有机磷降解酶的进化：自然进化与定向进化的比较

摘要

有机磷降解酶放射根杆菌P230（OPDA）是最近发现的一种降解多种有机磷酸盐的酶。它与首次从缩小假单胞菌尽管OPH和OPDA具有高度的序列一致性，但它们表现出不同的底物特异性。我们在这里报告了OPDA的结构，并确定了可能使其优先选择具有较短烷基取代基的底物的蛋白质区域。定向进化用于进化一系列具有类似OPDA活性的OPH突变体。根据突变体降解大量底物的能力选择突变体。突变倾向于聚集在蛋白质的特定区域，在大多数情况下，这些区域是OPH和OPDA序列有显著差异的区域。

介绍

有机磷形成了一大类化合物，在最近的进化时期出现在环境中。尽管有机磷酸盐对高等生物有毒，但它是细菌丰富的营养来源，最近从一种细菌中分离出一种能够降解有机磷的酶放射根杆菌应变，应变(霍恩等., 2002). 有机磷降解酶A.放射杆菌（OPDA）的序列与来自缩小假单胞菌MG和黄杆菌属例如ATCC 27551。后者被称为磷酸三酯酶、有机磷水解酶、有机磷酸盐降解酶或对硫磷水解蛋白酶。尽管序列高度相似，但这两种酶在底物特异性方面表现出差异，表明存在进化流动状态。在本研究中，我们使用结构和分子技术来更好地了解这两种磷酸三酯酶的催化特性和进化关系。

已经做了大量工作来表征OPH的结构和功能(Raushel，2002年). 它具有与其他酶相关的结构和活性位点，但它对磷酸三酯具有特异性作用。OPH折叠成“TIM”桶，（αβ）₈，双核金属结合位点位于桶的C末端。它是一个含金属酰胺水解酶超家族之一(霍姆和桑德，1997年). 晶体结构也适用的其他家族成员包括脲酶(贾布里语等., 1995)，二氢果糖酶(托登等., 2001)和腺苷脱氨酶(Wilson和Quiocho，1993年). 与OPH一样，超家族中的大多数其他酶在活性部位都含有两种金属。已经检测了在各种金属存在下的OPH的活性，其中Co的活性最高²⁺.用锌测定了OPH的结构²⁺，镉²⁺，锰²⁺和锌²⁺/镉²⁺在活动站点中(本宁等., 2001)以及载脂酶(本宁等., 1994). 这种酶作用于多种底物。一些基板以接近扩散的速度翻转，而其他基板则以较温和的速度进行处理。用抑制剂4-甲基苄基膦酸二乙酯、甲基膦酸二异丙酯和磷酸三乙酯获得了OPH的结构(范胡克等., 1996). 这些抑制剂是底物类似物，结合在酶的活性部位，清楚地指示蛋白质如何结合底物。已确定容纳磷酸取代基的口袋。劳希尔及其同事(Chen-Goodspeed公司等2001年)已经表明，立体选择性取决于被称为小、大和离去基团子位点的三个口袋的大小。此外，他们还表明，立体选择性可以通过同时改变三个子网站的大小来增强、放松或逆转(Chen-Goodspeed公司等2001年b月). 结构和动力学研究允许提出一种似是而非的酶机制；它包括一个单一的串联位移攻击(S公司_N个2) (刘易斯等., 1988)金属桥氢离子作为亲核剂(本宁等., 2000).

OPDA和OPH的序列在氨基酸水平上相似，同源性为90%(霍恩等., 2002). 这两种蛋白质之间最显著的差异是在OPDA具有额外20个残基的C末端。其余的序列差异发生在整个蛋白质中，其中一些位于活性位点。这些序列差异被认为是OPH和OPDA底物特异性差异的原因；OPDA表现更高k个_猫具有较短侧链且可水解OPH无活性的倍硫磷和磷的底物的值(霍恩等., 2002).

