域。NSP3的区域特异性分析大大提高了返回序列的数量、系统发育覆盖率和ET结果的分辨率。这表明未来的工作应该包括对多域蛋白的域特异性分析。这样的分析很可能提供ET排名，以确定各个域的重要功能位点，而全长分析可以提供对特定域如何在系统发育树的特定分支中被招募的见解。

其他几个研究小组已专注于实验筛选临床阶段或FDA批准的小分子，以期确定SARS-CoV-2治疗药物并重新调整其用途。然而，最热门的药物疗效可能是细胞系特异性的(霍夫曼等。, 2020)药物作用机制尚不清楚，或通过调节组织培养细胞发挥作用。在电子对接研究中(德什潘德等。, 2020;古普塔等。2020亿)针对特定SARS-CoV-2位点采取更具针对性的方法，并受益于配体结合位点的知识。虽然SARS-CoV-2蛋白的结构特征是前所未有的，但现有的结构信息还远远不够全面。为了弥合这些知识差距，我们确定了具有低ET排名和当前疫情中缺乏突变的表面残基3D簇作为潜在药物靶点。许多变异体调整的3D位点对应于配体结合的活性位点，但其他位点映射到尚未完全表征的进化重要位点。这些变异调整位点是假定的药物靶点，可以将对接研究引导到目前可用的结构信息中无法立即显现的位点。

用ET分析的序列的系统发育树的深度可以预测药物在多大程度上抑制不同物种的同源物。例如，NSP12的活性位点在RNA病毒的深层系统发育树中是保守的，靶向它的抑制剂雷德西韦（remdesivir）对SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS和远相关的埃博拉RNA病毒有效(德威特等。, 2020;伊士曼等。, 2020). 同样，大多数其他NSP和结构M（膜）和N（核衣壳）蛋白具有深层RNA病毒系统发育，靶向它们可以提供广泛有效的抑制剂。最明显的候选者是与NSP12、NSP13、NSP14和16的配体结合位点重叠的变体调节的3D位点。我们的分析揭示了一个不太明显的药物靶点，包括N蛋白N末端结构域上的一个假定RNA结合位点(康等。, 2020). HCoV-OC43的N蛋白中的等效位点被化合物PJ34靶向，在那里它抑制RNA结合活性和病毒复制(林等。, 2014;彭等。, 2020). 相反，另一种抑制剂（5-苄氧基gramine）诱导MERS-CoV N蛋白聚集并显示出对抗该病毒的强大抗病毒活性(林等。, 2020)，结合两个疏水性口袋。然而，这些囊袋在当前SARS-CoV-2疫情中发生了变化，这表明针对这些地区的化合物更有可能对耐药SARS-CoV-2变异体敏感。

与上述主要由RNA病毒序列组成的深层系统发育不同，NSP3的ADP核糖磷酸酶亚结构域具有一个系统发育树，在跨越三个生命域的众多序列中，冠状病毒序列很少。靶向该结构域的药物可以抑制冠状病毒感染，但也可以抑制宿主ADP核糖磷酸酶。ADP核糖磷酸酶抑制剂已被开发用于癌症治疗，其应用于SARS-CoV-2治疗是有保证的(卡萨布等。, 2020)但应注意确保不必要的副作用不会掩盖作为病毒抑制剂的任何益处。

除小分子病毒抑制剂外，利用进化信息还可以指导针对新冠肺炎的免疫治疗药物的开发。我们对SARS-CoV-2 T细胞表位进行了进化分析，该表位能够与其他人类冠状病毒中的同源肽发生交叉反应(勒伯特等。, 2020;马特乌斯等。, 2020). 这就产生了一个新的指标sumEA/sum（100-ET排名），它可以更好地预测哪些表位将发生交叉反应。一般来说，交叉反应表位的知识可以为多瘤疫苗的开发工作提供信息，从而引导免疫系统产生广泛的中和反应。

S蛋白进化为结合不同受体(Fehr和Perlman，2015年)表明结合位点的高变异率是由于这种适应性功能和宿主的适应性免疫系统的回避。虽然目前有几种疫苗和单克隆抗体在使用，但新菌株正在迅速出现(法里亚等。, 2021;佛罗伦萨等。, 2021;兰伯特等。, 2020;特加利等。, 2020)并显示出逃避现有治疗的迹象(维布默等。, 2021;吴等。, 2021). 这些菌株中最令人担忧的两个突变发生在S蛋白受体结合域的N501和E484。这些残基的ET等级分别为96和95.8，表明冠状病毒家族中发生了特别迅速的系统发育变化，并代表了针对新出现的SARS-CoV-2变异体仍有效的治疗药物的不良靶点。尽管S蛋白具有变异性，但我们确定了一个相对保守的位点(图2D)对应于S2'裂解位点附近的融合肽(马杜等。, 2009)这也是幼稚和新冠肺炎患者中交叉反应最强的表位(施罗克等。, 2020) (图4C). 当考虑到靶向严重急性呼吸系统综合征冠状病毒中等效区域的5H10人单克隆抗体在预防疾病a方面非常有效时，这个位点特别有吸引力恒河猴感染模型(Miyoshi-Akiyama先生等。, 2011). 新菌株的出现很可能需要额外的疫苗和单克隆抗体开发。我们认为，靶向与S2’裂解位点和融合肽区域以及我们研究强调的其他位点相对应的SARS-CoV-2经变异调整的线性ET位点，可以提供不太容易出现耐药变异的保护。

本研究受当前大流行的推动，并使用进化序列信息指导新冠肺炎治疗药物的开发。虽然我们目前正处于新冠肺炎疫情的控制之下，但此次大流行之前曾发生过SARS和MERS疫情，预计相关冠状病毒将在未来引发疫情。虽然本研究的重点是SARS-CoV-2，但它利用了从整个冠状病毒家族中获取的序列信息，因此该发现可扩展到其他冠状病毒物种，包括尚未遇到的物种。事实上，我们提供的工具可以应用于任何病原体家族。将大流行病毒置于相关病毒的进化环境中，可以揭示管理恢复的途径，并可能提供涵盖未来疫情的治疗方法。

数据可用性

可以从交互式网页查看和访问此处显示的数据和分析(http://cov.lichtargelab.org)和中补充材料.

基金

这项工作得到了国家情报局局长办公室（ODNI）的支持，情报高级研究项目活动（IARPA）根据BAA-17-01[合同编号2019-19071900001 to O.L.]。本文所含观点和结论均为作者的观点和结论，不应被解释为必然代表ODNI、IARPA或美国政府明示或暗示的官方政策。美国政府有权出于政府目的复制和分发重印本，尽管其中有任何版权注释。这项工作还得到了国家科学基金会[DBI-2032904 to O.L.]、奥斯卡·费舍尔基金会和国家卫生研究院[GM079656、GM066099和AG061105 to O.L]的支持。

利益冲突：未声明。

工具书类

作者注释