鉴于磷酸三酯酶在杀虫剂和神经毒剂（如沙林、梭曼和VX）的生物修复中的潜在用途，已经开展了大量工作来了解机制和底物结合决定因素的性质。这些酶在促进生物修复方面的效用已通过实验证明，OPH已表达在大肠杆菌细胞并固定在无纺布聚丙烯织物上，用于污染废水的解毒(穆尔昌达尼等., 1999). 然而，生物修复的进一步进展可能取决于新酶的鉴定或根据特定要求调整已知酶。因此，了解大自然如何修饰酶，从而在底物特异性和催化性能方面带来细微变化，是一件很有意义的事情。为此，我们报道了OPDA的结构测定，并评论了OPH和OPDA底物特异性差异的结构基础。此外，我们报告了OPH定向进化的结果。其他工人(赵等., 2002)还将定向进化应用于OPH；然而，选择方法和结果与这里描述的不同。在我们的实验中，根据OPH突变体降解甲基对硫磷、甲基对氧磷和古马磷-o-类似物的能力进行筛选（图1). coumaphos-o-alogue含有二乙基取代基，而其他的含有二甲基取代基。我们的选择产生了突变体，对含有二乙基或二甲基取代基的底物显示出改进的催化效率。为了测试进化酶降解选择过程中使用的化合物以外的化合物的能力，测试了突变蛋白降解含有二乙基取代基的化合物demeton S的能力。应该注意的是，进化实验中使用的底物都是由OPDA比OPH更快地处理的。OPH的一些进化突变体具有与OPDA类似的活性。我们评论了OPH和OPDA之间的序列差异，并将这些差异与定向进化带来的序列变化进行了比较。实际上，我们比较了定向进化和自然进化带来的变化。

材料和方法

材料

杀虫剂从化学服务处购买。分子生物学试剂和酶是从罗氏或斯特拉赫纳购买的。底漆（表一)从Geneworks获得。QIAGEN DNA纯化试剂盒用于所有DNA纯化，除非另有说明。

菌种和生长条件

这个大肠杆菌菌株DH5α用于所述工作的所有方面。细胞在30°C下生长。细胞系保存在添加100μg/ml氨苄西林的LB琼脂平板上。用于生产纯化蛋白质的培养物生长在补充有1 mM CoCl的TB培养基中₂.6小时₂O和100μg/ml氨苄西林，并在200 rpm下摇晃。突变文库最初生长在含有1–4μM coumaphos-o-类似物的LB琼脂平板上(哈考特等., 2002)，称为指示板。在添加100μg/ml氨苄西林的LB培养基中培养潜在阳性突变体，将其置于96个平板中，并以100 rpm的速度摇晃，或在试验管中摇晃并以200 rpm的速度晃动。

pCY76的构建

质粒pCY76(标准⁺，等等⁺，lacZpo，T710^轮胎+)构建用于在大肠杆菌.热诱导蛋白过表达质粒pND706(爱等., 1996)，使用上海I释放出一个130 bp的片段，该片段包含10翻译起始区域(T7⁄10^轮胎)核糖体结合位点（RBS）和多克隆盒DNA片段（MCS）。这个T7⁄10^提尔–RBS–MCS片段被钝化Pfu公司DNA聚合酶，然后亚克隆到普夫DNA聚合酶钝化巴姆HI（高）/千磅pMTL22P的I位置（腔室等1998年），形成pCY76。

OPDA的表达、纯化、结晶及结构测定

表达式。opdA公司

使用PCR从4kbHin公司pBluescript KS+中的dIII片段从农杆菌属基因组(霍恩等., 2002). 引物P3和P4用于分离运算放大器.PCR产物受到限制Nde公司我和生态RI连接成pCY76，然后用于转化活性细胞。这个opdA公司随后的克隆pSY1的序列通过DNA测序得到确认。决赛opdA公司本研究中使用的编码341个氨基酸残基（25–365；OPH数）。删除假定的信号肽（氨基酸残基1–24），并添加新的起始密码子（氨基酸残端25）。此外，删除碱基1089（胞嘧啶）以创建与OPH同源的C末端；实际上，氨基酸残基366–385从wt OPDA中删除。

净化。

OPDA通过格里姆斯利描述的改良程序进行纯化等. (格里姆斯利等1997年). 净化缓冲液中未添加任何金属。DH5αpSY1培养40 h，然后收集细胞并将其重新悬浮在pH 8.0的50 mM HEPES缓冲液中。细胞被法国出版社破坏。将可溶性部分以1 ml/min的速度加载到DEAE分形凝胶柱上。OPDA通过柱。在DEAE分形凝胶柱后，OPH和OPDA之间的差异变得明显；OPDA在透析过程中与磷酸盐缓冲液发生沉淀。由于这个问题，在50 mM HEPES pH值为7.0的条件下，通过透析将含有OPDA的流通液的pH值降至7.0。将OPDA加载到已与透析液平衡的SP-Sepharose柱上。结合OPDA用～150 mM NaCl以线性梯度洗脱。洗脱的OPDA的SDS–PAGE分析显示纯度>95%。通过超滤将OPDA浓缩至8.3 mg/ml进行结晶。结晶用蛋白质储存在50 mM HEPES中，pH 7.0，150 mM NaCl。蛋白质浓度通过280 nm处的紫外吸收测定。OPDA的消光系数计算为29 280 M⁻¹厘米⁻¹OPDA的产量为～40 mg/l培养液。

OPDA晶体。

通过悬挂液滴的蒸汽扩散形成晶体。内部数据集的晶体由5μl蛋白质溶液和5μl储液罐溶液的混合物开始，储液罐由20%聚乙二醇4000、0.1 M柠檬酸钠和0.2 M醋酸铵组成。同步加速器数据集的晶体是从5μl蛋白质溶液的混合物中开始的，该蛋白质溶液是在含有1 mM CoCl的溶液中透析的₂.6小时₂O、 50 mM HEPES和150 mM NaCl，以及5μl由10%PEG 4000和0.03 M NaH组成的储液罐溶液₂人事军官₄.

数据收集和结构确定。

在收集数据之前，将晶体转移到冷冻缓冲液中过夜。冷冻缓冲液与结晶缓冲液相同，PEG 4000浓度提高到30%。数据是从两个晶体中收集的，这两个晶体在氮气流中闪蒸冷却至–173°C。内部数据集的采集分辨率为2.5º，同步加速器数据集的收集分辨率为1.8º。使用DENZO和SCALEPACK程序处理和缩放数据(Otwinowski和Minor，1997年). 合并统计见表二。点组确定为P（P）321，带V（V）_米(马修斯，1968年)2.9奥^三/Da表示每个不对称单元的单个分子。使用AMoRe程序通过分子替换从内部数据集中获得初始阶段(纳瓦扎，1994年)在CCP4系列计划中实施(1994年第4号合作计算项目). PDB条目1hzy.PDB中OPH单体的原子坐标(本宁等., 2001)被用作搜索模型。使用25到2.3°之间的X射线数据项和23°的Patterson球体进行旋转函数搜索得到的正确解的相关系数（cc）为23.6。最接近的错误解决方案的cc为10.7。转换函数将空间组标识为P（P）三₁21和最好的解决方案有一个cc和R（右）-系数分别为71.5和0.373。最好的错误解决方案有cc和R（右）-系数分别为32.9和0.555。AMoRE的刚性车身改进进一步将cc提高到75.7R（右）-系数为0.373。在图形终端上检查时，模型显示出良好的封装几何结构。

使用CNS程序进一步完善了一个模型，其中纳入了OPDA和OPH之间的序列变化(布伦格等., 1998). 出于交叉验证目的，从细化计算中排除了5%数据的测试集。扭角动力学模拟退火、位置最小化和个体温度因子细化的循环与手动重建和自动溶剂放置交织在一起。这些是使用标准CNS精炼协议执行的。

使用的初始模型在活性位点中没有金属或水分子，在位置169处有未修饰的赖氨酸残基。西格玛(里德，1986年)差异电子密度图（2毫发_o（o）–DF公司_c,毫发_o（o）–DF公司_c)表明存在两种金属离子，一种是CO₂基团和活性部位的两个水分子。紧邻Lys169的密度与通过羧基化进行的共价修饰一致。这也见于OPH和含有双核金属中心的酰胺水解酶超家族的其他成员[尿素酶（Jabri等.，1985），二氢orotase(托登等., 2001)]但不适用于存在单一金属的家庭成员，如腺苷脱氨酶（威尔逊等., 1993). 然而，值得注意的是，当在完全占据的情况下引入模型时，羧基部分的温度因子被细化到显著高于与其协调的原子的值。生产占用率为0.4B-与相邻原子大小相似的因子（～34º²). 结合金属的特性未知，可能的候选金属包括二价阳离子Mg²⁺，锰²⁺，公司²⁺，镍²⁺，锌²⁺和Cd²⁺.合理B-用两种镁获得了因子和差异图²⁺占用1.0和Co²⁺占地面积0.4。对于上述任何其他四级离子物种，也可以获得类似的值，但钴²⁺之所以使用该蛋白，是因为该蛋白在1 mM Co存在下生长的细菌中表达²⁺.鉴于CO₂羧基化赖氨酸基团和金属离子被证明是相互稳定的(Shim和Raushel，2000年)，很容易考虑后者。键残基Arg254显示其侧链的两种替代构象，占有率分别为0.4和0.6，这进一步证明了这一点。第二个数据集是在高级光子源的BioCARS光束线BM14D处采集的。蛋白质已在1 mM Co溶液中透析²⁺在结晶之前。从内部数据中获得的模型被用作使用同步加速器数据进行细化的初始模型。排除了相同的测试反射，再加上来自更高分辨率外壳的5%的数据。再次使用标准CNS协议进行改进。得到的模型用两个Co进行了很好的细化²⁺活性位点中的离子完全占据并且只有Arg254侧链的单一构象。

OPH的定向进化及突变蛋白的动力学分析

易出错PCR。

使用的易出错PCR协议修改自Chen和Arnold（1993）PCR反应混合物包括200μM dNTPs、5U Taq DNA聚合酶、1μM引物P1和P2、10 ng DNA模板（pJK33）（Mulbury和Karns，1989）、5 mM MgCl₂，0.07μlβ-巯基乙醇，5μl二甲基亚砜，250μM氯化锰₂，10μl 10×Taq DNA聚合酶缓冲液和蒸馏H₂O至最终体积100μl。通过测序确定每个基因的突变率为1-2个氨基酸变化操作程序设计每轮筛选20个随机克隆。这个生态里/巴姆将HI消化的PCR产物凝胶提取，连接到pUC19，然后用于转化活性细胞。将转化细胞置于指示板上。

DNA重组。操作程序设计

突变体基本上按照描述进行了洗牌(Stemmer，1994年). 结果部分描述了洗牌基因。使用了引物P1和P2。洗牌后的基因被克隆到生态里/巴姆pUC19的HI位点，然后用于转化活性细胞。将转化细胞置于指示板上。

定点突变。操作程序设计

H254R是根据制造商的指示使用QuikChange协议制造的（Stratagene）。模板为pJK33。引物为P5和P6。操作程序设计对来自转化子的H254R进行测序，以确认存在H254R突变，而没有其他突变。

筛选。

用无菌牙签采摘荧光显著的菌落，并以96周的平板格式生长。然后对过夜培养物进行降解三种杀虫剂的能力分析。这是通过将每种培养物的10–30μl等分样品添加到包含80μl反应混合物的三个96 well板的相应孔中来实现的。反应混合物由溶解在含有8%甲醇的100 mM Tris–HCl（pH 7.0）中的0.01 mM香豆素、溶解在含有10%甲醇的100 mM磷酸钠（pH 8.0）中的1.5 mM甲基对硫磷或溶解在含有10%甲醇的100 mM磷酸钠（pH 8.0）中的0.4 mM甲基对硫磷组成。用POLARstar荧光计监测与coumaphos-o-类似物的反应(哈考特等., 2002)以及使用Labsystems Multiskan UV/Vis分光光度计在400 nm处与甲基对硫磷和甲基对氧磷反应。活动是通过数据点从最佳拟合线的斜率中获取的。从以96孔板型生长的单个菌落中，然后在试管中重新测试表现出最高活性的克隆。与之前一样，这些细胞的活性得到了确认，并制备了甘油储备。

OPH净化。

用于表达和纯化OPH的方法以及用于动力学测量的突变变异体是根据以下描述修改的格里姆斯利等.(1997)在OPH或OPDA制剂中，没有向纯化缓冲液中添加金属。将可溶性细胞裂解液通过DEAE分形凝胶柱，然后制备OPH用于阳离子交换色谱，如参考文献所示。将含有OPH的组分合并，通过超滤浓缩至约2 mg/ml，然后在-20°C下与30%甘油一起储存。洗脱的OPH的SDS-PAGE分析显示纯度>95%。蛋白质浓度通过280 nm处的紫外吸收测定。OPH和OPH突变蛋白的消光系数计算为29160M⁻¹厘米⁻¹.

动力学分析。

结果和讨论

结构的质量

表达并纯化了OPDA的可溶性部分减去C末端延伸，并使用OPH结构作为搜索模型获得了其结构。用于描述OPDA的编号方案是OPH的编号方案。两种模型的细化统计数据如表II所示.立体化学由程序PROCHECK检查(拉斯科夫斯基等., 1993)和WHATCHECK(发动机罩等., 1996). Ramachandran图显示，除Glu159和Ser61位于慷慨允许的区域外，所有残留物均位于最有利区域或额外允许的区域。Glu159是所有已知磷酸三酯酶结构的Ramachandran图中的异常值。在PROCHECK进行的测试中，所有立体化学参数均在正常范围内或优于预期。总体G公司-两种模型的因子均为+0.4。

总体结构

如图2所示，OPDA的整体结构与OPH非常相似。两种分子形成二聚体，其亚基通过基本相同的晶体学双轴相关。将剩余物35–361的所有主链原子重叠，导致均方根位移为0.38º。TIM桶区域覆盖非常好（均方根位移0.27°）。次要结构元件的一些小的刚体运动可以在远离炮管的位置看到，但这些运动仍仅为1º。二级结构与OPH基本相同，由10个β链、14个α螺旋和4个3₁₀螺旋形转弯。活性位点位于桶的C末端，由序列空间中不同的次级结构元素的残留物组成。枪管底部有许多螺旋。在OPH中，其中一个螺旋形成苯乙醇结合囊的一侧。两个opda模型的结构相互重叠。结构表现出极好的一致性；所有蛋白质原子的均方根位移为0.2℃。然而，随着金属离子占有率的变化和Arg254的相关构象变化，某些关键活性位点残基中的侧链构象存在差异。残基Tyr257、Phe272、Leu271、Leu303和Ser203发生了显著变化（～1μ）。其中前三个位于大装订袋亚位点，Leu303位于小装订袋子位点。同步加速器数据集还显示了活性位点中额外的+fofc密度。密度与HEPES分子在多种构象中的结合一致。磺酸盐部分在完全占据时看起来很有序，但剩余的密度被破坏，并与多个构象相一致。从杂化合物的HIC-UP数据库中找到一个单一的亚硫酸盐离子，并将其包含在改进的模型中。

活性部位和金属结扎

根据内部数据得出的模型表明²⁺α和β离子的配位方式与Zn类似²⁺OPH活性部位的离子。α金属与His55、His57和Asp301形成键，比与His201和His230形成配位键的β金属埋得更深。此外，这两种金属通过桥接氢氧化物离子和羧基化Lys169的侧链氧连接。α金属具有三角双锥配位，而β表现出扭曲的三角双锥配合（图3). 在由同步加速器数据导出的模型中，亚硫酸盐离子与其一个氧原子结合，取代了另一个模型中的桥联氢氧化离子。图3还显示了相邻残基在两个数据集之间变化的两个构象的位置。还显示了取自1eyw.pdb的底物类似物磷酸三甲酯的叠加。

OPH结构中观察到的底物结合囊与OPDA中发现的类似。离开基团的亚网站由Trp131、Phe132、Phe 306和Tyr309形成。这些残基在这两种蛋白质中的位置相似。底物的烷基取代基由两个称为“小”和“大”子网站的口袋容纳。小亚网站是由残基Gly60、Ile106、Leu303和Ser308形成的。这些残基与口袋的大小和形状一样保存在两种蛋白质中。大型子岩由Arg254、Tyr257、Leu271和Met317的侧链形成。残留物Arg254显示了内部数据得出的模型中侧链的静态紊乱。占据率为0.4的一个方向与催化活性水分子（或氢氧化物离子）之间的距离为3.3º，该分子桥接两个金属离子。另一个取向通过与Asp301的OD1原子的2.5Å氢键稳定，并且靠近Tyr257侧链的环，从而允许环的π-电子和精氨酸的胍基电荷之间的相互作用。OPH在位置254和257处不同；等效残留物为His254和His257。这两个序列差异的结果是这个口袋的大小总体上减少了。这种亚包和不同侧链的大小的减少可以解释这两种酶的底物特异性的一些差异。例如，OPDA处理甲基对硫磷的效率远高于二乙基当量，而这两种化合物由OPH以类似的方式处理(霍恩等., 2002). 为了更好地了解底物如何结合在活性部位，OPDA被用结合抑制剂叠加在OPH的结构上。值得注意的是，当底物类似物磷酸三乙酯的结构根据结构1eyw.pdb活性位点残基的最小二乘法最小化旋转到OPDA活性位点时，Arg254很好地与磷酸氧O3结合。Arg254的NH2原子从磷酸三乙酯的O3中为3.8º，从催化氢氧化物（W500）中为3.3º。Arg254侧链与催化水分子和模型底物的氧非常接近，这表明该残留物具有重要作用。更重要的是，OPDA的Tyr257与与OPH（1dmp.pdb）结合的二乙基4-甲基苄基膦酸盐抑制剂的苄基原子紧密接触，同时进行类似旋转。显然，适合OPH活性位点的群体在与OPDA相互作用时会遇到空间位阻。

OPH和OPDA序列差异的结构后果。

OPH和OPDA之间约有30个序列差异（图4). 最大的基团由19个残基组成，分布在分子的溶剂暴露表面。此外，该分子的两个区域具有显著的序列差异。其中一个已经提到；活动站点的大口袋。另一个是负责结合OPH中苯乙醇的蛋白质区域。该化合物类似于OPH的反应产物之一，可能会结合在活性部位并起到抑制剂的作用。与此相反，苯乙醇与对面分子外部的OPH结合，并从活性位点空腔中移除。在OPH中，该位点由残基Met293、Lys294、Glu295和Thr352形成，这些残基在OPDA中成为Lys293、Asp294、Arg295和Ala352。除了序列变化外，这两种蛋白质在该区域的水结构也不同。鉴于这些显著差异，苯乙醇不太可能在同一位置与OPDA结合。

opd基因的定向进化

定向进化实验的目的是在OPH中发现一系列突变，使其具有与OPDA类似的活性。进化的起点是OPH蛋白的一种形式，它有来自于融合到N末端的β-半乳糖苷酶的五个额外残基。OPH基因经过一个周期的随机突变，然后进行两个周期的基因洗牌。作为每个周期的一部分，分两个阶段选择突变体。在第一阶段，在琼脂平板上监测突变体对coumaphos-o-analogue的活性，而在第二阶段，用96-well平板阅读器更仔细地测量突变体对三种底物（coumapos-o-anallogue、甲基对氧磷和甲基对硫磷）的活性。

易出错PCR用于创建一个文库，该文库最初在含有4μM coumaphos-o-analogue的平板上进行筛选。该图书馆产生了约20000个菌落，其中约80%的菌落几乎没有活性。每个文库中大约1600个菌落显示出与野生型酶相同或更好的荧光。然后使用96 well平板阅读器测量这些克隆降解三种底物的能力。共有48个潜在阳性克隆用于第一轮DNA洗牌。在含有2μM coumaphos-o-类似物的LB培养基平板上筛选出约10000个克隆。根据它们的荧光信号，用平板阅读器测量了800个克隆对三种底物的活性。其中，62个克隆被重新筛选为潜在的阳性变异体，其中30个活性高于野生型的克隆被选为另一轮洗牌。测定了三种具有增强活性的蛋白质的基因序列。所有三种都包含H254R的变化以及其他变化。再进行一轮DNA重组，从第一轮重组中选出30个最佳克隆。在这个洗牌周期中，在含有2μM coumaphos-o-类似物的LB培养基平板上筛选出10000个克隆。测量了800个克隆对三种底物的活性。其中，51个克隆被重新筛选为潜在的阳性变体，其中20个克隆用于制备蛋白质以进行动力学表征。

进化OPH蛋白的动力学特征

对OPH的进化变体进行纯化，并用三种底物测量其动力学常数（表III). 从第一代（1G）中选择了一个突变体，从第三代（3G）中选择11个突变体。所有这些突变体的序列变化以及OPH和OPDA的相关动力学数据也在表III中给出所有蛋白质都显示出与coumaphos-o-类似的底物抑制作用K（K）_硅也进行了测量。由于蛋白质纯化方法和测定条件的不同，先前报道的OPH动力学常数有很大差异。的值k个_猫/K（K）_米本研究中给出的值低于报道的最高值，可能是由于分析条件的差异。然而，在整个研究过程中使用了相同的分析条件，并给出了OPH和OPDA相对活性的良好指示。

OPH和OPDA的动力学参数显示了本研究中使用的所有底物的一些趋势。这个K（K）_米OPDA和k个_猫都较高，所以特异性常数，k个_猫/K（K）_米OPDA显著高于。对于甲基对硫磷，这两种酶之间的差异在k个_猫/K（K）_米OPDA是比OPH大29倍的因子。对于coumaphos-o-类比，因子只有4。对于突变蛋白，用coumaphos-o-analogue获得的动力学参数显示出最清晰的趋势。1G3有k个_猫和K（K）_米值高于OPDA的值。在这种酶中，与OPH中一样，在254位有组氨酸。其他11种酶在254位有精氨酸，所有酶都有K（K）_米和k个_猫值低于OPDA的值。对于这11种酶，通过降低K（K）_米这似乎是以牺牲k个_猫.对于底物甲基对喹啉酮，同样的趋势似乎普遍适用；然而K（K）_米不太明显，在大多数情况下k个_猫值增加了，而不是减少了，就像coumaphos-o-analogue的情况一样。对于突变株3G33和3G39K（K）_米甲基哌嗪酮的值与OPH的值非常相似，其活性通过提高k个_猫对于甲基对硫磷K（K）_米用于OPH和OPDA。在这种情况下，OPH的突变体通过增加k个_猫和少量滴入K（K）_米.

第三代的所有突变体都含有H254R突变。然而，这种突变似乎只对用coumaphos-o-analogue获得的动力学参数有显著影响。突变往往会被保留下来，因为coumaphos-o-alogue是第一阶段筛选中使用的唯一底物。为了在筛选过程中存活下来，所有突变都必须具有增强的coumaphos-o-analogue活性。有了这种底物，H254R突变导致K（K）_米还有一次k个_猫.上门服务K（K）_米是可取的，并且似乎被第三代突变体所保留，而k个_猫是不受欢迎的，并且似乎会被额外的突变所补偿。

除了用于选择的底物外，还测试了突变蛋白降解demeton S的能力。如表III所示OPDA对该化合物的降解速度比OPH快，但两种酶对其的降解效率都不高。突变酶的催化性能显示出与其他底物类似的趋势。这个K（K）_米所有酶的值都很高，并且没有通过定向进化得到改善，并且通过增加k个_猫最好的酶（3G32）具有k个_猫/K（K）_米这与OPDA类似。demeton未用于选择过程，但被突变酶降解并提高了效率，这一事实表明，选择过程保持了OPH的广泛特异性。

结构方面的序列变化；自然和定向进化

定向进化被用于将OPH进化为一系列具有与OPDA类似催化特性的突变酶。表IV给出了在定向进化实验中改变的残基，以及OPDA中的相应残基。其中三个突变，包括最常见的（H254R），产生OPDA序列中的氨基酸，而一个突变产生OPH或OPDA中都没有的氨基酸。定向进化产生的突变似乎聚集在蛋白质的特定位置，如表IV所示并且最好根据它们在蛋白质中的位置进行讨论。

我们已经注意到，在活性部位内，从OPH到OPDA的大口袋有显著差异。其中一个变化，H254R，是通过定向进化获得的。值得注意的是，在OPDA中，Arg254似乎处于良好的位置，可以接触和稳定底物的磷酸氧，并经历与金属位置占用有关的构象变化。OPDA中Tyr257的存在减小了可用于底物烷基的囊的尺寸。Cho观察到H257Y变化等.在他们的定向进化实验中(赵等., 2002)，但在本研究中未发现。这与两组实验中使用的筛选标准一致。在前一种情况下，为突变体选择的筛选条件偏爱具有较小烷基链的底物，而在我们的情况下，多重选择标准确保突变体在具有乙基和甲基取代基的底物上具有活性。

第二组突变，I274T和N265D（图5)，发现于第7链之后的外露环中，该链支持较大的子位点残基His254和His257。这些突变提供了一个更亲水的序列，更适合于暴露的肽。在OPDA序列中发现了其中一个突变I274T，但在OPH和OPDA中，残基274附近的肽结构非常相似。仅根据结构证据，这两种突变都不会被认为是改变蛋白质活性的良好候选。然而，如表三所示有实验证据表明，在没有其他变化的情况下，这些突变之一I274T（克隆3G3）确实对活性产生影响。它所在的环路最高B-OPH和OPDA中任何肽的因子，表明它可能是可移动的。在OPH中，这个回路的结构发生了巨大的变化，当金属被去除时，它会部分地变得无序(本宁等., 1995)，再次支持循环是可移动的这一观点。这些突变可能会影响蛋白质的动力学和稳定性，并且可能不会改变结晶学测定的蛋白质的平均结构。这些突变可能通过表面环的动力学对蛋白质的酶活性产生影响。这种效应可能涉及Leu271或Phe272，其侧链伸入活性位点的大口袋中。当比较内部和同步加速器数据模型时，这些侧链的构象显示出运动。我们已经注意到，在位置272处发生的位点特异性改变改变了OPDA的底物特异性。

第三组突变，T352A、K294N和G348C（图5)发生在苯乙醇结合位点。其中一个突变T352A导致了从OPH到OPDA的相同序列变化。位于348位的残基在这两种蛋白质中都是保守的，其位置使得取代G348C将封闭OPH中的苯乙醇结合位点。294位的残基在OPH和OPDA中不同。K294N有效地缩短了该氨基酸的侧链，并允许其与苯乙醇结合位点中的水分子形成氢键，如OPDA所示。在苯乙醇结合位点，OPH和OPDA之间最显著的区别是水的结构（图6). 在OPDA中，有两个水分子在OPDA内形成氢键网络。OPH中的等效残基不能形成相同的氢键，但似乎可以通过苯乙醇的存在来稳定。自然进化和定向进化已经确定苯乙醇结合位点是可以改进的地方。从OPH到OPDA的自然进化引入了一系列残基，这些残基稳定水分子，而定向进化的效果可能是这样做（使用K294N），或者用半胱氨酸残基的粗大侧链占据缝隙（使用G348C）。在任何一种情况下，缝隙的空隙都会被占据，结合缝隙的结构也会得到稳定。这种稳定性如何影响活性位点的结构尚不清楚。有一个通过链8链接到活动站点的链接，链8包含Asp301，它已经被提到是活动站点中的一个关键元素。该残基在OPH和OPDA中的位置非常相似，定向进化产生的突变影响很小。

除了上一段中列出的三个突变外，K285R的变化发生在苯乙醇结合位点附近。赖氨酸突变为精氨酸产生的较大侧链将允许精氨酸的胍和残基339的酰胺氧之间形成氢键。这种氢键将连接并稳定形成结合位点的两个肽。

第四组突变包括Q211L、D208G和K185R（图5). 这些簇位于两个外螺旋之间的外表面，与苯乙醇结合位点一样，外螺旋距离活性位点有点远。其中两个突变，K185R和Q211L，在最初的随机突变过程中首次被检测到，并导致活性明显提高。OPH和OPDA在突变区域的序列和结构非常相似。Gln211与Ala176的主链形成氢键。这种相互作用在Q211L转换中会丢失。Asp208与Gly174的主链形成氢键，同样，这种相互作用在D208G转化中会丢失。K185R的转化允许氢键形成为Glu219或Glu181。前两个突变导致稳定结构的相互作用丢失，而第三个突变可能会增加稳定相互作用。

结论

鉴于OPH和OPDA的结构和序列，人们可以预测，将OPH进化为OPDA的最直接方法是改变活性位点大口袋中的残基。在这个口袋中OPH和OPDA之间的众多差异中，在定向突变体中只观察到H254R。在两轮洗牌后产生的所有最活跃的突变体中都发现了这种突变体。在OPDA中，Arg254可以很好地与底物相互作用，并可能对酶的催化性能产生重大影响。该残基被证明能够采用一种以上的构象，构象变化与形成基质结合囊的大亚位点的多个残基的侧链的运动有关。大口袋中的其他突变可能不会发生，因为OPH中的大口袋比OPDA更适合结合coumaphos-o-类似物的二乙基取代基。换言之，选择过程确定了大口袋中的一个突变，该突变提高了OPH的催化性能，同时保持其有效降解具有较大烷基取代基的底物的能力。尽管H254R突变在定向突变体中普遍存在，但在任何高活性克隆中均未发现单一突变。在关于定向进化的章节中指出，H254R与其他突变结合时的变化能够对活性产生明显的影响，特别是与coumaphos-o-analogue结合时。

我们在前一节中注意到，在远离活性位点的几个位置发现了突变。除了得出以下结论外，很难从机械上对这些变化进行合理化解释，即它们协同产生微小的结构变化，以增强底物结合或随后的催化转换的方式影响蛋白质的动力学和/或稳定性。

本研究的目的之一是比较自然进化和定向进化对OPH向OPDA进化的影响。在氨基酸序列变化方面，这两个过程有一些相似之处。在这两种情况下，都观察到H254R的变化。虽然这并不意外，但I274T和T352A的变化并没有预料到。就结构而言，自然进化和定向进化的突变位置非常相似。在自然进化和定向进化中，似乎在三个位点发现了突变。虽然活性位点的变化可以合理化，但表面环和苯乙醇结合位点的突变影响更难理解。这些区域的突变是在自然进化和定向进化中发现的，这一事实证明这些区域具有物理意义，值得进一步研究。虽然自然进化和定向进化之间的相似性令人惊讶，但应该指出，定向进化确实找到了增强自然进化中没有发生的活动的方法。这些突变，如D208G，再次远离活性位点。活性位点外的突变似乎增强了酶的活性，这一观察突显出酶的活性取决于许多因素，进化目标可以通过许多方式实现。

感谢Harry Tong和BioCARS光束线的支持人员在Advance Photon Source的数据采集过程中提供的支持。这项工作，包括使用BioCARS部门，得到了澳大利亚同步加速器研究项目的支持，该项目由澳大利亚联邦在主要国家研究设施项目下资助。APS的使用得到了美国能源部、基础能源科学和能源研究办公室的支持，合同编号为W-31-109-Eng-38。感谢ANU超级计算设施在其机器上给予的时间。

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